具体实施方式

I.概述

本发明部分基于以下发现：当包括包封CD1d-限制性未变异的天然杀伤T(iNKT)细胞抗原的免疫原性有效量的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞(例如，鞘脂，比如α-半乳糖基神经酰胺)的组合物与抗肿瘤剂一起施用时，协同改善癌症治疗策略。如实施例1和2中所显示，包含在衍生自细菌的小细胞内的包封的α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)被吞噬细胞摄取并在与CD1d结合的复合物中的细胞表面表达。当与抗肿瘤剂阿霉素组合施用时，包封的α-GalCer能够显著且协同地增强抗肿瘤应答。

先前已经尝试递送α-GalCer用于抗肿瘤治疗。这些包括以游离分子或封装在脂质体或聚合物中的α-GalCer施用(参见，例如，Giaccone等人，2002；Nakamura等人，2013；和Faveeuw等人，2014)。然而，这些方法在人体临床试验中导致了毒性和有限的抗肿瘤功效。这些方法旨在使用游离或封装的α-GalCer作为佐剂以仅引发iNKT细胞应答。相比之下，本发明不仅直接杀伤癌细胞，而且引发先天性和适应性抗肿瘤应答。这种联合疗法的组成部分包括诱导由抗肿瘤剂(例如，包括在衍生自细菌的小细胞中的细胞毒性剂)引发的免疫应答，以触发肿瘤细胞杀伤并激活有效的CD4+和CD8+抗肿瘤应答以及使用衍生自细菌的携带α-GalCer的小细胞，使抗原加工和呈递偏向MHC 1类(CD1d-限制型)，以增加有效的基于iNKT细胞的抗肿瘤应答。小细胞自身通过抗原呈递细胞(APC)识别由垂死的肿瘤细胞释放的损伤相关分子模式(DAMP)分子来引发先天性免疫应答。诱导涉及促炎性细胞因子的先天性免疫应答对这一过程至关重要，因为它引发了衍生自骨髓的巨噬细胞和树突细胞的激活和分化。该过程显著增强了抗肿瘤免疫性。相比之下，载体比如脂质体或聚合物无法引发先天性免疫应答。因此，与本公开的衍生自细菌的小细胞相比，抗肿瘤功效将较低，因为携带α-GalCer的脂质体或聚合物的抗肿瘤活性仅依赖于iNKT细胞活化，而不依赖于M1巨噬细胞的形成和树突细胞的活化。

癌症免疫疗法的最新进展导致了对特定癌症前所未有的、持久的临床反应(Emens等人，2017年；Farkona等人，2016年；Oiseth和Aziz，2017年；Sharma等人，2017年；Ventola，2017年)。然而，目前的免疫治疗策略导致各种肿瘤类型的成功率有限，并且随着时间推移最初表现出令人鼓舞的肿瘤消退的相当一部分患者复发(Emens等人，2017；Mellman等人，2011；Oiseth和Aziz，2017；Sharma等人，2017；Ventola，2017)。

此外，由于缺乏肿瘤细胞抗原或缺乏免疫细胞浸润，一部分患者缺乏肿瘤免疫原性，并且因此对当前可用的策略没有表现出初始应答(Emens等人，2017；Oiseth和Aziz，2017；Sharma等人，2017年)。因此，确定新的、强大的免疫治疗方法可显著改善临床结果，并且仍然是一个高度优先的领域。

为了产生有效的抗肿瘤免疫应答，必须自发地或治疗地实现某些步骤。首先，可经由肿瘤细胞死亡原位衍生或外源递送的肿瘤细胞抗原必须被树突细胞(DC)摄取(Anguille等人，2015年；Emens等人，2017年；Jung等人，2018年；Mellman等人，2011年)。与抗原摄取结合，DC需要接收适当的成熟信号，促使分化和增强抗原的加工和呈递，从而促进与耐受性相对的抗肿瘤功能(Anguille等人，2015；Emens等人，2017；Jung等人，2018；Mellman等人，2011；Simmons等人，2012)。然后这些成熟的、装载肿瘤抗原的DC必须有效地产生抗肿瘤T细胞应答，这可以经由产生肿瘤特异性细胞毒性T细胞、触发NK和/或NKT细胞应答以及增强T辅助细胞1型反应等发生(Emens等人，2017；Fang等人，2017；Mellman等人，2011；Sharma等人，2017；Zitvogel等人，2015)。抗肿瘤T细胞最终必须进入可能存在免疫抑制信号的肿瘤微环境，并有效发挥其抗肿瘤功能(Emens等人，2017；Mellman等人，2011)。在任何这些步骤中出现的问题都会阻碍免疫治疗的疗效，并且甚至可能导致治疗完全失败(Emens等人，2017；Mellman等人，2011；Sharma等人，2017)。

目前，临床上最受关注的免疫治疗策略包括免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)(Emens等人，2017；Mellman等人，2011；Oiseth和Aziz，2017；Sharma等人，2017；Ventola，2017)。检查点抑制剂如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡1/程序性细胞死亡1配体(PD-1/PDL-1)通过阻断免疫抑制信号的传递和直接刺激激活肿瘤微环境中的细胞毒性T淋巴细胞起作用(Dine等人，2017；Jenkins等人，2018；Sharpe，2017)。这些途径的抑制剂已在特定癌症中显示出显著的临床结果，但不同癌症的总体应答率仍然很低(～15-25％)，并且与这些疗法相关的免疫相关毒性可能很高(Dine等人，2017年；Emens等人，2017；Jenkins等人，2018；Sharpe，2017；Ventola，2017)。随着新的检查点不断被发现作为潜在的免疫靶标，显而易见的是肿瘤能够利用一套复杂多样的免疫抑制途径(Dine等人，2017；Emens等人，2017；Farkona等人，2016年；Jenkins等人，2018年；Sharpe，2017年)。因此，对检查点抑制剂的耐药性的开发仍然是一个障碍，并且正在尝试利用一种以上检查点抑制剂的组合来克服这些问题，尽管这通常会加剧相关的毒性(Dine等人，2017；Jenkins等人，2018；Sharma等人，2017；Ventola，2017)。

第二种受到广泛关注的疗法是CAR-T细胞疗法，它需要对患者的T细胞进行基因工程，以表达具有确定的肿瘤抗原特异性的膜融合受体，并能够引发强大的T细胞活化以启动杀伤靶向肿瘤细胞(D'Aloia等人，2018年；Farkona等人，2016年；Mellman等人，2011年；Sharma等人，2017年)。这种治疗方法在“液体”血液癌症的治疗中产生了前所未有的临床结果，但由于与缺乏良好的特异性抗原靶标、对肿瘤的归巢性差、渗入肿瘤的能力差，并且在敌对的肿瘤微环境中缺乏持久性相关的局限，迄今为止尚未产生相当的靶向实体恶性肿瘤的应答(D'Aloia等人，2018年；Sharma等人，2017年)。还存在与大量预处理患者的淋巴细胞可用性和长的制造时间有关的实际限制，并且对于疾病快速进展的患者来说不是可行的治疗选择(Oiseth和Aziz，2017年；Rezvani等人，2017年)。

EnGeneIC Dream Vector(EDV)是一种衍生自细菌的递送系统，由直径约400±20nm的无活性纳米细胞组成，通过重新激活细菌中的细胞分裂的极性位点产生(MacDiarmid等人，2007b)。已经证明，这些纳米细胞可以与细胞毒性药物、siRNA或miRNA一起封装，并通过将双特异性抗体附着在纳米细胞的表面多糖上而特异性靶向肿瘤细胞表面受体(MacDiarmid等人，2009年；MacDiarmid等人，2007b；Reid等人，2013)。小鼠和狗的静脉注射后研究表明，由于它们的大小，它们会保留在血管系统中，但随后会经由与肿瘤相关的渗漏脉管系统迅速渗入肿瘤中(MacDiarmid等人，2007b；Sagnella等人，2018)。经由相关的双特异性抗体的肿瘤细胞表面受体参与后导致大胞饮进入内体，并经由溶酶体中的细胞内降解释放有效载荷(MacDiarmid等人，2009年；MacDiarmid等人，2007b；Sagnella等人，2018年)。这些纳米细胞疗法的安全性已在三项I期临床试验中得到证明，在各种晚期癌症患者中施用超过一千剂。此外，装载PNU-159682细胞毒性药物的靶向EGFR的EDV、阿霉素封装的靶向EGFR的EDV、micro RNA mir16a封装的EDV、靶向EGFR的EDV目前正在I期临床试验中递送至患者，并且迄今为止已显示出有希望的安全性(NHMRC临床试验中心，2017年；Kao等人，2015年；Solomon等人，2015年；van Zandwijk等人，2017年；Whittle等人，2015年)。

A.细菌小细胞递送方法的概述

先前已经描述了使用衍生自细菌的小细胞向癌细胞递送化疗剂。这种治疗癌症的递送方法将有毒的化疗剂或药物或功能性核酸封装到衍生自细菌的小细胞中，小细胞的直径通常约为400nm。通常，携带化疗剂的小细胞靶向特定癌细胞的抗体。抗体附着在癌细胞表面，并且小细胞被癌细胞内在化。通过这种方式，随着有毒药物或化合物被输送到癌细胞内，有毒的化疗剂不会广泛地分布在全身，并且因此减少了副作用和不耐受的机会。使用靶向抗体的小细胞作为有毒化疗剂的递送载体导致杀伤癌细胞所需的药物少得多，因此改善治疗指标。

实际上，本发明人已经表明，小细胞(或EnGeneIC Dream Vehicles，EDV)可以将化疗药，比如紫杉醇(paclitaxel)或阿霉素递送到小鼠、狗和猴子的异种移植肿瘤。靶向的递送确保癌细胞接受大部分化疗剂，导致低毒性水平。参见MacDiarmid等人，2007b；MacDiarmid等人，2007a；MacDiarmid等人，2009年；和MacDiarmid等人，2016年。此外，小细胞在异种移植模型中不会诱导显著的免疫应答，并且小细胞耐受性良好。因此，完整的、衍生自细菌的小细胞是一种耐受性良好的媒介物，其可用于向患者递送抗癌药物，实例包括靶向晚期实体瘤的阿霉素、靶向胶质母细胞瘤的阿霉素和靶向间皮瘤的微RNA-16a。然而，这些治疗策略不会导致全部患者的所有癌症完全缓解或治愈。因此，需要改进的癌症治疗疗法。

本发明人发现，使用包括CD1d-限制性未变异的天然杀伤T(iNKT)细胞抗原和抗肿瘤剂的衍生自细菌的小细胞组合产生出人意料地显著的和有效的临床功效。在具体实施方式中，包括CD1d-限制性未变异的天然杀伤T(iNKT)细胞抗原的衍生自细菌的小细胞不包括靶向剂，和包括抗肿瘤剂的衍生自细菌的小细胞包括靶向剂。

具体而言，本发明人发现包括CD1d-限制性未变异的天然杀伤T(iNKT)细胞抗原比如α-GalCer的小细胞与包括抗肿瘤剂(例如，阿霉素)的小细胞组合产生协同的抗肿瘤效果。这些数据在下面更详细地描述。

数据揭示了基于先天性和适应性免疫应答的抗肿瘤免疫的独特途径。不受理论束缚，假设包括α-GalCer的小细胞和包括抗肿瘤剂的小细胞经由与实体瘤相关的渗漏脉管系统外渗到肿瘤微环境中。包括抗肿瘤剂和抗EGFR靶向剂的靶向小细胞经由大胞饮作用被肿瘤细胞内在化。一旦进入肿瘤细胞，小细胞就会被分解，导致抗肿瘤药物的释放并诱导肿瘤细胞凋亡。凋亡的肿瘤细胞迅速暴露其表面的钙网蛋白，随后是磷脂酰丝氨酸(凋亡的标志物)，并在继发性坏死时释放损伤相关分子模式(DAMP)分子，比如ATP(凋亡期间)和HMGB1。

无法进入肿瘤微环境的小细胞被与在肝脏、脾脏和淋巴结相关的脉管系统中发现的免疫系统的细胞(例如，巨噬细胞和树突细胞)吞噬。小细胞在溶酶体中被分解，并且释放的LPS从溶酶体膜中逸出，并经由CARD(半胱天冬酶募集域)域与半胱天冬酶4和半胱天冬酶5结合。这种LPS结合促进了半胱天冬酶4/5的快速寡聚化，导致巨噬细胞或树突细胞的焦亡和促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。细胞焦亡的过程还会引发过多的促炎细胞因子比如TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的释放。这些促炎性信号被骨髓中的单核细胞获取(pick up)，并且这些细胞分化为活化的巨噬细胞和树突细胞，它们从骨髓中渗出并进入全身循环。

垂死的肿瘤细胞释放的DAMP(ATP和HMGB1)在与靶细胞表面上表达的P2Y2受体结合后，产生树突细胞和巨噬细胞强烈的“找到我(find-me)”信号。细胞外ATP不仅将免疫细胞吸引到肿瘤微环境中，而且还调节它们的活性。例如，ATP可以诱导髓源性DC的成熟，这伴随着CD40、CD80、CD83和CD86的表达增加，并且还通过形成片状假体膜突起促进巨噬细胞扩增。这些新分化的活性巨噬细胞和树突细胞跟随“找到我”信号并进入肿瘤微环境。

凋亡肿瘤细胞表面的钙网蛋白在功能上被认为是免疫系统的“吃掉我(eat-me)”信号。在其表面有钙网蛋白表达的细胞被CD91+细胞(例如树突细胞和巨噬细胞)识别并吞没(engulf)。钙网蛋白通过表达在其表面上的CD91作用于靶标树突细胞，以促进促炎性细胞因子例如TNF-a和IL-6的释放，并调节免疫抑制性肿瘤床中17型辅助T(Th17)细胞的活性。钙网蛋白与CD91的结合还促进抗原呈递细胞，例如树突细胞募集到肿瘤微环境中，树突细胞吞噬肿瘤细胞，以及将最佳抗原呈递给T细胞，最终导致免疫系统的激活。

HMGB1引发强烈的炎症性反应。HMGB1在与TLR4结合后，激活树突细胞并刺激肿瘤相关抗原向T细胞的最佳呈递。

RAGE(晚期糖化终产物的受体)是HMGB1的另一个重要受体。HMGB1与RAGE的结合通过激活MAPK(p38和ERK1/2)和NF-kB促进树突细胞成熟和迁移。

这些DAMP刺激树突细胞募集到肿瘤微环境中、肿瘤抗原的摄取和加工，以及向T细胞的最佳抗原呈递。CD8+细胞毒性T细胞的交叉引发由成熟树突细胞和γδT细胞以IL-1β和IL-17依赖性方式触发。引发的CD8+细胞毒性T细胞然后引发直接细胞毒性反应，以通过产生IFN-γ、穿孔素-1和颗粒酶B杀伤剩余的肿瘤细胞。

许多包含α-GalCer的循环小细胞被存在于与肝脏、脾脏和淋巴结相关的脉管系统中的巨噬细胞和树突细胞吞噬。小细胞在溶酶体中被分解并释放出α-半乳糖基神经酰胺。在酸性溶酶体中，在脂质交换蛋白比如皂苷的帮助下，α-半乳糖基神经酰胺与CD1d形成复合物。这些复合物被转运到细胞表面并主要定位于质膜中富含胆固醇的微区，即脂筏。胸腺衍生的未变异的天然杀伤T细胞(iNKT)经由其独特的T细胞受体(TCR)库Vα24Jα18识别由CD1d呈递的脂质抗原。iNKT细胞携带预先存在的IFNγmRNA，并且因此在TCR/Cd1d/α-GalCer结合后迅速分泌IFNγ。iNKT细胞还在TCR触发时迅速分泌多种细胞因子，这伴随着免疫系统各种细胞的CD1d-限制性细胞毒能力的增加。iNKT释放的细胞因子包括调节性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13)以及促炎性细胞因子，例如IL-2、IL-17和IFNγ。在激活之后，iNKT细胞可以直接杀伤由经典颗粒介导机制介导的肿瘤细胞。在识别树突细胞表面的CD1d:脂质复合物和共刺激分子CD80/86后，iNKT细胞上调IL-12R和CD40L分子。随后，并且由CD40L介导，iNKT诱导树突细胞成熟并释放IL-12。这种IL-12释放反过来有效地增加了iNKT产生IFNγ，然后与iNKT诱导成熟后增强的DC交叉呈递一起，促进了抗肿瘤细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)的激活。因此，iNKT细胞具有启动免疫应答的能力，并与树突细胞一起桥连先天性免疫系统和适应性免疫系统。通过表达MHC1分子以呈递独特的糖脂肿瘤抗原，IFNγ的释放使专职吞噬细胞偏向于Th1类型的免疫应答。因此，包括肿瘤剂的小细胞启动肿瘤杀伤过程，包括α-GalCer的小细胞和包括肿瘤剂的小细胞触发先天性免疫应答，和包括α-GalCer的小细胞活化适应性免疫应答，导致免疫系统接管肿瘤特异性杀伤过程。

