阅读说明：本技术 一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法 (Kit and method for detecting corpuscular protozoan spores in insects ) 是由 朱方容 黄深惠 黄旭华 李标 李韬 王霞 罗梅兰 蒋满贵 于 2020-08-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用流式细胞仪机械检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒,包括试剂盒和如下使用步骤：将荧光粉末溶解后得到荧光染色液置于试剂盒,试剂盒有昆虫微粒子原虫孢子染色液、还有浓度为标准孢子液、还带有能过滤40um物质的细胞过滤器；将样本研磨或稀释、加温使蛋白质沉淀、过滤,得到样本液；将样本液与荧光染色液混合后加入多孔板,并采用流式细胞仪检测；将样本液的检测结果与标准物检测结果比较,判定样本中是否含有微粒子原虫孢子。其具有检测准确度高,操作简单,效率高,改人工看镜为机械检测,材料和人工成本低的优势。(The invention discloses a kit for mechanically detecting corpuscular protozoan spores in insects by using a flow cytometer, which comprises the kit and the following use steps: dissolving the fluorescent powder to obtain a fluorescent staining solution, and placing the fluorescent staining solution into a kit, wherein the kit contains an insect microparticle protozoan spore staining solution, a standard spore solution and a cell filter capable of filtering 40um substances; grinding or diluting the sample, heating to precipitate protein, and filtering to obtain sample solution; mixing the sample solution and the fluorescent staining solution, adding the mixture into a porous plate, and detecting by using a flow cytometer; and comparing the detection result of the sample liquid with the detection result of the standard substance to judge whether the sample contains the corpuscular protozoan spores or not. The method has the advantages of high detection accuracy, simple operation, high efficiency, mechanical detection by changing manual observation, and low material and labor cost.)

一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物分子检测和检疫技术领域，更具体的说是涉及一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法。

背景技术

昆虫会感染微粒子原虫病，如家蚕微粒子原虫病、柞蚕微粒子原虫病、蓖麻蚕微粒子原虫病等。微粒子原虫是细胞内寄生的单细胞生物，其传染途径主要包括食下传染和胚种传染，其中通过寄主***物和尸体等污染而造成食下传染，而通过寄主的种胚传染到下一代称之为胚种传染。由于昆虫微粒子原虫病大都会胚种传染，故繁殖时要弄清是否带有微粒子原虫病，通过检疫从源头上杜绝微粒子原虫病。

为了检测昆虫样本是否带有微粒子原虫病或是否有感染微粒子原虫病的风险，目前采用的方式主要是100多年前巴斯得创立的家蚕微粒子原虫病的检验法，主要是依靠显微镜人工检测样本是否有成熟的微粒子原虫孢子来判断，用显微镜人工观察效率低，特异性差，且容易造成误判问题。另外还存在利用DNA检验技术进行简易，虽准确能解决误判问题，但没有解决机械检测问题，仍旧存在效率低、操作复杂，材料和人工成本高。

因此，提供一种新的机械检测一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法，其具有检测准确度高，操作简单，效率高，材料和人工成本低的优势。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒，包括盒身以及与所述盒身铰接的盒盖，所述盒身内通过瓶架固定有荧光染色液瓶和标准孢子液瓶，且所述盒身内固定有细胞过滤器；所述细胞过滤器的过滤网孔径为400目。

优选的，所述瓶架顶面向内形成凹槽，所述凹槽内安装有荧光染色液瓶和标准孢子液瓶，

优选的，所述细胞过滤器包括细胞过滤器顶部骨架、细胞过滤器底部骨架以及设置于所述细胞过滤器顶部骨架和所述细胞过滤器底部骨架之间的若干细胞过滤器连接柱，所述细胞过滤器顶部骨架和细胞过滤器底部骨架为圆环形结构，所述细胞过滤器连接柱之间和所述细胞过滤器底部骨架通过细胞过滤器过滤网封合。

本发明的提供的试剂盒的有益效果是：制备试剂盒解决了荧光粉难溶问题，配制操作简便，节省材料，提供专业的过滤设备，操作更为简单，容易推广应用。

本发明一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将荧光粉末溶解后得到荧光染色液，过滤后加入至权利要求1所述试剂盒中；