如上所述和在本文中呈现的实施例中，本公开的发明人已经发现包封在衍生自细菌的小细胞内的CD1d-限制性iNKT细胞抗原α-GalCer与抗肿瘤剂组合出人意料地产生了协同的抗肿瘤作用。鉴于协同效应似乎部分取决于抗肿瘤剂诱导细胞死亡的活性，任何能够诱导癌细胞的细胞死亡的抗肿瘤剂都适合与包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原组合使用。在一个实施方式中，抗肿瘤剂也包含在衍生自细菌的小细胞内。在另一个实施方式中，抗肿瘤剂不包含在衍生自细菌的小细胞内。此外，如下文进一步详细描述的，除了α-GalCer之外，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是已知的，并且已经显示出影响iNKT细胞活化，并且可以在本文提供的组合物和方法中代替α-GalCer使用或与α-GalCer组合使用。

以下描述概述了与这些发现相关的本发明，但不将本发明限制于所描述的特定实施方式、方法、方案或试剂。同样，这里使用的术语仅描述特定实施方式并且不限制本发明的范围。

B.实验结果总结

在一个实施方式中，本发明涉及以下出人意料的发现，包括小细胞封装的抗肿瘤剂和小细胞封装的II型干扰素激动剂诸如例如α-半乳糖基神经酰胺(α-GC)的组合的组合物，并且在没有I型干扰素激动剂的情况下，表现出人意料的抗癌功效。

具体而言，实施例1描述了说明含有抗肿瘤治疗剂的小细胞和含有CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如，α-GalCer)的小细胞的双重组合对抗肿瘤的功效的数据。参见图3-6。实验结果显示，与盐水和^Ep小细胞_Dox处理相比，接受^Ep小细胞_Dox+小细胞_α-GC(α-GalCer)的联合治疗组的肿瘤进展明显停止。该结果支持通过向^Ep小细胞_Dox增加小细胞_α-GC处理产生免疫佐剂效应的理论。

进一步的数据表明，在处理改变为药物和α-GalCer EDV介导的双重联合治疗后，盐水处理的对照肿瘤表现出显著的肿瘤消退(图6)；例如，小细胞封装的抗肿瘤剂和小细胞封装的II型干扰素激动剂(例如，CD1d-限制性iNKT细胞抗原，比如α-GalCer)的组合。具体而言，在实验终止前的3天内，已达到800mm³的肿瘤降至600mm³以下——在短时间内肿瘤尺寸显著减小(～25％)。在本发明之前，双重组合组合物在短时间内显著减小大肿瘤的能力是未知的。

在本发明的一个实施方式中，双重组合组合物(例如，小细胞封装的抗肿瘤剂与小细胞封装的CD1d-限制性iNKT细胞抗原比如α-GalCer组合)可以将肿瘤尺寸包括大肿瘤的尺寸减小约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％、约120％、约125％、约130％、约135％、约140％、约145％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％、约325％、约350％、约375％、约400％。约425％、约450％、约475％或约500％。可以在任何合适的时间段测量肿瘤尺寸的减小，比如约3天、约5天、约1周、约2周、约3周、约1月、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、约12月、约1.5年、约2年或更长。

细菌小细胞治疗代表了能够将传统和新型药物疗法直接输送到肿瘤部位，随后引发抗肿瘤免疫应答的独特的癌症治疗策略。发生对肿瘤的双重攻击，首先通过响应所递送的治疗的细胞死亡，然后是导致适应性免疫应答的先天免疫细胞活化。与当前的免疫治疗策略相比，这种类型的治疗具有某些优势，因为免疫细胞活化发生在体内和主要发生在肿瘤部位，这是一个快速变化的动态环境。此外，它创造了一个免疫原性肿瘤环境，并引发了对多个免疫细胞亚群的影响，避免了与对其肿瘤几乎没有免疫应答或适应仅针对单个免疫细胞亚群的治疗的患者相关的问题。下面描述的研究强调了细菌小细胞作为一种新型癌症免疫治疗剂的潜力，并且鉴于该技术在有效载荷和靶向能力方面的多功能性，未来的细菌小细胞制剂可以进一步利用其固有的免疫原性(MacDiarmid等人，2007a)。

II.组合物组分

如上所述，本发明的组合物包括包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如，α-GalCer)，其与诱导受试者体内赘生性细胞死亡的抗肿瘤剂组合施用。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原被包封在如本文所描述的衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。

在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原与抗肿瘤剂一起包封在衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂被包封在分离的衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包含在同一组合物中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包含在分离的组合物中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原被包封在衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中，并且抗肿瘤剂被包封在衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原被包封在衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中，并且抗肿瘤剂不包封在衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。

A.CD1d-限制性iNKT抗原

II型IFN通过激活细胞毒性T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。参见，例如，Chikuma等人，2017。IFNγ细胞因子在与天然抗原结合后由先天性天然杀伤细胞释放，但鞘糖脂化合物可作为先天性免疫应答和获得性免疫应答的有效活化剂。本发明人发现包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原，比如鞘糖脂α-GalCer，被吞噬细胞比如巨噬细胞和树突细胞吞噬，并且然后在与表面糖蛋白CD1d结合的细胞的表面表达。识别与CD1d结合的表达的鞘糖脂诱导先天性天然杀伤T(iNKT)细胞产生有效的细胞因子应答，包括II型干扰素、IFN-γ和许多白细胞介素(Th1-、Th2-和/或Th17-型细胞因子)。参见，例如，Carreno等人，2016。iNKT细胞然后诱导DC成熟并显示类似T细胞辅助的功能，导致细胞毒性T细胞应答的发展。

可用于本文描述的组合物的CD1d-限制性iNKT细胞抗原的实例包括但不限于鞘糖脂，比如α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)、α-半乳糖基神经酰胺的C-糖苷形式(α-C-GalCer)、半乳糖基神经酰胺的12碳酰基形式(β-GalCer)、β-D-吡喃葡萄糖基神经酰胺(β-GlcCer)、l,2-二酰基-3-O-半乳糖基-sn-甘油(BbGL-II)、含二酰甘油的糖脂(Glc-DAG-s2)、神经节苷脂(GD3)、神经节三糖基神经酰胺(Gg3Cer)、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、α-葡萄糖醛酸神经酰胺(GSL-1或GSL-4)、异球三己糖神经酰胺(iGb3)、脂磷聚糖(LPG)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、α-半乳糖基神经酰胺类似物(OCH)和苏糖醇神经酰胺。在具体实施方式中，本文公开的组合物包括和包封的α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。

在一些实施方式中，鞘糖脂是合成的α-GalCer类似物。在一些实施方式中，合成的α-GalCer类似物选自6′-脱氧-6′-乙酰胺α-GalCer(PBS57)、萘脲α-GalCer(NU-α-GC)、NC-α-GalCer、4ClPhC-α-GalCer、PyrC-α-GalCer、α-carba-GalCer、carba-α-D-半乳糖α-GalCer类似物(RCAI-56)、1-脱氧-新肌醇α-GalCer类似物(RCAI-59)、1-O-甲基化α-GalCer类似物(RCAI-92)和HS44氨基环醇神经酰胺。

在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原衍生自细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自细菌种群鞘脂单胞菌科(Sphinomonadacae)某些种的鞘糖脂。在一些实施方式中，鞘糖脂是鞘脂单胞菌科某些种，糖鞘脂-1(GSL-1)、GSL-1'、GSL-2、GSL-3或GSL-4。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自细菌种群链球菌某些种的糖脂。在一些实施方式中，糖脂是肺炎链球菌Glc-二酰基甘油(DAG)或Gal-Glc-DAG。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自细菌种群疏螺旋体属某些种的糖脂。在一些实施方式中，糖脂是伯氏疏螺旋体BbGL-IIc。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自细菌种群幽门螺杆菌的糖脂。在一些实施例中，糖脂是幽门螺杆菌PI57。可用于本文提供的组合物和方法的其他CD1d-限制性iNKT细胞细菌抗原包括但不限于源自海绵单胞菌(Spongemonas)的单糖基神经酰胺、源自结核分枝杆菌的磷脂酰肌醇甘露糖苷和源自杜氏利什曼原虫(Leishmania donovi)的脂磷酸聚糖。

在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自曲霉属某些种比如烟曲霉或黑曲霉的真菌糖脂。在一些实施方式中，糖脂是烟曲霉aperamide B。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原是来自原生动物溶组织内阿米巴的糖脂。在一些实施方式中，糖脂是溶组织内阿米巴EhP1b。

可用于本文提供的组合物的其他示例性CD1d-限制性iNKT细胞抗原，包括其他α-GalCer衍生物，包括在US2017/0368002、Birkholz和Kronenberg，2015和Anderson，2013中描述的那些，它们各自通过引用以其整体并入。

如实施例1中所显示，申请人发现与仅施用^Ep小细胞_Dox的小鼠相比，施用含有化疗剂阿霉素(^Ep小细胞Dox)的完整的、衍生自细菌的小细胞和含有CD1d-限制性iNKT细胞抗原α-GalCer(小细胞_α-GC)的小细胞的含有肿瘤的小鼠表现出显著的肿瘤进展停止。这些观察表明，结合了CD1d-限制性iNKT细胞抗原的小细胞组合物可有效治疗小鼠的肿瘤。小细胞可以将II型IFN激动剂，比如CD1d-限制性iNKT细胞抗原，直接递送到免疫系统的细胞中，以增强iNKT细胞活化和体内II型干扰素IFN-γ的产生。可选地，非靶向包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原被免疫系统的吞噬细胞摄取，在此将其在内体中分解，并将αGC呈递给iNKT细胞以进行免疫激活。

因此，在一些实施方式中，本文所述的组合物提供了II型干扰素激动剂，比如CD1d-限制性iNKT细胞抗原的靶向递送。在其他实施方式中，本文公开的组合物包括CD1d-限制性iNKT细胞抗原的非靶向递送。

IFN-γ的产生受抗原呈递细胞(APC)分泌的细胞因子控制，尤其是白细胞介素(IL)-12和IL-18。这些细胞因子充当连接感染与先天性免疫应答中IFN-γ产生的桥梁。许多病原体的巨噬细胞识别诱导IL-12和趋化因子的分泌。这些趋化因子将NK细胞吸引到炎症部位，并且IL-12促进这些细胞中的IFN-γ合成。在巨噬细胞、天然杀伤细胞和T细胞中，IL-12和IL-18刺激的组合进一步增加了IFN-γ的产生。因此，这些蛋白质中的任何一种或它们的组合是与本文提供的组合物和方法组合使用的合适的试剂。

数据显示，当患者还接受抗肿瘤治疗，比如如本文所述的化疗药或载药的双特异性抗体靶向的小细胞时，有效激活宿主对肿瘤细胞免疫应答所需的IFN-γ血清浓度较低。因此，一方面，本发明的方法导致不高于约30,000pg/mL的血清IFN-γ浓度增加。在另一方面，血清IFN-γ浓度增加至不高于约5000pg/mL、1000pg/mL、900pg/mL、800pg/mL、700pg/mL、600pg/mL、500pg/mL、400pg/mL、300pg/mL、200pg/mL或100pg/mL。在进一方面，所得血清IFN-γ浓度为至少约10pg/mL、或至少约20pg/mL、约30pg/mL、约40pg/mL、约50pg/mL、约60pg/mL、约70pg/mL、约80pg/mL、约90pg/mL、约100pg/mL、约150pg/mL、约200pg/mL、约300pg/mL、约400pg/mL或约500pg/mL。

B.用于治疗癌症的抗肿瘤或细胞毒性活性剂

短语“抗肿瘤剂”表示防止或抑制肿瘤细胞的生长、发育、成熟或扩散的化学或生物药物。术语“抗肿瘤剂”可与“抗癌剂”和“化疗剂”互换使用。

在本公开的上下文中，选择用于治疗给定肿瘤的抗肿瘤剂取决于若干因素。这些因素包括但不限于患者的年龄、肿瘤的阶段以及患者之前可能接受过的任何治疗。

组合物可包括至多约1mg的抗肿瘤药或化疗药。可选地，化疗药的量可以为至多约750μg、约500μg、约250μg、约100μg、约50μg、约10μg、约5μg、约1μg、约0.5μg或约0.1μg。在另一方面，组合物包括的化疗药的量小于当没有被封装到小细胞中使用时治疗有效量的药物的约1/1,000，或可选地小于约1/2,000、1/5,000、1/10,000、1/20,000、1/50,000、1/100,000、1/200,000或1/500,000。根据本公开的又另一方面，组合物可包括至少约1nmol的化疗药。因此，本公开还包括其中化疗药的量为至少约2nmol、约3nmol、约4nmol、约5nmol、约10nmol、约20nmol、约50nmol、约100nmol或约800nmol的实施方式。

根据本公开，化疗药可以选自下文详述的类别之一，以与本文提供的包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原一起施用。在一些实施方式中，化疗药被封装到如本文所述的完整的、衍生自细菌的小细胞中。这些药物也可以是通过药物设计和发现努力设计的合成类似物。任何已知的化疗剂都可以用于本发明的组合物中。已知化疗药的实例包括但不限于：

(1)烷化剂，比如芥菜气体衍生物(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(Cyclophosphamide)(环磷酰胺(Cytoxan))、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)(苯丁酸氮芥(Leukeran))、左旋溶肉瘤素和异环磷酰胺)、乙烯亚胺(噻替派(Thiotepa)((噻替派)Thioplex)和六甲基三聚氰胺)、烷基磺酸盐(白消安(Busulfan)(白消安(Myleran)))、肼和三嗪(六甲蜜胺(Altretamine)(六甲蜜胺(Hexalen))、甲基苄肼(Procarbazine)(甲基苄肼(Matulane))、达卡巴嗪(DTIC)和替莫唑胺)、亚硝基脲(卡莫司汀、洛莫司汀和链脲佐菌素)和金属盐(碳铂、顺铂(Cisplatin)(顺铂(Platinol))和奥沙利铂)、二氯甲基二乙胺和左旋溶肉瘤素(Melphalan)(苯丙氨酸氮芥(Alkeran))；

(2)植物生物碱，萜类化合物和拓扑异构酶抑制剂，比如长春花生物碱(长春新碱(Vincristine)(长春新碱(Oncovin))、长春花碱(Vinblastine)(长春花碱(Velban))、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine))、紫杉烷(紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))和多西他赛(Docetaxel)(多西他赛(Taxotere))、鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(Tenisopide))和喜树碱类似物(伊立替康和拓扑替康)；

(3)抗肿瘤抗生素，比如蒽环类(阿霉素(Doxorubicin)(阿霉素(Adriamycin)、Rubex、Doxil)、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌、伊达比星、多霉素和更生霉素(Cosmegen))、色霉素(更生霉素和普卡霉素(Plicamycin)(光辉霉素(Mithramycin)))和各种各样(丝裂霉素和博莱霉素(硫酸博来霉素))；

(4)抗代谢物，比如叶酸拮抗物(甲氨蝶呤)、嘧啶拮抗物(5-氟尿嘧啶、Foxuridine、阿糖胞苷、氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨和吉西他滨)、嘌呤拮抗剂(6-巯嘌呤(6-Mercaptopurine)(巯嘌呤(Purinethol))和6-硫鸟嘌呤)、(6-Thiopurines)和腺苷脱氨酶抑制剂(克拉屈滨(Cladribine)(克拉屈滨(Leustatin))、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他汀)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫鸟嘌呤和阿糖胞苷(ara-C)；

(5)拓扑异构酶抑制剂，比如拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康(Ironotecan)、拓扑替康)和拓扑异构酶II抑制剂(安吖啶、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷)；

(6)激素类药剂，例如雌激素和雄激素抑制剂(它莫西芬和氟他胺)、促性腺激素释放激素激动剂(亮丙瑞林和戈舍瑞林(Zoladex))、芳香酶抑制剂(氨鲁米特和阿那曲唑(Anastrozole)(瑞宁得(Arimidex)))；

(7)DNA低甲基化剂，例如，阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨；

(8)聚(二磷酸腺苷[ADP]-核糖)聚合酶(PARP)途径抑制剂，比如伊尼帕利(Iniparib)、奥拉帕尼(Olaparib)、维利帕尼(Veliparib)；

(9)PI3K/Akt/mTOR途径抑制剂，例如，依维莫司(Everolimus)；

(10)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如，伏立诺他、恩替诺他(SNDX-275)、莫西司他(Mocetinostat)(MGCD0103)、帕比司他(Panobinostat)(LBH589)、罗米地辛(romidepsin)、丙戊酸。

(11)细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，例如，Flavopiridol、奥罗莫星(Olomoucine)、Roscovitine、Kenpaullone、AG-024322(辉瑞)、Fascaplysin、Ryuvidine、Purvalanol A、NU2058、BML-259、SU 9516、PD-0332991、P276-00。

(12)热休克蛋白(HSP90)抑制剂，例如，格尔德霉素、Tanespimycin、阿螺旋霉素(Alvespimycin)、根赤壳菌素、鱼藤素(Deguelin)和BIIB021；

(13)鼠双微体基因2(MDM2)抑制剂，例如，顺式咪唑啉、苯并二氮杂二酮、螺环羟吲哚(Spiro-oxindole)、异喹啉酮、噻吩、5-去氮杂黄素、色胺；

(14)间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂，例如氨基吡啶、二氨基嘧啶、吡啶并异喹啉、吡咯并吡唑、吲哚并咔唑、吡咯并嘧啶、二苯胺嘧啶；

(15)聚[ADP核糖]聚合酶(PARP)抑制剂，例如苯甲酰胺、二氮杂萘酮(Phthalazinone)、三环吲哚、苯并咪唑、吲唑、吡咯并咔唑、二氮杂萘酮(Phthalazinone)、异吲哚啉酮；和

(16)各种抗癌药物，例如安吖啶、天冬酰胺酶(El-spar)、羟基脲、米托蒽醌(Mitoxantrone)(米托蒽醌(Novantrone))、米托坦(Mitotane)(米托坦(Lysodren))、美登木素生物碱、视黄酸衍生物、骨髓生长因子(沙格司亭和非格司亭)、氨磷汀、破坏叶酸代谢的药剂例如培美曲塞、核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲)、肾上腺皮质类固醇抑制剂(米托坦)、酶(天冬酰胺酶和培门冬酶)、抗微管剂(雌氮芥)和类视黄醇(贝沙罗汀、异维甲酸、维生素A酸(ATRA))。

例证小分子药物亚类的化疗药是放线菌素-D、苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷、阿那曲唑、卡莫司汀(BiCNU)、比卡鲁胺、博莱霉素、白消安、卡培他滨、碳铂、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷(Cytosinearabinoside)、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙亚胺、依托泊苷、氟脲苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、六甲铵、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、左旋溶肉瘤素、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸二钠、喷司他汀、普卡霉素、甲基苄肼、类固醇、链脲佐菌素(Streptozocin)、STI-571、链脲佐菌素、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、噻替派、雷替曲塞、拓扑替康、海硫磷(treosulphan)、三甲曲沙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达。

美登木素生物碱(分子量：～738道尔顿)是美登素的一组化学衍生物，具有强大的细胞毒性。尽管由于毒性问题认为对于人类患者使用是不安全的，但是根据本发明美登木素生物碱适合经由小细胞递送给脑肿瘤患者。

多霉素(分子量：～588道尔顿)是一系列相关的天然产物，首先从链霉菌属细菌中分离出来。它们还具有强大的细胞毒性，但被认为对人类使用不安全。与美登木素生物碱类似，多霉素是适用于本发明的化疗药。

生物化疗药的子类别包括但不限于天冬酰胺酶、AIN-457、巴匹珠单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、布雷奴单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达洛妥珠单抗、地诺单抗、依帕珠单抗、Estafenatox、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、吉瑞妥昔单抗(WX-G250)、赫赛汀、伊莫单抗、伊诺妥珠单抗、伊匹单抗、美泊利单抗、莫罗单抗-CD3、他那莫单抗、奈昔妥木单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法妥木单抗、奥特利昔珠单抗、奥佐米星、帕吉巴昔单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、REGN88、索兰珠单抗、他尼珠单抗、替利珠单抗、替坦(Tiuxetan)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗、维多珠单抗、扎鲁妥木单抗和扎诺木单抗。

在一些实施方式中，抗肿瘤剂包括选自以下的化合物：放线菌素-D、苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷、阿那曲唑、卡莫司汀、比卡鲁胺、博莱霉素、白消安、卡培他滨、碳铂、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙亚胺、依托泊苷、氟脲苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、六甲铵、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、左旋溶肉瘤素、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸二钠、喷司他汀、普卡霉素、甲基苄肼、类固醇、链脲佐菌素、STI-571、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、噻替派、雷替曲塞、拓扑替康、海硫磷、三甲曲沙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、希罗达、天冬酰胺酶、AIN-457、巴匹珠单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、布雷奴单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达洛妥珠单抗、地诺单抗、依帕珠单抗、estafenatox、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、吉瑞妥昔单抗(WX-G250)、赫赛汀、伊莫单抗、伊诺妥珠单抗、伊匹单抗、美泊利单抗、莫罗单抗-CD3、他那莫单抗、奈昔妥木单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法妥木单抗、奥特利昔珠单抗、奥佐米星、帕吉巴昔单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、REGN88、索兰珠单抗、他尼珠单抗、替利珠单抗、替坦、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗、维多珠单抗、扎鲁妥木单抗、扎诺木单抗、5FC、青春痘特效药hoffmann-la roche、AEE788诺华、AMG-102、抗肿瘤药、AQ4N(Banoxantrone)、AVANDIA(罗格列酮马来酸盐)、阿瓦斯汀(avastin)(贝伐单抗)基因泰克、BCNU、biCNU卡莫司汀、CCI-779、CCNU、CCNU洛莫司汀、塞来考昔(全身)、氯喹、西仑吉肽(EMD121974)、CPT-11(CAMPTOSAR、伊立替康)、达沙替尼(BMS-354825，Sprycel)、树突细胞疗法、依托泊苷(Eposin、凡毕复(etopophos)、凡毕士(Vepesid))、GDC-0449、格列卫(伊马替尼甲磺酸盐)、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)晶片、羟化氯喹、IL-13、IMC-3G3、免疫疗法、易瑞沙(ZD-1839)、拉帕替尼(GW572016)、用于癌症的甲氨蝶呤(全身)、novocure、OSI-774、PCV、RAD001诺华(mTOR抑制剂)、雷帕霉素(雷帕鸣(Rapamune)、西罗莫司)、RMP-7、RTA 744、辛伐他汀、西罗莫司、索拉非尼、SU-101、SU5416 sugen、硫氮磺胺吡啶(Azulfidine)、舒尼替尼(Pfizer)、TARCEVA(厄洛替尼HCl)、紫杉醇、TEMODAR先灵葆雅(schering-plough)、TGF-B反义、沙洛米(thalomid)(沙利度胺(thalidomide))、拓扑替康(全身)、VEGF阱、VEGF-阱、伏立诺他(SAHA)、XL 765、XL184、XL765、zarnestra(替吡法尼(tipifarnib))、ZOCOR(辛伐他汀)、环磷酰胺(cyclophosphamide)(环磷酰胺(Cytoxan))、(苯丙氨酸氮芥)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(苯丁酸氮芥(Leukeran))、thiopeta(Thioplex)、白消安(busulfan)((白消安(Myleran))、甲基苄肼(procarbazine)(甲基苄肼(Matulane))、达卡巴嗪(DTIC)、六甲蜜胺(altretamine)(克瘤灵(Hexalen))、苯丁酸氮芥(clorambucil)、顺铂(cisplatin)(顺铂(Platinol))、ifosafamide、甲氨蝶呤(MTX)、6-硫嘌呤(巯嘌呤[6-MP]、硫鸟嘌呤[6-TG])、巯嘌呤(mercaptopurine)(巯嘌呤(Purinethol))、氟达拉滨磷酸、克拉屈滨注射液(Leustatin)、氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(cytarabine)(阿糖胞苷(ara-C))、阿扎胞苷(azacitidine)、长春花碱(Velban)、长春新碱(Oncovin)、鬼臼毒素(依托泊苷{VP-16}和替尼泊苷{VM-26})、喜树碱(拓扑替康和伊立替康)、紫杉烷比如紫杉醇(Taxol)和多西他赛(泰索帝)、(阿霉素、Rubex、Doxil)、更生霉素(Cosmegen)、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素：(Mutamycin)、博莱霉素(硫酸博来霉素)、雌激素和雄激素抑制剂(它莫西芬)、促性腺激素释放激素激动剂(亮丙瑞林和戈舍瑞林(Zoladex))、芳香酶抑制剂(氨鲁米特和阿那曲唑(Arimidex))、安吖啶、天冬酰胺酶(El-spar)、米托蒽醌(Novantrone)、米托坦(Lysodren)、视黄酸衍生物、骨髓生长因子(沙格司亭和非格司亭)、氨磷汀、培美曲塞、地西他滨、伊尼帕利(Iniparib)、奥拉帕尼、维利帕尼、依维莫司、伏立诺他、恩替诺他(SNDX-275)、莫西司他(MGCD0103)、帕比司他(LBH589)、罗米地辛(romidepsin)、丙戊酸、flavopiridol、奥罗莫星、抑制剂(roscovitine)、kenpaullone、AG-024322(Pfizer)、海洋活性生物碱(fascaplysin)、ryuvidine、purvalanol A、NU2058、BML-259、SU 9516、PD-0332991、P276–00、格尔德霉素、tanespimycin、阿螺旋霉素、根赤壳菌素、鱼藤素、BIIB021、顺式咪唑啉、苯并二氮杂二酮、螺环羟吲哚、异喹啉酮、噻吩、5-去氮杂黄素、色胺、氨基吡啶、二氨基嘧啶、吡啶并异喹啉、吡咯并吡唑、吲哚并咔唑、吡咯并嘧啶、二苯胺嘧啶、苯甲酰胺、二氮杂萘酮、三环吲哚、苯并咪唑、吲唑、吡咯并咔唑、异吲哚啉酮、吗啉基蒽环霉素、美登木素生物碱、ducarmycin、奥利斯达汀、卡利奇霉素(DNA损伤剂)、α-鹅膏菌素(RNA聚合酶II抑制剂)、辛坦霉素、吡咯苯并二氮杂卓、链黑菌素、氮芥、亚硝基脲、烷基磺酸盐、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素类药剂和其任何组合。

根据本公开可使用的活性剂不限于上面列举的那些药物类别或特定药剂。不同的探索平台不断产生针对癌细胞独特分子特征的新药剂；事实上，已经发现了数以千计的这种化学和生物药物，这里只列出了其中的一些。然而，根据本公开中的发现，完整的、衍生自细菌的小细胞和杀伤的细菌细胞适应各种亲水或疏水活性剂的封装的出人意料的能力意味着当封装在小细胞中时，基本上任何这种药物都有治疗癌症的潜力。

抗肿瘤剂示例性类别是放射性核素、化疗药和功能性核酸，包括但不限于调节性RNA。下面进一步讨论该类的成员。

1.放射性核素

在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与作为放射性核素的抗肿瘤剂组合施用。“放射性核素”是具有不稳定核的原子，即，其特征在于将可利用的过量能量赋予原子核内新产生的辐射粒子或原子电子。本文中的放射性核素也可称为“放射性同位素”、“放射成像剂”或“放射性标志物”。放射性核素可用于成像和/或治疗目的。在一些实施方式中，使用完整的、衍生自细菌的小细胞施用放射性核素。它们可以包含在小细胞内或连接到本文所述小细胞外表面上的配体、肽或糖脂。连接可以直接或通过接头进行，可以使用包含螯合部分的接头，螯合部分包括螯合剂，例如巯基乙酰基三甘氨酸(MAG3)、DOTA、EDTA、HYNIC、DTPA或冠醚。螯合剂可以直接连接到小细胞表面组分或通过接头连接到小细胞。许多放射性核素在本领域中是已知的，并且其中一些已知适用于医学用途，比如钇-90、锝-99m、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铷-82、铊-201、镓-67、氟-18、氙-133和铟-111。

因此，在一些实施方式中，放射性同位素包括选自钇-90、钇-86、铽-152、铽-155、铽-149、铽-161、锝-99m、碘-123、碘-131、铷-82、铊-201、镓-67、氟-18、铜-64、镓-68、氙-133、铟-111、镥-177和其任何组合的放射性同位素。

可用于连接小细胞以用于成像和治疗目的的放射性同位素包括，例如，碘-131和镥-177，其为γ和β发射体。因此，这些药剂可用于成像和治疗。

同一种元素的不同同位素，例如碘123(γ发射体)和碘131(γ和β发射体)，也可用于成像和治疗目的(Gerard和Cavalieri，2002年；Alzahrani等人，2012)。

较新的实例是钇-86/钇-90或铽同位素(Tb)：¹⁵²Tb(β加发射体)、¹⁵⁵Tb(γ发射体)、¹⁴⁹Tb(α发射体)和¹⁶¹Tb(β减粒子)(Müller等人，2012；Walrand等人，2015)。

核成像利用γ和正电子发射体(β+)。γ发射体，比如锝-99m(^99mTc)或碘-123(¹²³I)，可以使用γ相机(平面成像)或SPECT(单光子发射计算机断层扫描)(Holman和Tumeh，1990)进行定位。

这些粒子的组织穿透力与放射性同位素的能量成正比(Kramer-Marek和Capala，2012年)。β粒子具有潜在的杀细胞作用，但由于其组织穿透力仅为几毫米，因此它们也不会伤害周围的健康组织。常规核肿瘤学实践中常用的β发射体包括镥-177(¹⁷⁷Lu，组织穿透：0.5–0.6mm，最大值：2mm，497keV，半衰期：6.7天)和钇-90(⁹⁰Y，组织穿透：平均2.5mm，最大值：11mm，935keV，半衰期：64小时)(Teunissen等人，2005；Kwekkeboom等人，2008；Ahmadzadehfar等人，2010；Pillai等人，2013；Ahmadzadehfar等人，2016)。

放射性核素已广泛用于核医学，特别是作为用于破坏肿瘤细胞的β射线发射体。在一些实施方式中，放射性核素适合用作抗肿瘤剂。

放射性核素可以通过任何已知技术与完整的、衍生自细菌的小细胞结合。因此，蛋白质或其他小细胞表面部分(见下文)可以用放射性核素标记，使用可商购的标记方式，比如使用在Rice等人，Semin.Nucl.Med.,41,265-282(2011)中详述的皮尔斯碘化剂，皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology Inc.)(罗克福德，伊利诺伊州)的产品。可选地，放射性核素可以掺入小细胞内的蛋白质中。

在后一种情况下，用编码外源蛋白的质粒DNA转化产生小细胞的细菌菌株。当在不对称细胞分裂过程中形成小细胞时，质粒DNA的几个拷贝分离到小细胞细胞质中。在放射性标记氨基酸的存在下，所得重组小细胞在小细胞内表达的来自质粒DNA的外源蛋白结合到携带放射性核素的氨基酸中的条件下温育。例如，根据Clark-Curtiss和Curtiss，MethodsEnzymol.，101：347-362(1983)的协议，重组小细胞在含有^35S甲硫氨酸的基本生长培养基中培养，由此新表达的、质粒编码的蛋白质并入^35S甲硫氨酸。可以使用类似的方法，以便根据需要将重组小细胞与其他放射性标记一起封装。

小细胞表面上的寡糖也可以使用例如由Fukuda,Curr.Protocols Molec.Biol.(增刊26),17.5.1-17.5.8(1994)描述的完善的方案进行放射性标记。小细胞特有的这种寡糖的实例是在衍生自革兰氏阴性菌的小细胞表面上发现的脂多糖(LPS)的O-多糖组分(见下文)。

在这方面的优选方法是放射性标记用作肿瘤靶向配体的双特异性抗体，该配体用于将小细胞靶向特定肿瘤。参见美国专利公开2007/0237744，其内容通过引用并入本文。也就是说，“包被”在小细胞上的双特异性抗体暴露了大量额外的表面蛋白用于放射性标记。因此，有可能实现与抗体包被的小细胞相关联的放射性标志物的更高比活性。相比之下，未包被的小细胞的放射性标记，即当放射性核素仅标记特有部分时，会导致标记较弱(比活性较低)。在一个实施方式中，认为发生这种较弱的标记是因为衍生自革兰氏阴性菌的小细胞的外膜相关蛋白被LPS掩蔽，比如下文进一步讨论的，LPS包括覆盖小细胞表面的O-多糖长链。

对于治疗肿瘤，本公开的组合物将以提供一定水平的肿瘤内照射的剂量或多剂量递送，如果该水平不能完全消除肿瘤，至少足以减少肿瘤质量。可以根据具体情况沿这条线监测治疗进展。然而，通常，组合物中封装的放射性量通常在约30至约50Gy量级，尽管本发明还考虑更高量的放射性，诸如例如约50至约200Gy，这给出了约30Gy和约200Gy之间的总体范围。

在某些情况下，考虑到小细胞携带的放射性核素向肿瘤的高效和特异性递送，封装在组合物中的放射性的量甚至可以低于上述量。因此，在一方面，组合物包括约20至约40Gy、或约10至约30Gy、或约1至约20Gy、或小于约10Gy。

一些肿瘤靶向配体可包括放射性同位素，其功能是在配体结合肿瘤细胞时向肿瘤递送放射物。在一些实施方式中，配体包含Arg-Gly-Asp(RGD)肽、铃蟾肽(BBN)/胃泌素释放肽(GRP)、胆囊收缩素(CCK)/胃泌素肽、α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)、神经肽Y(NPY)、神经降压素(NT)、[⁶⁸Ga]Ga-PSMA-HBED-CC([⁶⁸Ga]Ga-PSMA-11[PET])、[¹⁷⁷Lu]Lu/[⁹⁰Y]Y-J591、[¹²³I]I-MIP-1072、[¹³¹I]I-MIP-1095、⁶⁸Ga或¹⁷⁷Lu标记的PSMA-I&T、⁶⁸Ga或¹⁷⁷Lu标记的DKFZ-PSMA-617(PSMA-617)、生长激素抑制素(SST)肽、P物质、T140、肿瘤分子靶向肽1(TMTP1)、血管活性肠肽(VIP)或其任何组合。