(2)将样本研磨或稀释后进行加热处理，使其中的蛋白质杂质沉淀，然后过滤，得到样本液；

(3)将样本液加入试剂盒中，混合均匀并置于黑暗中，并采用流式细胞仪检测；

(4)将样本液的检测结果与标准物检测结果比较，判定样本中是否含有微粒子原虫孢子。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明中公开的操作方法简单，自动化程度高，能实现机械检测，并且检测结果准确度高。

优选的，步骤(1)中所述荧光粉末为异硫氰酸，采用pH为7.8～9.0的磷酸盐缓冲溶液溶解所述荧光粉末，所述荧光染色液的浓度为0.1mg/mL～0.5mg/mL。

优选的，步骤(2)中向样本中加入质量浓度为0.5％的KOH或NaOH溶液进行稀释或研磨；所述加热的温度为65～70℃，时间为10～30min。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明中加入KOH或NaOH溶液进行研磨，可以除去脂肪球，避免脂肪球干扰检测结果；经过加热可以使蛋白质变性沉淀，从而经过过滤可以除去蛋白质。

优选的，所述过滤采用35-45μm滤网或移液管吸头滤芯过滤，可去除非微粒子孢子小于过滤网孔径的杂物，如细菌等。

优选的，步骤(3)中样本液与荧光染色液的容量比是4：1，混合后在黑暗中处理的时间为25-30min。

优选的，步骤(3)中检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm。其中，利用流式细胞仪检测和分析前向角散射(FSC)、侧角散射(SSC)和荧光发射信息，得到定性和定量的结果。通过设定对照标准物包含外形、长径、短径、内有极丝、有绿色荧光等信息的散点图的门，确保准确性。

优选的，步骤(4)中标准物检测结果是采用标准物的6倍液作阳性对照进行检测的结果或计算机贮存的同型号流式细胞仪的检测结果。

其中，通过调整流式细胞仪所得图的门以体现其线性关系，通过峰值的调试，以减少偏锋现象，提高实验的准确性；样本出现与标准物对照类似的峰即可判样本有微粒子孢子。

优选的，步骤(4)中，将标准物稀释得到标准物的6倍液，然后与荧光染色液按照容量比为4：1混合后，在黑暗条件下处理25min，加入多孔板，并采用流式细胞仪自动检测；检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒及方法，具有如下有益效果：

(1)本发明利用流式细胞仪检测进行检测，操作简单，实现机械化检测，检测效率高；

(2)能够有效解决误判问题，使得到的检测结果准确度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1提供的检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒结构示意图；

图2附图本发明实施例1提供的细胞过滤器结构示意图

图3附图为本发明实施例2提供的样本31的检测结果图；

图4附图为本发明实施例3提供的样本14的检测结果图；

图5附图为本发明实施例4提供的样本17的检测结果图；

图6附图为本发明实施例5提供的样本8的检测结果图；

图7附图为本发明实施例2提供的标准物检测结果图。

在图中：

2为盒身、3为盒盖、4为荧光染色液瓶、5为标准孢子液瓶(标准孢子液浓度为1.0×10⁶粒/ml)、6为400目细胞过滤器、7为瓶架、8为细胞过滤器顶部骨架、9为细胞过滤器底部骨架、10为细胞过滤器连接柱、11为细胞过滤器过滤网。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的方法，具体包括如下步骤：

(1)将荧光粉末溶解后得到荧光染色液，过滤后加入至试剂盒中；其中，荧光粉末为异硫氰酸，采用pH为7.8～9.0的磷酸盐缓冲溶液溶解所述荧光粉末，所述荧光染色液的浓度为0.1mg/mL～0.5mg/m

(2)将样本研磨或稀释后进行加热处理，使其中的蛋白质杂质沉淀，然后过滤，得到样本液；向样本中加入质量浓度为0.5％的KOH或NaOH溶液进行稀释或研磨；所述加热的温度为65～70℃，时间为10～30min；

(3)按照样本液与荧光染色液的容量比是4：1，混合均匀并至于黑暗中，静置处理25-30min，并采用流式细胞仪检测，检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm；

(4)将样本液的检测结果与标准物检测结果比较，判定样本中是否含有微粒子原虫孢子；具体可以将标准物稀释得到标准物的6倍液，然后与荧光染色液按照容量比为4：1混合后，在黑暗条件下处理25min，加入多孔板，并采用流式细胞仪自动检测；检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm。