在一些实施方式中，放射性同位素与肿瘤靶向配体缀合。在一些实施方式中，缀合是经由接头进行的。在一些实施方式中，肿瘤靶向配体包括包含用于缀合放射性同位素或螯合放射性同位素的螯合剂部分的官能团(一个或多个)的肽。可用于缀合的肽的官能团包括但不限于赖氨酸侧链上的ε-氨基、精氨酸侧链上的胍基、天冬氨酸或谷氨酸上的羧基、半胱氨酸硫醇和酪氨酸上的苯酚。最常见的缀合反应是碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺基(EDC/NHS)介导的羧基和胺偶联、马来酰亚胺与硫醇基团的缀合以及苯酚在酪氨酸上的重氮改性。可以在许多文献中找到将肽与成像部分偶联的代表性化学物质(Erathodiyil和Ying，2011年；Takahashi等人，2008年)。

在一些实施例中，放射性同位素起到放射成像剂的作用。几种放射性同位素已用于肽标记，包括用于SPECT成像的^99mTc、¹²³I，和¹¹¹In，以及用于PET成像的¹⁸F、⁶⁴Cu和⁶⁸Ga(Chatalic等人，2015)。通常，这些放射性同位素经由螯合剂连接到肽上。(Sun等人，2017)中描述了一些广泛使用的螯合剂。大多数治疗性放射性药物都标有β-发射同位素(β-)。

靶向肿瘤细胞的本发明的小细胞还将来自放射性同位素的靶向放射递送到小细胞所结合的肿瘤细胞。在一些实施方式中，放射性同位素用作治疗性放射发射剂，并且其中由放射性同位素提供的放射量足以提供对肿瘤的治疗效果。在一些实施方式中，治疗效果是肿瘤尺寸的减小。肿瘤尺寸可减小约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。

放射性标记的膦酸盐具有高骨亲和力，并且可用于疼痛性骨转移的成像和缓解(palliation)。根据骨代谢的程度，示踪剂经由粘附在骨骼上，并且优选地粘附在成骨细胞骨转移瘤上积累。治疗计划需要使用锝-99m-羟亚乙基二膦酸盐(HEDP)进行骨闪烁扫描，以估计代谢和转移参与程度。双膦酸盐HEDP可以用铼186(β-发射体，半衰期：89小时，1.1MeV最大能量，最大范围：4.6mm)或铼188(β发射体[至85％，2.1MeV])和γ发射体[至15％，155keV]，半衰期：16.8小时，在软组织中的最大射程：10mm)标记以用于治疗(Palmedo，2007年)。用于骨缓解治疗的新型放射性药物包括放射性标记的唑来膦酸复合物。唑来膦酸属于具有环状侧链的新型、最有效的一代双膦酸盐。用钪46或镥177标记的唑来膦酸的骨亲和力显示出极好的摄取([177Lu]Lu-唑来膦酸盐为98％，[46Sc]Sc-唑来膦酸盐为82％)，这远高于用钐-153标记的双膦酸盐(最大值：67％)(Majkowska等人，2009)。这些双膦酸盐可以与完整的小细胞缀合，用于骨转移的诊断或治疗。

2.化疗药

在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与作为化疗药的抗肿瘤剂组合施用。在本说明书中，“化疗药(chemotherapeutic drug)”、“化疗剂(chemotherapeutic agent)”和“化疗(chemotherapy)”可互换使用，以表示具有杀伤或破坏肿瘤细胞能力的药物。化疗剂可以是小分子药物或生物药物，如下文进一步详述的。在一些实施方式中，使用完整的、衍生自细菌的小细胞施用化疗药。

“小分子药物”子类别包括具有以下特征的化合物：(i)对生物过程的影响和(ii)与蛋白质或聚合物大分子相比具有低分子量。小分子药物通常约为800道尔顿或更少，下限约为150道尔顿，如(替莫唑胺)所示约为194道尔顿，用于治疗胶质母细胞瘤和其他类型的脑癌。在此上下文中，“约”表示合格的分子量值受测量精度的变化和几道尔顿或几十道尔顿量级的实验误差的影响。因此，小分子药物可以具有约900道尔顿或更小、约800道尔顿或更小、约700道尔顿或更小、约600道尔顿或更小、约500道尔顿或更小、或约400道尔顿或更小的分子量，例如，在约150至约400道尔顿的范围内。更具体地，小分子药物可以具有约400道尔顿或更大、约450道尔顿或更大、约500道尔顿或更大、约550道尔顿或更大、约600道尔顿或更大、约650道尔顿或更大、约700道尔顿或更大、或约750道尔顿或更大的分子量。在另一个实施方式中，封装到小细胞中的小分子药物具有约400和约900道尔顿在之间、在约450和约900道尔顿之间、在约450和约850道尔顿之间、在约450和约800道尔顿之间、在约500和约800道尔顿之间或在约550和约750道尔顿之间的分子量。

具体地，合适的小分子药物包括但不限于上面列出的那些，比如氮芥、亚硝基脲、乙亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱和拓扑异构酶抑制剂等。因此，用于本发明的小分子药物可选自下述任一种，等等：烯二炔，比如达内霉素(dynemicin)A、单卡霉素(unicalamycin)、卡利奇霉素γ1和卡利奇霉素-θ-1；meayamicin、FR901464的合成类似物；Tanpure等人，Bioorg.Med.Chem.,21:8019-32(2013)中所描述的benzosuberene衍生物；奥利斯达汀(auristatins)，比如奥利斯达汀E、单甲基奥利斯达汀E(MMAE)和奥利斯达汀F、其为多拉司他汀的合成类似物；duocarmysins比如多霉素SA和CC-1065；美登素和其衍生物(美登木素生物碱)，比如DM1和DM4；伊立替康和其他拓扑异构酶抑制剂，比如拓扑替康、依托泊苷、米托蒽醌和替尼泊苷；和古田霉素，其合成由Okano等人，2006详述。

更具体地，本文详述的任何一种或多种或所有特定小分子药物举例说明了适用于本发明的那些：放线菌素-D、苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷、阿那曲唑、卡莫司汀、比卡鲁胺、比生群、博莱霉素、白消安、卡培他滨碳铂、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙亚胺、依托泊苷、氟脲苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、六甲铵、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、左旋溶肉瘤素、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸二钠、喷司他汀、普卡霉素、甲基苄肼、链脲佐菌素、STI-571、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、噻替派、雷替曲塞、拓扑替康、海硫磷、三甲曲沙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和VP-16。

相比之下，出于本说明的目的，“生物药物”被定义为表示可以通过生物过程产生的任何生物活性大分子，不包括下文讨论的“功能性核酸”，和如上述所定义的按大小有资格作为小分子药物的多肽。因此，“生物药物”子类别不包括小分子药物和功能性核酸子类别，并且也不与其重叠。示例性的生物药物是治疗性蛋白质和抗体，无论是天然的、重组的还是例如使用药物化学和药物设计工具合成制备的。

3.超毒化疗药

某些为化疗目的而设计的分子在临床前或临床试验期间由于不可接受的毒性而失败。本发明人已经表明，将高毒性或“超毒性”化疗药封装在小细胞中，然后全身递送至肿瘤患者，导致药物递送至肿瘤细胞。此外，即使在肿瘤细胞破碎和含药物的细胞质释放到附近的正常组织之后，结果对正常组织也没有毒性。这是因为药物已经与肿瘤细胞结构比如DNA结合，并且不能再攻击正常细胞。因此，本发明特别适用于向癌症患者递送高毒性(“超毒性”)化疗药。因此，在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与抗肿瘤剂组合施用，该抗肿瘤剂为超毒性化疗药。在一些实施方式中，超毒性化疗药使用本文所述的完整的、衍生自细菌的小细胞施用。

当癌症受试者用尽所有治疗选择时，肿瘤可能已达到相当大的异质性阶段，对常规细胞毒性药物具有高度抗性。本说明书中的“高毒性化疗药”或“超毒性化疗药”是指由于对正常细胞的致死剂量相对于对癌细胞的有效剂量相对较低而能够克服对常规药物产生耐药性的化疗药。

因此，在一方面，高毒性化疗药的中位致死剂量(LD₅₀)低于其针对靶向癌症的中位有效剂量(ED₅₀)。例如，高毒性或超毒性化疗药的LD₅₀低于用于靶向癌症的药物的ED₅₀的约500％、约400％、约300％、约250％、约200％、约150％、约120％或约100％。在另一方面，高毒性或超毒性化疗药的最大亚致死剂量(即，不引起严重或不可逆毒性的最高剂量)低于其最低有效剂量，例如，低于最低有效剂量的约500％、约400％、约300％、约250％、约200％、约150％、约120％、约100％、约90％、约80％、约70％、约60％或约50％。在一个实施方式中，靶向癌症可以是，例如，(1)针对其设计该药物的癌症类型，(2)针对该药物进行临床前或临床试验的第一种癌症类型，或(3)在所有测试的癌症中，该药物显示出最高疗效的癌症类型。

超毒性化疗药的说明性、非限制性实例包括但不限于美登木素生物碱、多霉素、吗啉基蒽环霉素及其衍生物。美登木素生物碱(分子量：约738道尔顿)是美登素的一组化学衍生物，具有很强的细胞毒性。尽管认为由于毒性问题对于人类患者使用是不安全的，但是根据本发明，美登木素生物碱适合通过小细胞递送给肿瘤患者。多霉素(分子量：约588道尔顿)是首先从链霉菌属细菌中分离出来的一系列相关的天然产物。它们还具有强大的细胞毒性，但被认为对人类使用不安全。与美登木素生物碱类似，多霉素是适用于本发明的化疗药。

还举例了国际专利申请WO 1998/002446中描述的吗啉基蒽环类衍生物类的化合物。这种衍生物包括奈莫柔比星(3'-脱氨基-3'-[2(S)-甲氧基-4-吗啉基]阿霉素)(MMDX)及其主要代谢物PNU-159682(3'-脱氨基-3”-4'-酐-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基-]阿霉素)，以及美国专利号8,470,984中描述的四种其他这种衍生物，其内容通过引用并入本文：3'-脱氨基-3”-4'-酐-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基]-伊达比星；3’-脱氨基-3”-4’-酐-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基]-柔红霉素；3’-脱氨基-3”-4’-酐-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基]-洋红霉素；和3'-脱氨基-3”-4'-酐-[2”(S)-乙氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基]阿霉素。

在本公开的示例性实施方式中，小细胞包括超毒性化疗药3'-脱氨基-3”,4'-酐-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-氧-4”-吗啉基]阿霉素(PNU-159682)。本发明人发现PNU-159682是一种有效药物，它似乎克服了许多不同肿瘤细胞系中的耐药性，并且在针对许多不同肿瘤细胞系的细胞毒性测定中比一系列常规化疗剂更有效。参见实施例8和9。此外，在体内小鼠异种移植物实验中表明，可以通过静脉内施用靶向EGFR和负载PNU-159682的EDV有效治疗对阿霉素有抗性的人肿瘤异种移植物。参见实施例11。值得注意的是，发现与I型干扰素激动剂组合的负载PNU-159682的EDV具有良好的耐受性并且在晚期胰腺癌患者中提供协同和改善的抗癌效果。参见实施例12。因此，在本发明的一个实施方式中，组合物包括靶向EGFR的小细胞，该小细胞包括作为活性抗癌药物的PNU-159682。

其他可能表现出超毒性化疗特性的合适的癌症化疗药包括奥利斯达汀、卡利奇霉素(DNA损伤剂)、α-鹅膏菌素(RNA聚合酶II抑制剂)、辛坦霉素、格尔德霉素、吡咯苯并二氮杂卓、链黑菌素、氮芥、亚硝基脲、乙亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂和激素类药剂等。

4.生物化疗药

在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与作为生物化疗药的抗肿瘤剂组合施用。这种药物的实例包括但不限于天冬酰胺酶、AIN-457、巴匹珠单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、布雷奴单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达洛妥珠单抗、地诺单抗、依帕珠单抗、estafenatox、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、吉瑞妥昔单抗(WX-G250)、伊莫单抗、伊诺妥珠单抗、伊匹单抗、美泊利单抗、莫罗单抗-CD3、他那莫单抗、奈昔妥木单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法妥木单抗、奥特利昔珠单抗、奥佐米星、帕吉巴昔单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、REGN88、索兰珠单抗、他尼珠单抗、替利珠单抗、替坦、托西莫单抗、曲妥珠单抗 曲美木单抗、维多珠单抗、扎鲁妥木单抗和扎诺木单抗。在一些实施方式中，使用完整的、衍生自细菌的小细胞施用生物化疗药。

5.功能性核酸

在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与功能性核酸组合施用。“功能性核酸”是指在引入宿主细胞后特异性干扰蛋白质表达的核酸分子。在一些实施方式中，使用完整的、衍生自细菌的小细胞施用功能性核酸。对于治疗癌症，优选地，经由完整的、衍生自细菌的小细胞递送至癌细胞的功能性核酸有效载荷抑制促进肿瘤细胞增殖、血管生成或对化疗的耐药性和/或抑制细胞凋亡或细胞周期停滞的基因；即，“促癌基因”。

通常，本公开中使用的功能性核酸分子具有通过与蛋白质的转录体相互作用来降低蛋白质表达的能力。用于本公开的这类小细胞有效载荷包括调控RNA，比如siRNA、shRNA、短RNA(通常长度小于400个碱基)、微RNA(miRNA)、核酶和诱饵RNA、反义核酸和LincRNA，等等。在这点上，“核酶”是指具有酶活性的RNA分子，其可以以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其他RNA分子。“反义寡核苷酸”表示与特定基因转录体的一部分互补的核酸分子，使得该分子可以与转录体杂交并阻断其翻译。反义寡核苷酸可以包括RNA或DNA。“LincRNA”或“长基因间非编码RNA”标题包括长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码转录体。LincRNA可以调节基因的转录、剪接和/或翻译，正如Khalil等人，2009中所讨论的。

每种类型的调节性RNA可以是抑制如上所述的促肿瘤基因的功能性核酸分子的来源，并且因此适合根据本公开使用。因此，在本公开的一个实施方式中，完整的小细胞携带介导转录后、基因沉默RNA干扰(RNAi)机制的siRNA分子，其可用于靶向促肿瘤基因。例如，参见MacDiarmid等人，2009(呈递抗体的小细胞与化疗药一起递送对抗耐药性的siRNA)，以及Oh和Park，Advanced Drug Delivery Rev.，61：850-62(2009)(递送治疗性siRNA以分别治疗乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肺癌和前列腺癌)。

正如所指出的，“siRNA”通常是指长度从大约10到大约30个核苷酸的双链RNA分子，它们以其特异性干扰蛋白质表达的能力而命名。优选地，siRNA分子长约12至约28个核苷酸，更优选地长约15至约25个核苷酸，还更优选地长约19至约23个核苷酸，和最优选地长约21至约23个核苷酸。因此，siRNA分子的长度可以是例如约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28或约29个核苷酸。

一条链的长度表示siRNA分子的长度。例如，被描述为21个核糖核苷酸长(21聚体)的siRNA可以包括两条相对的RNA链，它们退火19个连续碱基对。每条链上剩余的两个核糖核苷酸将形成“悬垂(overhang)”。当siRNA包含两条不同长度的链时，较长的链表示siRNA的长度。例如，包含长21个核苷酸的一条链和长20个核苷酸的第二条链的dsRNA构成21聚体。

帮助设计siRNA和调节性RNA的工具通常很容易获得。例如，基于计算机的siRNA设计工具可在互联网www.dharmacon.com获得。

在另一个优选的实施方式中，本公开的完整小细胞携带miRNA，其与siRNA一样能够介导转录后、基因沉默RNA干扰(RNAi)机制。此外，与siRNA一样，miRNA介导的基因沉默效应可用于靶向促肿瘤基因。例如，参见Kota等人，2009(经由转染递送miRNA导致癌细胞增殖抑制、肿瘤特异性细胞凋亡和对疾病进展的显著保护，而在鼠肝癌模型中无毒性)，以及Takeshita等人，2010(经由瞬时转染递送合成miRNA抑制骨组织上转移性前列腺肿瘤细胞的生长)。

虽然两者都介导RNA干扰，但已经注意到miRNA和siRNA的区别。在这方面，“miRNA”通常是指一类约17至约27个核苷酸的单链RNA分子(而不是siRNA情况下的双链)。因此，miRNA分子的长度可为例如约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26或约27个核苷酸。优选地，miRNA分子的长度为约21至约25个核苷酸。

miRNA和siRNA之间的另一个区别是前者通常不能完全与mRNA靶标互补。相比之下，siRNA必须与mRNA靶标完全互补。因此，siRNA通常导致单个特定靶标的沉默，而miRNA是混杂的。

此外，虽然两者都组装到RISC(RNA诱导的沉默复合物)中，但siRNA和miRNA在RISC组装之前各自的初始加工过程中有所不同。在Chu等人，2006和Gregory等人，2006中详细描述了这些差异。许多数据库用作miRNA存储库。例如，参见miRBase(www.mi rbase.org)和tarbase(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php？r＝tarbase/inde x)。在传统用法中，miRNA通常以前缀“-mir”结合序列号命名。例如，在小鼠mir-352之后发现的新miRNA将被命名为小鼠“mir-353”。同样，帮助设计包括miRNA的调节性RNA的工具很容易获得。在这方面，可在互联网wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl上获得基于计算机的miRNA设计工具。

本发明人发现可以通过靶向小细胞介导的递送至间皮瘤和肾上腺皮质癌细胞来施用miRNA16a。参见实施例7。一旦被癌细胞内在化，miRNA16a就被发现能有效抑制癌细胞增殖。因此，在一些实施方式中，本公开的小细胞包括miRNA16a。其他可用于抑制赘生性细胞增殖的微RNA包括mir-34家族和let-7家族。

如上所述，用于本发明组合物的功能性核酸可以抑制促进肿瘤细胞增殖、血管生成或对化疗的耐药性的基因。被抑制的基因本身也可以抑制细胞凋亡或细胞周期停滞。下面提供了可以被功能性核酸靶向的基因的实例。

本公开的功能性核酸优选地靶向促进耐药性、抑制细胞凋亡或促进肿瘤表型的蛋白质的基因或转录体。本领域已经实现了功能性核酸策略在这些背景下的成功应用，但没有小细胞载体的益处。参见，例如，Sioud,Trends Pharmacol.Sci.,2004；Caplen,ExpertOpin.Biol.Ther.,2003；Nieth等人，2003；Caplen和Mousses,2003；Duxbury等人，2004；Yague等人，2004；和Duan等人，2004。

导致耐药性的蛋白质构成功能性核酸的优选靶标。蛋白质可能有助于获得耐药性或内在耐药性。当病变细胞比如肿瘤细胞最初对药物有反应，但在随后的治疗周期中变得难治时，就会获得耐药表型。与获得的耐药性相关的有用靶标包括ATP结合盒转运蛋白，比如P-糖蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR相关蛋白、多药耐药性蛋白1)、MDR-2和MDR-3。MRP2(多药耐药性相关蛋白)、BCR-ABL(断点簇区--Abelson原癌基因)、STI-571耐药相关蛋白、肺耐药相关蛋白、环氧合酶-2、核因子κ、XRCC1(X-射线交叉互补组1)、ERCC1(切除交叉互补基因)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶)、突变型β-微管蛋白和生长因子比如IL-6是与获得的耐药性相关的额外靶标。

导致耐药性的特别有用的靶标包括ATP结合盒转运蛋白，比如P-糖蛋白、MDR-2、MDR-3、BCRP、APT11a和LRP。有用的靶标还包括促进细胞凋亡抗性的蛋白质。这些包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、Bcl-X_L、A1/Bfl 1、粘着斑激酶、二氢二醇脱氢酶和p53突变蛋白。

有用的靶标还包括致癌和突变的肿瘤抑制蛋白。这些中的示例是β-连环蛋白、PKC-α(蛋白激酶C)、C-RAF、K-Ras(V12)、DP97 Dead盒RNA解旋酶、DNMT1(DNA甲基转移酶1)、FLIP(Flice-样抑制蛋白)、C-Sfc、53BPI、多梳组蛋白EZH2(zeste同系物的增强子)、ErbB1、HPV-16E5和E7(人乳头瘤病毒早期5和早期7)、Fortilin&MCI1P(髓样细胞白血病1蛋白)、DIP13α(DDC相互作用蛋白13a)、MBD2(甲基CpG结合结构域)、p21、KLF4(Kruppel-样因子4)、tpt/TCTP(翻译控制的肿瘤蛋白)、SPK1和SPK2(鞘氨醇激酶)、P300、PLK1(Polo-样激酶-1)、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF(血管内皮生长因子)、BAG-1(BCL2-相关的永生基因1)、MRP2、BCR-ABL、STI-571抗性-相关的蛋白质、肺耐药相关蛋白、环氧合酶-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突变体-β-微管蛋白和生长因子。

也可用作靶标的是全局调节元件，例如细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白(CEPB)。例如，CEPB4在胶质母细胞瘤和胰腺癌中过度表达，在此该蛋白质激活几百个与肿瘤生长相关的基因，但在健康细胞中未检测到(Oritz-Zapate等人，2011)。因此，根据本描述，胶质母细胞瘤的治疗可以经由施用包含完整的、衍生自细菌的小细胞的组合物来实现，该小细胞包括对抗CEPB4过度表达的试剂，例如通过肿瘤细胞破坏CEPB4表达的siRNA或其他功能性核酸分子。

功能性核酸的有用靶标的另一个实例包括复制蛋白A(RPA)，由70-kDa(RPA1)、32-kDa(RPA2)和14-kDa(RPA3)亚基组成的三聚体复合物，其对所有生物体的DNA复制至关重要。Iftode等人，1999。

其他有用的靶标是那些对有丝分裂和维持基因组稳定性很重要的靶标。实例包括在广泛的癌细胞中过度表达的Polo-样激酶(PLK1)。本公开的发明人还发现抑制Plk1(siPlk1)表达的siRNA抑制间皮瘤和肾上腺皮质癌细胞的增殖。因此，在一些实施方式中，本公开的小细胞包括Plk1。

其他有用的靶标是那些参与DNA复制和修复的靶标。实例包括核糖核苷酸还原酶(RR)，它是癌症的潜在治疗靶标，因为它催化核糖核苷5'-二磷酸转化为其相应的2'-脱氧核糖核苷5'-三磷酸，这是DNA复制和修复所必需的。参见D’Angiolella等人，2012。人类RR包含两个亚基RRM1和RRM2，并且靶向这两个亚基的功能性核酸可用于本发明。本公开的发明人表明，靶向RRM1(siRRM1)的siRNA在与小细胞一起递送时有效抑制间皮瘤和肾上腺皮质癌细胞增殖。参见实施例10。因此，在一些实施例中，小细胞包括抑制核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)表达的siRNA。

6.其他抗肿瘤疗法

可用于用包括本公开的CD1d-限制性iNKT抗原的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞施用的抗肿瘤疗法还包括诱导癌细胞死亡的非药物疗法，比如放射疗法、外科手术方法、过继性细胞疗法、酶前体药物疗法和基于微生物的抗肿瘤疗法。

例如，在一些实施方式中，本公开的包封的CD1d-限制性iNKT抗原与抗肿瘤疗法组合施用，包括但不限于靶向放射疗法、立体定向放射、光动力疗法、微波热消融、冷冻消融、高强度超声、射频消融、激光束照射、射波刀和热疗肿瘤治疗。

在一些实施方式中，本公开的包封的CD1d-限制性iNKT抗原与抗肿瘤前药疗法组合施用，包括但不限于定向酶前药疗法(DEPT)、抗体定向酶前药疗法(ADEPT)、基因定向酶前药疗法(GDEPT)、病毒定向酶前药疗法(VDEPT)、聚合物定向酶前药疗法(PDEPT)和梭菌定向酶前药疗法(CDEPT)。

在一些实施方式中，本公开的包封的CD1d-限制性iNKT抗原与诱导癌细胞死亡的过继细胞疗法比如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法组合施用。在一些实施方式中，CAR T细胞包括针对肿瘤抗原的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，CAR T细胞包括嵌合抗原受体，其针对α-叶酸受体、B-细胞成熟抗原(BCMA)、羧酸酐酶-IX(CAIX)、癌胚抗原(CEA)、CD22、CD19、CD30、CD133、CLL-1、双唾液酸神经节苷脂(GD2)、EPH受体A2(EphA2)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、肝细胞生长因子受体(c-Met)、人表皮生长因子受体-2(HER2)、IL13Rα2、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、间皮蛋白、粘蛋白(MUC-1)、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)或血管内皮生长因子受体(VEGFR)。在一些实施方式中，本公开的包封的CD1d-限制性iNKT抗原与免疫检查点疗法比如抗PD-1/PD-L1或抗CTLA-4抗体疗法组合施用。在一些实施方式中，CAR T细胞包括抗PD-1/PD-L1或抗CTLA-4抗体。

在一些实施方式中，除了上述一种或多种抗肿瘤剂之外，还施用非药物抗肿瘤疗法。抗肿瘤剂和疗法的任何组合都适合与公开的包封的CD1d-限制性iNKT抗原一起施用，条件是抗肿瘤剂和/或疗法实现癌细胞的死亡。

III.CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂的包封

本公开的CD1d-限制性iNKT抗原可以通过使用可以被巨噬细胞和/或树突细胞摄取的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞包封抗原而有效地递送至吞噬细胞。

在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT抗原与例如同样使用完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞包封的抗肿瘤剂组合施用。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT抗原与抗肿瘤剂组合施用，其中CD1d-限制性抗原和抗肿瘤剂都被包封在完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性抗原和抗肿瘤剂被包封在同一个小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性抗原和抗肿瘤剂被包封在单独的小细胞或杀伤的细菌细胞中。在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性抗原与未包封的抗肿瘤剂一起施用。

A.完整的、衍生自细菌的小细胞

本文使用的术语“小细胞”是指没有染色体(“无染色体”)并且是由二元裂变期间细胞分裂与DNA分离的协调紊乱产生的细菌细胞的衍生物。小细胞不同于其他小囊泡，比如所谓的“膜泡(membrane bleb)”(大小约为0.2μm或更小)，它们在某些情况下自发产生和释放，但不是由于特定的遗传重排或游离基因表达。出于同样的原因，完整的小细胞不同于细菌菌影，它们不是由于特定的基因重排或游离基因表达而产生的。本公开中使用的衍生自细菌的小细胞是完全完整的，并且因此区别于特征在于外膜或限定膜被破坏或降解、甚至去除的其他无染色体形式的细菌细胞衍生物。参见美国专利第7,183,105号第111栏，第54行等。表征本公开的小细胞的完整膜允许将治疗有效载荷保留在小细胞内，直到摄取后有效载荷在吞噬细胞或肿瘤细胞内被释放。

小细胞或EDV是由于控制正常细菌细胞分裂的基因失活，从而去抑制细胞的极性位点而产生的无核、无生命的纳米粒子。Ma等人，2004。去抑制意味着细菌在中心和两极分裂；极性分裂产生本公开的发明人已经展示的可以用作允许有效封装一系列不同化疗药的防漏、微储库载体的小细胞。此外，与目前例如每个颗粒只能封装约14,000个分子的隐形脂质体药物载体比如DOXIL(脂质体阿霉素)(Park等人，2002年)，或可携带少于5个药物分子的“武装抗体”相比，EDV可以轻松容纳多达100万个药物分子的有效载荷。此外，EDV可以使用双特异性抗体靶向癌细胞表面上过度表达的受体，参见下文D部分，这允许在体外和体内高度显著的肿瘤生长抑制和/或消退。

用于本发明的小细胞可以从细菌细胞制备，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。原核染色体复制与正常的二元裂变有关，后者涉及中细胞隔膜的形成。例如，在大肠杆菌中，最小基因比如minCD的突变可以消除细胞分裂过程中对细胞两极隔膜形成的抑制，从而产生正常的子细胞和无染色体的小细胞。参见de Boer等人，1992；Raskin&de Boer，1999；Hu&Lutkenhaus,1999；Harry，2001。

除了最小操纵子突变之外，在一系列影响隔膜形成的其他遗传重排或突变之后，例如在枯草芽孢杆菌的divIVB1中，也会产生无染色体的小细胞。参见Reeve和Cornett，1975。小细胞也可以在参与细胞分裂/染色体分离的蛋白质的基因表达水平发生扰动后形成。例如，minE的过度表达会导致极性分裂和小细胞的产生。类似地，染色体隔离缺陷可能导致少染色体的小细胞，所述缺陷例如枯草芽孢杆菌中的smc突变(Britton等人，1998)、枯草芽孢杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人，1994)、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人，1989)，以及大肠杆菌中的parC突变(Stewart和D'Ari，199))。此外，CafA可以提高细胞分裂速度和/或抑制复制后的染色体分配(Okada等人，1994)，导致形成链状细胞和少染色体的小细胞。

因此，由于这些细菌中细菌细胞分裂的保守性质，可以由任何细菌细胞制备用于本公开的小细胞，无论是革兰氏阳性来源的还是革兰氏阴性来源的。此外，本公开中使用的小细胞应具有如上所述的完整的细胞壁(即“完整的小细胞”)，并且应与其他小囊泡(比如膜泡)区分开来，这些小囊泡不能归因于特定的基因重排或游离基因表达。

在给定的实施方式中，小细胞的亲本(来源)细菌可以是革兰氏阳性的，或者它们可以是革兰氏阴性的。一方面，亲本细菌是选自Terra-/Glidobacteria(BV1)、变形菌门(BV2)、包括螺旋体属的BV4、鞘脂杆菌门和Planctobacteria的一种或多种。根据另一方面，细菌是选自厚壁菌门(BV3)例如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌或软壁菌门/柔膜菌纲或放线菌(BV5)例如放线菌门或双歧杆菌中的一种或多种。

根据本发明，杀伤的细菌细胞是细菌、蓝藻细菌、真细菌和古细菌的无生命原核细胞，比如Bergey's Manual Of Systematic Biology第2版中所定义。如果这种细胞具有完整的细胞壁和/或细胞膜并含有细菌种群内源性的遗传物质(核酸)，则认为它们是“完整的”。例如，在美国2008/0038296中描述了制备杀伤的细菌细胞的方法。

在又一个方面，细菌是选自嗜热菌(绿弯菌门、奇异球菌-栖热菌)、蓝藻细菌、嗜热脱硫菌、嗜热菌(产水菌门、热袍菌门)、α、β、γ(肠杆菌科)、δ或ε变形菌门、螺旋体属、纤维杆菌门、绿菌门/拟杆菌、衣原体/疣微菌门、浮霉菌门、酸杆菌门、产金菌纲、脱铁杆菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、互养菌门、网团菌门、黏胶球形菌纲芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、李斯特氏菌科、葡萄球菌科、乳杆菌、肠球菌科、乳杆菌科、明串珠菌科、链球菌科、梭菌目、嗜盐菌目、热厌氧菌目、支原体目、虫原体目、无浆菌目、无胆浆菌目、盐浆菌目、放线菌科、放线菌科、棒状杆菌科、诺卡氏菌科、棒状杆菌科、弗兰克氏菌科、乳杆菌科、乳杆菌科、乳杆菌科的一种或多种。

对于药物用途，本公开的组合物应包含尽可能彻底地与免疫原性成分和其他有毒污染物分离的小细胞或杀伤的细菌细胞。例如在WO 2004/113507中描述了纯化衍生自细菌的小细胞以去除游离内毒素和亲本细菌细胞的方法。简而言之，纯化过程实现了以下的去除：(a)较小的囊泡，比如通常小于0.2μm的膜泡，(b)从细胞膜释放的游离内毒素，以及(c)亲本细菌，无论是活的还是死的，以及它们的碎片，它们也是游离内毒素的来源。可以使用0.2μm过滤器去除较小的囊泡和细胞碎片，使用0.45μm过滤器在诱导亲代细胞形成细丝后去除亲代细胞，使用抗生素杀伤活细菌细胞，以及针对游离内毒素的抗体，等等，执行这种去除。

本发明人在纯化过程的基础上发现，尽管它们的细菌来源不同，但是所有完整的小细胞的大小都约为400nm，即大于膜泡和其他更小的囊泡，但小于亲本细菌。小细胞的尺寸测定可以通过使用基于固态的技术比如电子显微镜或基于液体的技术比如动态光散射来完成。每种这样的技术产生的大小值可能具有误差范围，并且在不同技术中这些值可能有所不同。因此，可以通过电子显微镜测量干燥状态下小细胞的大小为约400nm±50nm。动态光散射可以测量同一个小细胞的大小约为500nm±50nm。此外，可以再次使用动态光散射测量药物封装的配体靶向的小细胞约为400nm至600nm±50nm。

这种大小值的分散在实践中很容易适应例如如上所述地从免疫原性成分和其他有毒污染物中分离小细胞的目的。即，完整的、衍生自细菌的小细胞的特征是细胞质被刚性膜包围，这使小细胞具有刚性的球形结构。这种结构在透射电子显微照片中很明显，其中在刚性膜的外部界限之间测量了穿过小细胞的小细胞直径。该测量提供了400nm±50nm的上述尺寸值。