其中，步骤(1)～(2)中过滤采用35-45μm滤网或移液管吸头滤芯过滤。

利用流式细胞仪检测和分析前向角散射(FSC)、侧角散射(SSC)和荧光发射信息，得到定性和定量的结果。

优选的，步骤(4)中标准物检测结果是采用标准物的6倍液作阳性对照进行检测的结果或计算机贮存的同型号流式细胞仪的检测结果。

其中，通过调整流式细胞仪荧光散点图所得图的门以体现其线性关系，通过峰值的调试，以减少偏锋现象，提高实验的准确性；样本出现与标准物对照类似的峰即可判样本有微粒子孢子。

实施例1

本发明实施例1公开了一种检测昆虫中微粒子原虫孢子的试剂盒，包括盒身以及与盒身铰接的盒盖，盒身内通过瓶架固定有荧光染色液瓶和标准孢子液瓶，且盒身内固定有细胞过滤器；细胞过滤器的滤网孔径为400目。

瓶架顶面向下形成两个凹槽，凹槽内安装有荧光染色液瓶和标准孢子液瓶，

细胞过滤器包括细胞过滤器顶部骨架、细胞过滤器底部骨架以及设置于细胞过滤器顶部骨架和细胞过滤器底部骨架之间的若干细胞过滤器连接柱，细胞过滤器顶部骨架和细胞过滤器底部骨架为圆环形结构，细胞过滤器连接柱之间和细胞过滤器底部骨架通过细胞过滤器过滤网封合。

实施例2

本发明实施例2公开了一种利用流式细胞仪对家蚕蛾微粒子原虫孢子进行检测的方法，包括如下步骤：

(1)荧光粉末为异硫氰酸，采用pH为8.5的磷酸盐缓冲溶液溶解荧光粉末，溶解后用400目细胞过滤器(孔径35-45μm)过滤得到荧光染色液即试剂盒A液，浓度为0.1mg/mL，加入至试剂盒中；

(2)向样本中加入质量浓度为0.5％的KOH溶液进行研磨(1磨杯加入60～80mL)，消除脂肪球干扰，然后在67℃条件下200min，使蛋白质变性沉淀，再采用35-45μm滤网过滤得到样本液；

(3)按照样本液与荧光染色液的质量比为1：4，将样本液与试剂盒A液混合后暗环境下孵育25min,加入孔板，并采用流式细胞仪自动检测，检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm；

(4)将标准物稀释得到标准物的6倍液，然后与荧光染色液按照容量比为4：1混合后，在黑暗条件下处理25min，加入多孔板，并采用流式细胞仪自动检测；检测的激发光波长为488nm，最大发射波长为530nm。

(5)以对照标准物的荧光散点图设门，得到标准物的荧光分布图，如图7，即标准物检测结果。图3为样本31的检测结果，将样本液的检测结果与标准物检测结果比较，图3与图7在相同位置出现荧光信号峰值，故判定样本31带有微粒子原虫孢子。

实施例3

本发明实施例3公开了一种利用流式细胞仪对家蚕蛾微粒子原虫孢子进行检测的方法，具体操作与实施例2基本相同，区别仅在于采用的样本为家蚕蛾样本14，得到结果如图4所示。

将图4结果与图7对照比较，判定样本14带有微粒子原虫孢子。

实施例3

本发明实施例4公开了一种利用流式细胞仪对家蚕蛾微粒子原虫孢子进行检测的方法，具体操作与实施例2基本相同，区别仅在于采用的样本为家蚕蛾样本17，得到结果如图4所示。

将图5结果与图7对照比较，判定样本17带有微粒子原虫孢子。

实施例4

本发明实施例4公开了一种利用流式细胞仪对家蚕蛾微粒子原虫孢子进行检测的方法，具体操作与实施例2基本相同，区别仅在于采用的样本为家蚕蛾样本8，得到结果如图6所示。

将图6结果与图7对照比较，判定样本8带有微粒子原虫孢子。

样本实施例1-例4的检测结果分别如图3-图6，在荧光分布图在10³附近有荧光信号(峰)出现，并与图5类似，标志样本也有类似物——微粒子原虫孢子。样本8号用传统方法检验：集团磨蛾、600倍显微镜、人工看镜、2人对检、每人看2视野进行判断，因微粒子孢子太稀少(约1×10³)，人工看镜，观察2个视野有时并不遇到微粒子原虫孢子而易造成判定错误。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。