衍生自革兰氏阴性菌的杀伤的细菌细胞或小细胞的另一个结构要素是经由脂质A锚嵌入外膜中的脂多糖(LPS)的O-多糖组分。该组分是一连串重复的碳水化合物残基单元，每个链的重复单元有多达70到100个重复单元，每个重复单元具有4到5个糖。因为这些链在液体环境中不是刚性的，就像在体内一样，它们可以采用波浪形的、柔性的结构，呈现珊瑚海环境中的海草的一般外观；即，链随液体移动，同时保持锚定在小细胞膜上。

受O-多糖组分的影响，动态光散射可以提供如上所述的约500nm至约600nm的小细胞尺寸值。然而，衍生自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的小细胞很容易通过0.45μm过滤器，这证实了400nm±50nm的有效小细胞尺寸。上述尺寸的分散也包括在本发明中，并且特别地，在短语“尺寸大约为400nm”等中由修饰语“约”来表示。

关于有毒污染物，本公开的组合物优选地包括小于约350EU游离内毒素。在这方面的示例是约250EU或更少、约200EU或更少、约150EU或更少、约100EU或更少、约90EU或更少、约80EU或更少、约70EU或更少、约60EU或更少、约50EU或更少、约40EU或更少、约30EU或更少、约20EU或更少、约15EU或更少、约10EU或更少、约9EU或更少、约8EU或更少、约7EU或更少、约6EU或更少、约5EU或更少、约4EU或更少、约3EU或更少、约2EU或更少、约1EU或更少、约0.9EU或更少、约0.8EU或更少、约0.7EU或更少、约0.6EU或更少、约0.5EU或更少、约0.4EU或更少、约0.3EU或更少、约0.2EU或更少、约0.1EU或更少、约0.05EU或更少或者约0.01EU或更少的游离内毒素水平。

本公开容的组合物还可以包括至少约10⁹个小细胞或杀伤的细菌细胞，例如，至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约5×10⁹或至少8×10⁹。在一些实施方式中，组合物包括不大于约10¹¹个小细胞或杀伤的细菌细胞，例如，不大于约1×10¹¹或不大于约9×10¹⁰，或不大于约8×10¹⁰。

1.将活性剂装载到小细胞或杀伤的细菌细胞中

活性剂比如CD1d-限制性iNKT细胞抗原，或抗肿瘤剂比如小分子药物、蛋白质和功能性核酸，可以通过将多个完整的小细胞与活性剂在缓冲液中共温育直接封装到小细胞中。缓冲液的组成可以根据本领域众所周知的条件而变化，以优化完整小细胞中活性剂的装载。适用于装载的示例性缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。封装后，活性剂保留在小细胞内并防止降解。

活性剂，例如可以由核酸编码的功能性核酸或蛋白质，可以通过将编码活性剂的载体(比如质粒)转化到亲本细菌细胞中而引入小细胞中。当由亲本细菌细胞形成小细胞时，小细胞保留质粒和/或表达产物、抗肿瘤剂的某些拷贝。WO 2003/033519提供了将产品封装和表达到小细胞中的更多细节，其内容通过引用以其整体并入本公开。

WO 2003/033519中提供的数据证明，例如，携带哺乳动物基因表达质粒的重组小细胞可以递送至吞噬细胞和非吞噬细胞。WO 2003/033519还描述了用游离基因复制质粒DNA上携带的异源核酸对产生小细胞的亲本细菌菌株进行遗传转化。在分离亲本细菌和小细胞后，一些游离DNA分离到小细胞中。由此产生的重组小细胞很容易被哺乳动物吞噬细胞吞噬，并在细胞内吞噬溶酶体中降解。此外，一些重组DNA逃脱了吞噬溶酶体膜并被转运到哺乳动物细胞核，在该细胞核中表达重组基因。

在其他实施方式中，针对不同mRNA靶标的多种核酸可以封装在同一个小细胞中。这种方法可用于对抗耐药性和细胞凋亡抗性。例如，癌症患者通常表现出对化疗药的抗性。这种抗性可以通过基因，比如多药抗性(MDR)泵和抗凋亡基因等的过度表达来介导。为了对抗这种耐药性，可以将小细胞与治疗显著浓度的针对MDR相关基因的功能性核酸进行封装，并在化疗前施用至患者。此外，将针对不同mRNA靶标的多功能核酸封装到同一个小细胞中可以提高治疗成功率，因为大多数分子靶标都会发生突变并具有多个等位基因。在WO2009/027830中提供了将核酸直接封装到小细胞中的更多细节，其内容通过引用以其整体并入本公开中。

小分子药物，无论是亲水的还是疏水的，都可以通过在包括小细胞的细胞外媒介和小细胞细胞质之间产生药物的浓度梯度来封装在小细胞中。当细胞外媒介包括比小细胞细胞质更高的药物浓度时，药物自然地沿着该浓度梯度向下移动到小细胞细胞质中。然而，当浓度梯度反转时，药物不会移出小细胞。例如，在美国专利申请公开号2008/0051469中可以找到关于药物装载过程及其出人意料的性质的更多细节，其内容通过引用明确并入。

为了用通常不溶于水的药物来装载小细胞，最初可以将药物溶解在适当的溶剂中。例如，可以将紫杉醇溶解在乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(cremophore EL)(聚乙氧基化蓖麻油(polyethoxylated castor oil))的1:1混合物中，然后在PBS中稀释以获得在水性媒介中部分稀释并携带最少量有机溶剂的紫杉醇溶液，以确保药物保持在溶液中。小细胞可在该最终媒介中培养以进行药物装载。因此，发明人发现即使是疏水性药物也可以扩散到小细胞的细胞质或膜中以实现高的且治疗上显著的细胞质药物装载。这是出乎意料的，因为小细胞膜由疏水性磷脂双层组成，预计会阻止疏水性分子扩散到细胞质中。已显示多种代表性小分子药物装载到小细胞中，说明了不同的大小和化学性质：阿霉素、紫杉醇、氟紫杉醇、顺铂、长春花碱、monsatrol、胸苷酸合酶(TS)抑制剂OSI-7904、伊立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨和碳铂。此外，总体而言，所得的小分子药物封装小细胞在体外和体内均显示出显著的抗肿瘤功效。

2.将小细胞靶向特定哺乳动物细胞和肿瘤

发明人发现肿瘤细胞周围的血管表现出完整性的丧失；也就是说，即使在血脑屏障(BBB)环境中，血管也有大的开窗(fenestration)并且“渗漏(leaky)”。当癌细胞建立时，它们会分泌促进新血管形成的物质——这一过程称为血管生成。这些血管生长迅速，与正常血管不同，它们会渗漏，有50nm至1.2μm(高渗透性脉管系统)的“孔洞”(开窗)。目前认为药物递送颗粒比如脂质体通过被动过程实现肿瘤靶向，该过程涉及从支持肿瘤微环境的渗漏脉管系统的外渗。Hobbs等人，1998。虽然已经表明异常肿瘤微环境的特征在于间质性高血压，并且这种现象可能会限制抗癌抗体疗法的使用，但这似乎不是一个绝对的障碍，例如免疫脂质体(Nielsen等人，2002)和与量子点偶联的抗体(Gao等人，2004)。这种现象也适用于EDV，它具有携带特异性定向肿瘤抗体的额外优势。静脉注射后，EDV渗入肿瘤微环境中，并且然后经由癌细胞表面受体参与和内吞作用进行主动靶向。因此，与传统理解相反，与小细胞一样大，即比上面讨论的BBB的一致孔径限制大得多的颗粒然而仍小于渗漏脉管壁中的开窗；因此，它们可以通过这些开窗被动地渗入肿瘤微环境。

进入肿瘤微环境后，小细胞能够触发宿主肿瘤细胞的大胞饮或受体介导的内在化并被它们摄取。因此，封装有抗肿瘤剂的小细胞会将药物释放到肿瘤细胞的细胞质中，将肿瘤细胞杀伤。

根据本公开的另一方面，可以经由配体将含有抗肿瘤剂和/或CD1d-限制性iNKT细胞抗原的小细胞或杀伤的细菌细胞导向靶标哺乳动物肿瘤细胞。在一些实施方式中，配体是“双特异性的”。也就是说，配体对小细胞和哺乳动物(肿瘤)细胞成分均表现出特异性，从而使给定的囊泡与靶细胞结合，从而后者吞噬前者。WO2005/056749和WO2005/079854中进一步描述了双特异性配体将小细胞靶向肿瘤细胞的用途，并且在美国专利号8,591,862中进一步描述了双特异性配体将杀伤的细菌细胞靶向肿瘤细胞的用途。一旦这样的配体附着到囊泡上，配体的未被占据的特异性(“单特异性”)就一直存在，直到它与靶标(肿瘤)哺乳动物细胞相互作用。许多靶向肿瘤的配体是本领域已知的(Hong等人，2011；Hoelder等人，2012年；Galluzzi等人，2013年)。几种肽，比如生长激素抑制素(SST)肽、血管活性肠肽(VIP)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽和铃蟾肽/胃泌素释放肽(BBN/GRP)已成功表征用于肿瘤受体成像(De Jong等人，2009年；Tweedle，2009年；Schottelius和Wester 2009年；Igarashi等人，2011年；Laverman等人，2012年)。

肿瘤靶向肽序列主要可以通过三种不同的方式进行选择：(1)从天然蛋白质中衍生(Nagpal等人，2011)；(2)化学合成和基于结构的合理工程(Andersson et al.，2000；Merrifield，2006)；(3)肽库的筛选(Gray和Brown 2013)。在这些方法中，噬菌体展示技术是一种常规但应用最广泛的方法，具有许多优点，例如易于处理并且可以有效筛选大量不同的肽(Deutscher，2010)。

在肿瘤细胞而非正常细胞上过度表达的受体是体内肿瘤成像的绝佳候选者。迄今为止，已经鉴定了多种肿瘤靶向肽及其类似物，如下所述。

Arg-Gly-Asp(RGD)肽——RGD特异性结合整联蛋白受体(Ruoslahti，1996)。整联蛋白构成两个亚基(α和β亚基)。整联蛋白家族，尤其是αVβ3，与肿瘤血管生成和转移有关。它们在血管生成过程中在内皮细胞上过度表达，但在大多数正常器官中几乎检测不到。因此，它们被广泛用于诊断成像。

铃蟾肽(BBN)/胃泌素释放肽(GRP)——两栖动物BBN及其相关肽由一系列神经肽组成，表现出各种生理作用，比如外分泌和内分泌分泌物、体温调节、蔗糖调节以及细胞生长(Ohki-Hamazaki等人，2005年)。铃蟾肽-样受体有4个亚型：神经调节肽B受体、铃蟾肽3受体、GRP受体和铃蟾肽4受体。这些受体在多种肿瘤，比如乳腺癌、卵巢癌和胃肠道间质瘤中过度表达。

胆囊收缩素(CCK)/胃泌素肽——CCK和胃泌素是结构和功能相似的肽，它们在胃肠道和中枢神经系统中发挥多种生理作用(Matsuno等人，1997)。已经鉴定了CCK的3种受体类型(CCK1、CCK2和CCK2i4sv)，其均属于GPCR超家族。其中CCK2/胃泌素受体在人类癌症比如间质卵巢癌和星形细胞瘤中频繁地被发现。

α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)——α-MSH是直链十三肽，主要负责皮肤色素沉着调节(Singh和Mukhopadhyay，2014)。α-MSH及其类似物对黑皮质素-1受体(MC-1r)展现结合亲和力，该受体在超过80％的人类黑素瘤转移瘤(metastase)中表达，并且因此被广泛用作黑素瘤靶向成像和放射治疗的载体。

神经肽Y(NPY)-NPY是一种36个氨基酸的肽，属于胰多肽家族(Tatemoto，2004)。NPY受体在各种肿瘤中过度表达，包括神经母细胞瘤、肉瘤和乳腺癌。

神经紧张素(NT)——NT是一种靶向NT受体的13个氨基酸的肽，已在各种肿瘤中鉴定出，比如胰腺导管癌、小细胞肺癌和甲状腺髓样癌(Tyler-McMahon等人，2000)。因此，它是癌症成像的有吸引力的候选者。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)–前列腺癌细胞在细胞表面过度表达PSMA(Silver等人，2007；Ghosh和Heston，2004；Mhawech-Fauceglia等人，2007；Santoni等人，2014)。有几种靶向PSMA的可用的放射性药物，包括[⁶⁸Ga]Ga-PSMA-HBED-CC(也称为[⁶⁸Ga]Ga-PSMA-11[PET])、单克隆抗体(mAb)[¹⁷⁷Lu]Lu/[⁹⁰Y]Y-J591(疗法)、[¹²³I]I-MIP-1072(平面的/SPECT)、[¹³¹I]I-MIP-1095(疗法)和治疗诊断剂PSMA-I&T和DKFZ-PSMA-617(PSMA-617)，PET用⁶⁸Ga标记，或治疗用¹⁷⁷Lu标记。

生长激素抑制素(SST)肽——SST是天然存在的环肽激素，具有14或28个氨基酸(Weckbecker等人，2003)。它们可以抑制胰岛素、胰高血糖素和其他一些激素的分泌。生长激素抑制素受体(SSTR；五种亚型SSTR1-SSTR5)在包括胶质瘤、神经内分泌瘤和乳腺肿瘤的多种肿瘤中过度表达。GEP系统的神经内分泌瘤(NEN)最频繁地起源于胰腺、空肠、回肠、盲肠、直肠、阑尾和结肠。所有GEP-NEN的共同特征是内分泌和神经细胞的复合特征。分化良好的NEN过度表达生长激素抑制素受体(SSTR)，尤其是SSTR-2亚型。

物质P-物质P是一种十一肽，属于称为速激肽的神经肽家族(Strand，1999)。物质P是由于发现在各种癌细胞上表达的神经激肽1受体(NK1R)已知的一种特定的内源性配体。

T140-T140是一种具有一个二硫键的14个氨基酸的肽，并且是4型趋化因子受体(CXCR4)的反向激动剂(Burger等人，2005)。其衍生物被广泛用作CXCR4显像剂。

肿瘤分子靶向肽1(TMTP1)-TMTP1是一种5个氨基酸的肽，已被发现与高度转移的癌细胞，尤其是来自典型肝脏微转移的癌细胞特异性结合(Yang等人，2008)。

血管活性肠肽(VIP)——VIP是一种具有28个氨基酸的神经肽(Igarashi等人，2011)。它促进血管舒张、细胞生长和增殖。其作用主要受两种受体亚型(VPAC1和VPAC2)控制。大量的VIP受体在多种肿瘤上表达，包括胰腺癌和神经内分泌瘤。

通过配体和细胞膜上的组分比如多糖、糖蛋白或多肽之间的相互作用，配体可以附着到囊泡的细胞膜上。表达的配体锚定在囊泡的表面，使得配体的肿瘤表面组分结合部分暴露，从而当囊泡和哺乳动物肿瘤细胞接触时，该部分可以结合靶标哺乳动物细胞表面受体。

可选地，配体可以由衍生自细菌的囊泡的活对应物，例如，由小细胞的亲本细胞或由细菌细胞在其变成杀伤细胞之前表达和展示。在这种情况下，配体不需要对囊泡具有特异性，而只对哺乳动物细胞特有的组分表现出特异性。即，这种成分不必是肿瘤细胞本身所独有的，甚至不必是接受治疗的特定类型的肿瘤细胞所独有的，只要肿瘤细胞在其表面上呈现该组分即可。

在静脉内施用后，囊泡在肿瘤微环境中迅速积聚。这种积聚随着上述渗漏的肿瘤脉管系统的变化而发生，实现将囊泡封装的治疗有效载荷递送至肿瘤细胞，然后肿瘤细胞内在化封装的囊泡。

发明人已经发现，这种递送方法适用于一系列哺乳动物肿瘤细胞，包括通常对小细胞的特异性粘附和内吞作用难以抗拒的细胞。例如，包含针对抗HER2受体或抗EGF受体的抗体的配体可以将小细胞与一系列靶向非吞噬细胞比如肺、卵巢、脑、乳腺、前列腺和皮肤癌细胞上的相应受体结合。

由此实现的结合先于每种类型的非吞噬细胞对囊泡的摄取。即，在本发明的上下文中，合适的靶细胞呈递的细胞表面受体被囊泡上的配体结合引起该囊泡的内吞作用。

更具体地说，本发明人发现(a)小细胞或杀伤的细菌细胞上的配体与(b)哺乳动物细胞表面受体之间的相互作用可以激活摄取途径，此处称为“受体介导的内吞作用”(rME)途径，进入靶宿主细胞(比如肿瘤细胞)的晚期内体/溶酶体区室。发明人发现，通过该rME途径，衍生自细菌的囊泡通过早期内体、晚期内体和溶酶体进行加工，导致其有效载荷释放到哺乳动物宿主细胞的细胞质中。此外，作为核酸的有效载荷不仅避免了晚期内体/溶酶体区室中的完全降解，而且还被宿主细胞表达。

如上所述，用于这种递送方法的肿瘤靶向配体可以是“双特异性的”，因为它分别与携带有效载荷的囊泡和靶细胞上的表面组分结合，并且它与后一种组分的相互作用导致囊泡被摄取到rME途径中。在任何情况下，根据本发明，如果与组分的相互作用实际上进入需要从靶细胞表面进行胞质内在化的内吞途径，则给定的靶细胞表面受体可以是配体结合的候选物。很容易经由测定评估这种候选物在本发明中的适用性，其中在其表面上呈现候选组分的细胞类型与携带结合候选物且也连接至荧光染料或其他通过例如共聚焦显微镜视觉检测易于检测的标志物的配体的小细胞在体外共同温育。(MacDiarmid等人，2007b在第436页图3的图例中描述了这种体外测定)。因此，观察到的标志物内在化构成了这种测定的阳性指示，即测试的靶细胞表面受体适用于本发明。

根据本发明，配体可以是表现出期望的一种或多种特异性的任何多肽或多糖。优选的配体是抗体。在其目前的用途中，术语“抗体”包括通过体外或体内产生免疫原性反应而获得的免疫球蛋白分子。因此，“抗体”类别包括单克隆抗体和人源化抗体，比如单链抗体片段(scFv)、双特异性抗体等。如Caravella和Lugovskoy，2010的综述文章中所证明的那样，已知大量不同的双特异性蛋白质和基于抗体的配体。根据本公开有用的抗体可以通过已知的重组DNA技术获得。

因此，作为非限制性实例，可以使用对表面组分(例如肿瘤抗原)具有特异性的抗体将小细胞靶向待治疗的肿瘤中的细胞。在这方面的示例性细胞表面受体包括各自在包括脑肿瘤的多种实体瘤中高度表达的受体酪氨酸激酶(RTK)表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)和胰岛素样生长因子受体(IGFR)中的每一种，和在一些垂体腺瘤中过度表达的叶酸受体。这种双特异性配体也可以靶向突变体或变异体受体，例如IL-13Rα2受体，其在50％至80％的人多形性胶质母细胞瘤肿瘤中表达，参见Wykosky等人，2008；Jarboe等人，2007年；Debinski等人，2000年；和Okada等人，1994)，但与在正常组织中表达的生理对应物IL4R/IL13R不同。参见Hershey，2003。因此，IL13Rα2几乎不存在于正常脑细胞中。参见Debinski和Gibo，2000。此外，转移到大脑的肿瘤可能会过度表达某些受体，这些受体也可能是合适的靶标。例如，Da Silva等人，2010，表明乳腺癌的脑转移表达了RTK的HER家族的所有成员。HER2在20％的脑转移瘤中被扩增并过度表达，EGFR在21％的脑转移瘤中过度表达，HER3在60％的脑转移瘤中过度表达，HER4在22％的脑转移瘤中过度表达。有趣的是，在存在于大脑中的乳腺癌细胞中HER3表达增加。

候选靶细胞表面受体的实例是受体酪氨酸激酶或“RKT”的成员，这是一个跨膜蛋白家族，其以类似于其他整合膜蛋白的速率进行组成型内在化(内吞作用)。参见Goh和Sorkin，2013。Lemmon和Schlessinger，Cell，141(7)：1117-134(2010)描述了RKT家族。示例性RTK是ErbB EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4 Ins InsR、IGF1R、InsRR PDGF PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R/Fms、Kit/SCFR、Fit3/Flk2 VEGF VEGFR1/Fit1、VEGFR2/KDR、VEGFR3/Fit4 FGFFGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4 PTK7 PTK7/CCK4 Trk TrkA、TrkB、TrkC Ror Ror1、Ror2MuSKMet、Ron Axl、Mer、Tyro3 Tie Tie1、Tie2 Eph EphA1-8、EphA10、EphB1-4、EphB6Ret RykDDR DDR1、DDR2 Ros LMR LMR1、LMR2、LMR3 ALK、LTK STYK1SuRTK106/STYK1。

合适的靶细胞表面受体的另一种候选物是膜相关的、高亲和力的叶酸结合蛋白(叶酸受体)家族，其结合叶酸和还原的叶酸衍生物并介导四氢叶酸向细胞内部的递送；膜结合细胞因子受体家族，其在同源细胞因子(比如IL13)的内在化中起作用；表面抗原，比如CD20、CD33、间皮素和HM1.24，其在某些癌细胞上表达并介导同源单克隆抗体的内在化，例如CD20中的利妥昔单抗；和粘附受体(整联蛋白)家族，它们是通过内体途径运输的跨膜糖蛋白，是癌细胞粘附的主要媒介。在本发明的一个实施方式中，肿瘤细胞表面受体包括整联蛋白、神经调节肽B受体、铃蟾肽3受体、GRP受体、铃蟾肽4受体、CCK2/胃泌素、黑皮质素1受体(MC-1r)、神经肽Y(NPY)受体、神经紧张素(NT)受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、生长激素抑制素(SST)受体、神经激肽1受体(NK1R)、趋化因子受体类型4(CXCR4)、血管活性肠肽(VIP)、表皮生长因子受体(EGFR))、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)或其任何组合。

根据本发明的另一个实施方式，细胞表面受体是一种抗原，其在疾病状态下在靶细胞上独特表达，但是在健康状况下保持不表达、低水平表达或不可访问。可被本发明的靶向配体特异性结合的这种靶抗原的实例可有利地选自EpCAM、CCR5、CD19、HER-2神经膜(HER-2neu)、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(粘蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC5、MUC7、BhcG、路易斯-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原,前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标志物、CA-125标志物和缪勒(Muellerian)抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、EGFRVIII、LG、SAS和CD63。

3.纯度

本发明的小细胞基本上没有污染亲本细菌细胞。因此，包括小细胞的制剂优选包含每10⁷个小细胞少于约1个污染亲本细菌细胞、每10⁸个小细胞少于约1个污染亲本细菌细胞、每10⁹个小细胞少于约1个污染亲本细菌细胞、每10¹⁰个小细胞少于约1个污染亲本细菌细胞，或每10¹¹个小细胞少于约1个污染亲本细菌细胞。

纯化小细胞的方法是本领域已知的并且描述于PCT/IB02/04632中。一种这样的方法结合了错流过滤(进料流平行于膜表面；Forbes，1987)和死端(dead-end)过滤(进料流垂直于膜表面)。任选地，过滤组合之前可以是在低离心力下进行差速离心，以去除部分细菌细胞，从而富集上清液中的小细胞。

另一种纯化方法在生物相容性媒介中采用密度梯度离心。离心后，从梯度中收集小细胞带，并且任选地，小细胞经受另外轮的密度梯度离心以最大化纯度。该方法还可包括对含有小细胞的样品进行差速离心的预备步骤。当在低离心力下进行时，差速离心会去除一部分亲本细菌细胞，从而富集上清液中的小细胞。

特别有效的纯化方法利用细菌丝状形成来提高小细胞纯度。因此，小细胞纯化方法可以包括以下步骤：(a)使含有小细胞的样品处于诱导亲本细菌细胞采用丝状形式的条件下，然后(b)过滤样品以获得纯化的小细胞制剂。

也可以组合已知的小细胞纯化方法。一种高效的示例性方法组合如下：

步骤A：产生小细胞的细菌细胞培养物的差速离心。该步骤可在2,000g下进行约20分钟，去除大部分亲本细菌细胞，同时将小细胞留在上清液中；

步骤B：使用等渗且无毒的密度梯度媒介进行密度梯度离心。该步骤将小细胞与许多污染物(包括亲本细菌细胞)分离，同时小细胞的损失最小。优选地，该步骤在纯化方法中重复；

步骤C：通过0.45μm过滤器进行错流过滤，以进一步减少亲本细菌细胞污染。

步骤D：残余亲本细菌细胞的压力诱导的丝化。这可以通过将小细胞悬浮液置于几种诱导压力的环境条件中的任何一种条件下来实现；

步骤E：抗生素处理以杀伤亲本细菌细胞；

步骤F：错流过滤去除小污染物，比如膜泡、膜碎片、细菌碎片、核酸、媒介组分等，并浓缩小细胞。0.2μm过滤器可用于将小细胞与小污染物分离，并且0.1μm过滤器可用于浓缩小细胞；

步骤G：死端过滤以消除丝状死细菌细胞。该步骤可使用0.45um过滤器；和

步骤H：从小细胞制剂中去除内毒素。该步骤可使用抗脂质A包被的磁珠。

IV.制剂

本发明在其范围内包括组合物或制剂，其包括包封CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如，α-GalCer)的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞。在一些实施方式中，该制剂包括衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞，其包括单独的或与抗肿瘤剂组合的CD1d-限制性iNKT细胞抗原。在一些实施方式中，制剂包括包含CD1d-限制性未变异的天然杀伤T(iNKT)细胞抗原的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞，和包括抗肿瘤剂的衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞。例如：(a)CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂可以包括在同一个小细胞或杀伤的细菌细胞中；或(b)CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以包括在第一个小细胞或杀伤的细菌细胞中，和抗肿瘤剂可以包括在第二个小细胞或杀伤的细菌细胞中。

在示例性实施方式中，本文公开的组合物包括CD1d-限制性iNKT细胞抗原α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)和抗肿瘤剂，其中α-GalCer和抗肿瘤剂包括在一个或多个完整的、衍生自细菌的小细胞中。在示例性实施方式中，本文公开的组合物包括CD1d-限制性iNKT细胞抗原α-GalCer和抗肿瘤剂阿霉素，其中α-GalCer和阿霉素包括在一个或多个完整的、衍生自细菌的小细胞中。

在一些实施方式中，制剂还任选地包含至少一种用于将小细胞靶向靶细胞的双特异性配体。小细胞和配体可以是本文所述的任何一种。因此，本发明的双特异性配体能够结合完整的、衍生自细菌的小细胞的表面组分和靶标哺乳动物细胞的表面组分。

可以使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制包括小细胞或杀伤的细菌细胞、药物(例如，至少一种抗肿瘤剂)和任选的本发明的双特异性配体的制剂(即，包括这种小细胞或杀伤的细菌细胞、药物和配体以及不过度干扰组合物的药物或药物递送质量的其他成分的制剂)。

本公开的制剂或组合物可以以单位剂型存在于例如安瓿或小瓶中，或多剂量容器中，添加或不添加防腐剂。制剂可以是在油性或水性载体中的溶液、悬浮液或乳液，并且可以包含配制剂，比如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的溶液与接受者的血液等渗，并且例如盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。可选地，制剂可以是冻干粉末形式，用于用合适的载体例如无菌、无热原水或生理盐水重构。制剂也可以是贮库制剂的形式。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。在一些实施方式中，施用包括肠内或肠胃外施用。在一些实施方式中，施用包括选自口服、含服、舌下、鼻内、直肠、阴道、静脉内、肌内和皮下注射施用。

在一些方面，提供了包括“免疫原性有效量的”包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原的组合物。如本文所用“免疫原性有效量”是指足以引发免疫应答的抗原量。在CD1d-限制性iNKT细胞抗原的情况下，免疫原性有效量是足以激活iNKT细胞应答的抗原量。可以通过例如测量施用后细胞因子(例如，IFNγ)产生的增加来评估CD1d-限制性iNKT细胞抗原作为免疫原的效力。

在一些方面，提供了包括治疗有效量的抗肿瘤剂的组合物。根据本公开，抗肿瘤剂的“治疗有效”量是当将施用于受试者时引起药理学反应的所讨论的药剂例如siRNA或超细胞毒性药物的剂量。

因此，在本公开的上下文中，当施用携带治疗有效载荷的衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞时，可以参考动物模型或人类受试者中肿瘤或肿瘤症状的预防或改善来测量治疗有效量，如下文进一步描述的。在给定情况下证明对于具体受试者“治疗有效量”的量，可能对于进行类似治疗肿瘤的受试者不是100％有效的，即使这种剂量被技术人员视为“治疗有效量”。在这方面的合适的剂量也将随着例如肿瘤的类型、阶段和严重性而变化。

当“治疗有效”用于指药物组合物中的小细胞或杀伤的细菌细胞的数量时，该数量可以基于封装在小细胞或杀伤的细菌细胞中的抗肿瘤剂以及治疗肿瘤的药剂的功效来确定。在这方面，治疗效果可以用临床或病理参数如肿瘤质量来衡量。因此，肿瘤质量的减小或其增加的减少可用于测量治疗效果。

V.施用途径

本发明的制剂可以通过多种途径施用到哺乳动物体内的不同部位，以达到局部或全身所需的治疗效果(一种或多种)。递送可以例如通过口服施用、通过将制剂施用于体腔、通过吸入或吹入、或通过肠胃外、肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下、肿瘤内或皮内施用来实现。包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂可以通过相同的途径施用或不同的途径施用。例如，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以全身施用，并且抗肿瘤剂可以局部施用。在一些实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂均被全身施用。

施用方式和部位取决于靶细胞的位置。例如，在肿瘤微环境和与肝脾和淋巴结相关的脉管系统中都可以找到摄取包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原的靶标吞噬细胞。因此，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以经由靶向和/或非靶向衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞递送。

抗肿瘤剂也可以通过靶向和/或非靶向方法施用。例如，通过静脉内或腹膜内递送靶向组合物，诸如例如静脉内或腹膜内递送靶向衍生自细菌的小细胞，可以更有效地治疗肿瘤转移。还可以采用路线的组合。例如，细胞毒性药物装载的和受体靶向的小细胞可以局部和静脉内施用，并且包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原(受体靶向的或非靶向的)小细胞可以静脉内施用。靶向、药物封装的小细胞的施用可以靶向暴露于表面的肿瘤，而静脉内施用的小细胞的完整组合可以靶向组织局部肿瘤并且还引发抗肿瘤免疫应答。

VI.施用方案

通常，本文公开的制剂可以通过常规测试确定的合适的剂量使用，以获得最佳生理效果，同时最小化任何潜在毒性。剂量方案可根据多种因素进行选择，包括患者的年龄、体重、性别、医疗状况；要治疗的病症的严重程度、施用途径以及患者的肾功能和肝功能。

实现包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和药物的浓度在产生最大功效和最小副作用的范围内的最佳精度可能需要基于包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤药物对靶位点和靶细胞的可用性的动力学的方案。在确定治疗方案的最佳浓度时，可以考虑包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤药物的分布、平衡和消除。当包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与抗肿瘤药物组合使用时可调整剂量，以实现预期效果。

此外，可以使用药代动力学/药效动力学建模系统优化制剂的剂量施用。例如，可以选择一种或多种剂量方案，并且可以使用药代动力学/药效模型来确定一种或多种给药方案的药代动力学/药效特征。接下来，可以基于特定的药代动力学/药效学特征选择实现所需药代动力学/药效应答的施用剂量方案之一。参见，例如，WO 00/67776。

具体而言，可以在几周的过程中每周至少施用一次包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂。在一个实施方式中，在几周至几个月内每周至少施用一次包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂。包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和一种或多种抗肿瘤药物可以同时、顺序或间断地以规定的时间间隔施用。

更具体地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以每天至少施用一次，持续约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或约31天。可选地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以施用约每天一次，约每2天、约每3天、约每4天、约每5天、约每6天、约每7天、约每8天、约每9天、约每10天、约每11天、约每12天、约每13天、约每14天、约每15天、约每16天、约每17天、约每18天、约每19天、约每20天、约每21天、约每22天、约每23天、约每24天、约每25天、约每26天、约每27天、约每28天、约每29天、约每30天或约每31天或更长施用一次。

包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以可选地约每周施用一次，约每2周、约每3周、约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周、约每12周、约每13周、约每14周、约每15周、约每16周、约每17周、约每18周、约每19或约20周或更长施用一次。可选地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以每周施用至少一次，持续约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周或约20周或更长。

包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以可选地每周施用约两次，约每2周、约每3周、约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周、约每12周、约每13周、约每14周、约每15周、约每16周、约每17周、约每18周、约每19周或约每20周或更长施用约两次。可选地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以每周施用至少一次，持续约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周或约20周或更长。

可选地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原和/或抗肿瘤药物的制剂可以每月施用约一次，约每2月、约每3月、约每4月、约每5月、约每6月、约每7月、约每8月、约每9月、约每10月、约每11月或约每12月或更长施用约一次。

制剂可以单次日剂量给药，或总的日剂量可以以分剂量施用，每天2、3或4次。

在施用抗肿瘤剂后施用包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原的方法中，抗肿瘤剂的施用可以在施用包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原后几分钟至几小时的任何时间进行。可选地，抗肿瘤剂可以在包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原后几小时至几天、可能几周至几个月的任何时间施用。

更具体地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之后至少约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23或约24小时施用。此外，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在施用抗肿瘤剂之后至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天或约31天施用。在又另一个实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之后至少约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18、约19周或约20周或更长施用。在进一步的实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12月施用。

在其中在施用抗肿瘤剂之前施用包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原的方法中，抗肿瘤剂的施用可以在施用包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原之前几分钟至几小时的任何时间发生。可选地，抗肿瘤剂可以可选地在包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原之前几小时至几天的任何时间施用，可能在之前几周至几个月施用。

更具体地，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之前至少约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时施用。此外，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在施用抗肿瘤剂之前至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天或约31天施用。在又另一个实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之前至少约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周或约20周或更长施用。在进一步的实施方式中，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原可以在抗肿瘤剂之前至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月施用。

VII.治疗癌症的方法

本文所述的组合物可用于治疗患有癌症的受试者。本文公开的方法包括向受试者施用免疫原性有效量的组合物，该组合物包括完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞，其包封了CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂或疗法。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原包括在完整的、衍生自细菌的小细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包括在一个或多个完整的、衍生自细菌的小细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包括在单独的完整的、衍生自细菌的小细胞中。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包括在相同的完整的、衍生自细菌的小细胞中。在一些实施方式中，包封CD1d-限制性iNKT细胞抗原的成熟的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞与抗肿瘤剂或疗法分开施用。在一些实施方式中，CD1d-限制性iNKT细胞抗原和抗肿瘤剂包括在相同的完整的、衍生自细菌的小细胞中。在一些实施方式中，包封CD1d-限制性iNKT细胞抗原的成熟的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞与抗肿瘤剂或疗法同时施用。在一些实施方式中，包封CD1d-限制性iNKT细胞抗原的成熟的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞与抗肿瘤剂在同一组合物中施用。在一些实施方式中，包封CD1d-限制性iNKT细胞抗原的完整的、衍生自细菌的小细胞或杀伤的细菌细胞作为单独的组合物与抗肿瘤剂一起施用。在另一方面，用于治疗患有癌症的受试者的包括包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原或抗肿瘤剂的组合物进一步包括药学上可接受的载体。

在另一方面，本文公开的方法可用于治疗患有癌症的受试者，其中受试者是人、非人灵长类动物、狗、猫、牛、羊、马、兔子、小鼠或大鼠。

在另一方面，本文公开的方法可用于治疗癌症疾病。在一些实施方式中，癌症包括肺癌、乳腺癌、脑癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌或膀胱癌。

在一些实施方式中，癌症包括急性淋巴细胞白血病；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；与艾滋病相关的癌症；与艾滋病相关的淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、中分化松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；原发部位不明的癌症；类癌瘤；原发部位不明的恶性上皮肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰腺胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；室管膜母细胞瘤；室管膜细胞瘤；食管癌；嗅神经母细胞瘤；尤文肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃部(胃)癌症；胃肠类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞瘤；胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；眼内黑素瘤；胰岛细胞瘤；卡波西肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；成神经管细胞瘤；髓上皮瘤；黑素瘤；默克尔细胞癌；默克尔细胞皮肤癌；间皮瘤；具有隐匿性原发灶的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈状真菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增殖性赘生物；鼻腔癌症；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其他脑肿瘤和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中分化松果体实质肿瘤；松果体母细胞瘤；垂体瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；Sezary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃部(胃)癌症；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；华氏巨球蛋白血症；或维尔姆斯瘤。

在一些实施方式中，脑癌或肿瘤选自脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、中分化松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤。

VIII.定义

除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。除非另有说明，在以下描述和实施例中参考的材料、试剂等可从商业来源获得。

为方便起见，下文提供了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语和短语的含义。整个说明书中定义了其他术语和短语。

单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”包括复数指示，除非上下文另有明确规定。

术语“大约”是指所理解的数字不限于本文中阐述的确切数字，并且旨在指基本上近似所述数字而不背离本发明范围的数字。如本文所用，“约”将被本领域普通技术人员理解并且将在其使用的上下文中在一定程度上变化。如果考虑到使用该术语的上下文，该术语的使用对于本领域的普通技术人员来说是不清楚的，则“大约”将意味着高达特定术语的正负10％。

“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，是指需要诊断、治疗或治疗的任何哺乳动物受试者。在一个优选的实施方式中，个体、受试者、宿主或患者是人。其他受试者可包括但不限于牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类动物和小鼠。

“癌症(cancer)”、“赘生物(neoplasm)”、“肿瘤(tumor)”、“恶性肿瘤(malignancy)”和“癌(carcinoma)”在本文中可互换使用，是指表现出异常生长表型的细胞或组织，其特征在于细胞增殖控制的显著丧失。有几种主要类型的癌症。癌是始于皮肤或内脏组织或内脏组织的癌症。肉瘤是始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。白血病是始于造血组织(比如骨髓)的癌症，它会导致大量异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是始于免疫系统细胞的癌症。中枢神经系统癌症是起源于大脑和脊髓组织的癌症。本发明的方法和组合物特别适用于癌前、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指在肿瘤患者中获得所需的药理学和/或生理学效果。该作用在完全或部分预防肿瘤或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全稳定或治愈肿瘤和/或归因于肿瘤的副作用方面可以是治疗性的。治疗涵盖对哺乳动物，尤其是人类的肿瘤的任何治疗。具体而言，期望的效果是肿瘤反应，其可以被测量为肿瘤质量的减少或肿瘤质量增加的抑制。除了肿瘤反应之外，总生存期、无进展生存期或肿瘤复发时间的增加或不良反应的减少也可在临床上用作期望的治疗效果。

如本文所用，术语“施用”包括直接向另一人施用、自我施用和开具或指导施用如本文所公开的药剂。

如本文所用，短语“有效量”和“治疗有效量”分别是指提供特定药理作用的活性剂剂量或受试者中的血浆浓度，对于该活性剂在受试者中给药需要这样的治疗。需要强调的是，有效量的活性剂并不总是能有效治疗本文所述的病症/疾病，即使本领域技术人员认为这种剂量是有效量。

如本文所用，术语“活性剂”是可用于治疗受试者的任何小分子药物、蛋白质、功能性核酸或编码功能性核酸的多核酸。活性剂可以是本文所述的任何抗肿瘤药物、功能性酸、干扰素I型激动剂或II型激动剂。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指那些在合理医学判断范围内适合在体内使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型，与合理的收益/风险比相称。

术语“内吞作用”包括(1)吞噬作用和(2)胞饮作用，本身是一个类别，包括(2a)不需要受体结合的大胞饮，以及(2b)网格蛋白介导的内吞作用，(2c)小窝介导的内吞作用和(2d)网格蛋白/小窝独立的内吞作用，所有这些都倾向于进入晚期内体/溶酶体途径。本发明人发现，小细胞上的配体与哺乳动物细胞表面受体之间的相互作用激活特定的内吞作用途径，包括受体介导的内吞作用(rME)到晚期内体/溶酶体区室。凭借这样的内吞途径，本发明人进一步发现小细胞能够将它们的有效载荷释放到靶标哺乳动物细胞的细胞质中。在有效载荷是编码核酸的情况下，该核酸不仅在晚期内体/溶酶体区室中没有完全降解，而且还在靶标哺乳动物细胞中表达。

以下实施例仅是说明性的，而非限制性的，并且提供对本发明的更完整的理解。这些实施例表明，可以通过以下方式有效地在体内治疗耐药性肿瘤细胞：(1)施用携带设计为减少或消除耐药性编码基因表达的RNAi序列的靶向重组小细胞，以及(2)施用携带对癌细胞敏感的药物的靶向的、药物封装的小细胞。

提供以下实施例来说明本发明。然而，应当理解，本发明不限于这些实施例中描述的特定条件或细节。在整篇说明书中，对公开可用文件的任何和所有引用，包括美国和/或国际专利或专利申请出版物，都通过引用具体并入。

实施例

实施例1.JAWSII细胞的EDV_αGC处理，并且随后通过CD1d配体的αGC表面呈递这个实施例针对癌细胞对比了经由完整的细菌小细胞的包封递送αGC和游离αGC。

使用的细胞：小鼠未成熟单核细胞JAWSII(CRL-11904^TM)。

制备Perfecta3D 96孔悬滴板：使用P1000移液管，用熔化的1％琼脂糖填充3D悬滴板的上下侧托盘贮存器(1g琼脂糖溶于100ml水中，在微波中溶解并允许冷却至～50℃)。使板干燥并在室温下静置至少30分钟。然后用50μl无菌细胞培养基(不含细胞)/孔填充悬滴板的外孔。

用EDV_αGC处理JAWSII球体：用1000ng/mlαGC处理JAWSII细胞(阳性对照)；空小细胞和小细胞_αGC与未处理细胞比较并在处理后8小时、16小时、24小时和48小时收集(图8A-8D)。

JAWSII细胞解离成单细胞悬浮液：JAWSII细胞在T25或T75烧瓶中作为半悬浮培养物生长。通过使用移液器辅助装置移液将培养基小心地收集到无菌的50ml管中，并用5ml的无菌PBS洗涤烧瓶的培养表面2次，并在每次洗涤后收集在相同的无菌50ml管中。通过加入5ml 0.25％胰蛋白酶/EDTA收集贴壁细胞并在37℃温育3分钟或直到所有细胞从烧瓶表面提起。通过使用移液器辅助装置轻轻移液，将提起的细胞小心地分解为单个细胞，并转移到先前步骤中使用的样品无菌50ml管中。然后将细胞悬浮液以300g离心7分钟，并小心倾析上清液。用手指轻弹试管底部使细胞沉淀分离，并重新悬浮在5ml预热的JAWSII培养基中。通过使用移液器辅助装置小心移液，将细胞悬液进一步解离为单个细胞。为了确定细胞数量，将10μl细胞悬液与10μl台盼蓝(trypan blue)溶液混合，并使用EVE自动细胞计数器进行分析。

初始治疗准备：每个时间点的每个治疗组使用6个悬滴悬液样品。每个处理样品使用5×10⁴个JAWSII细胞和5×10⁸个小细胞(1:1000小细胞与细胞比)并在JAWSII细胞培养基中培养，总体积为50μl。制备额外的未处理样品用于同种型对照。通过以12,000g离心7分钟沉淀(pellete)适量的小细胞，并通过移液器小心地除去上清液。将适量的活JAWS细胞(基于上一节的细胞计数)添加到沉淀的小细胞中。然后通过轻轻移液将小细胞解离成单个小细胞-细胞悬液。然后通过添加无菌培养基补足每个样品的最终体积。对于未处理和αGC处理的样品，每个样品使用5×10⁴个JAWSII细胞并在JAWSII细胞培养基中培养，总体积为50μl。将适量的活JAWSII细胞转移到Eppendorf管中。然后通过添加无菌培养基补足每个样品的最终体积。对于1000ng/mlαGC(阳性对照)处理组处理的JAWSII细胞，直接在细胞悬液中加入1000ng/mL的αGC。然后将样品以50μl处理悬浮液/孔小心地接种到悬滴板的每个孔中，并在37℃和5％CO₂下温育，直至收集。

用抗-αGalCer：mCD1d复合单克隆抗体对处理过的JAWSII细胞进行染色：使用P200移液管仔细收集每个悬滴孔的全部内容物并转移到Eppendorf管中。每个处理组共收集6个样品到1个管中。将1：1000PE偶联的抗小鼠αGalCer:mCD1d复合单克隆抗体和1：1000PE偶联的小鼠IgG1同种型对照加入适当的样品中，并通过轻轻涡旋混合。GalCer:mCD1d单克隆抗体与GalCer:CD1d复合物的细胞表面暴露部分结合。然后将样品在室温下避光温育20分钟。然后通过以350g离心5分钟使样品沉淀。通过小心地移液去除上清液，并将沉淀物重新悬浮并在500μL FACS缓冲液中洗涤一次。然后通过以350g离心5分钟收集细胞，重新悬浮在250μL FACS缓冲液中并转移到FACS管中。将1μL DAPI添加到每个样品中，并通过轻轻旋转试管混合。然后使用Gallios流式细胞仪分析样品。

结果：流式细胞术数据(图8)显示，对于用小细胞_α-GC和游离α-GC处理的JAWSII细胞，在用抗GalCer:mCD1d染色后，与仅用小细胞处理的和未处理的JAWSII细胞相比，有明显的变化。这种阳性染色证实了小细胞成功地将α-GC递送到JAWSII细胞，并且随后将糖脂呈递到细胞表面的CD1d分子将抗原呈递到细胞表面。α-GC的呈递是一个关键步骤，它通过未变异的NKT细胞触发受体识别，从而触发抗肿瘤活性中必不可少的II型IFN级联反应。

实施例2：在同源小鼠模型(Balb/c小鼠中的^EpCT26鼠结肠癌)中使用^Ep小细胞_Dox和小细胞_α-GC联合治疗的体内研究

本实施例说明了含有治疗剂的小细胞和含有CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如，α-GalCer)的小细胞对肿瘤的疗效。该结果表明，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与抗肿瘤剂的组合可用于有效地治疗肿瘤。

小鼠和处理(实验1-3)：Balb/c小鼠，雌性，6-7周龄，来自西澳大利亚的AnimalResources Company。小鼠在实验开始前适应环境一周。CT26细胞(小鼠结肠癌)用表达EpCAM抗原的质粒稳定转化并建立稳定克隆(Ep克隆12.1)。该克隆在细胞表面表达EpCAM。所有动物实验均按照澳大利亚国家健康和医学研究委员会(National Health andMedical Research Council)、澳大利亚实验室动物护理和使用指南(Australiaguidelines for the care and use of laboratory animals)进行，并获得EnGeneIC动物伦理委员会(EnGeneIC Animal Ethics Committee)的批准。

CT26(Ep克隆12.1)同种移植物是通过在每只小鼠的左侧皮下注射每100μl PBS 2×10⁵个细胞来建立的。肿瘤在植入后8天内生长到～125mm3起始体积。将小鼠随机分组，每个治疗组8只小鼠。与仅用盐水处理相比，用^Ep小细胞_Dox、小细胞_α-GC和^Ep小细胞_Dox+小细胞_α-GC(组合)治疗肿瘤。

每周给药3次，持续2周。^Ep小细胞_Dox在单独和联合治疗中以每剂1×10⁹个小细胞给药。小细胞_α-GC在实验1(图3)和3(图5)中以1×10⁷以及在实验2(图3)中以1×10⁸给药，其中当肿瘤体积达到800mm³时盐水组也被攻击。

结果：与盐水和^Ep小细胞_Dox治疗相比，所有3项实验都表明，接受^Ep小细胞_Dox+小细胞_α-GC的联合治疗组的肿瘤进展明显停止。这一结果支持了免疫佐剂效应的理论，即在^Ep小细胞_Dox中加入小细胞α-GC处理。用小细胞_α-GC单独治疗也显示所有3个实验的肿瘤进展停止，尽管没有达到联合治疗的程度，如实验2中最佳看到的。

在实验2中，盐水处理的对照肿瘤在处理改变为药物和α-GC EDV介导的联合治疗后显示出显著的肿瘤消退(图4)。在实验终止前的3天内，已达到800mm³的肿瘤降至600mm³以下。

不同大小肿瘤的剂量评估；小鼠和治疗(实验4)：CT26(Ep克隆12.1)同种移植物是通过将2×10⁵个细胞/100μl PBS皮下注射到雌性6-7周龄Balb/c小鼠的左侧腹中建立的。在治疗开始之前，肿瘤生长到～200-250mm³或600-800mm³。将小鼠随机分成6组，每组3只小鼠。小鼠仅接受一剂。包括治疗组；盐水(图6C)、^Ep小细胞_Dox(1×10⁹)(图6F)、小细胞α-GC(1×10⁶)(图6E)、小细胞α-GC(1×10⁷)(图6D)、^Ep小细胞_Dox 1×10⁹+小细胞_α-GC(1×10⁶)(图6B)、^Ep小细胞_Dox(1×10⁹)+小细胞_α-GC(1×10⁷)(图6A)。

在处理200-250mm³(图6)肿瘤后24小时和处理600-800mm³肿瘤后16小时和24小时(图7)处死小鼠。

结果：如上所述，通过用单剂量处理不同大小的肿瘤，进一步研究了单独和组合使用小细胞_α-GC给药对携带CT26同源肿瘤的Balb/c小鼠的影响。有趣的是，发现在携带200-250mm³和400-600mm³肿瘤的小鼠中，肿瘤在给药后24小时内出现明显的坏死(黑色)。这种效果在较大肿瘤中更为明显，而在对照组中则没有。

总之，这些数据表明，包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如α-GalCer)与抗肿瘤剂的组合显示出抗肿瘤的功效。该结果表明该组合可用于有效治疗肿瘤。

实施例3

本实施例描述了用小细胞_α-GC处理的树突细胞/单核细胞分泌细胞因子IL-12，以及暴露于这些处理过的树突细胞的iNKT细胞分泌细胞因子IFNγ、TNFα和IL-4。

众所周知，当抗原呈递细胞(APC)通过CD1d在其表面呈递α-半乳糖基神经酰胺时，它们会分泌IL-12。此外，当这些细胞将抗原呈递给iNKT细胞受体时，iNKT细胞会分泌过多的细胞因子，特别是IFNγ、TNFα和IL-4。本实验的目的是确定JAWSII细胞(小鼠树突细胞系)与小细胞_αGC共同温育，然后与iNKT细胞共同温育时是否会导致这些细胞因子的分泌。

方法

从C57小鼠中分离iNKT细胞

对于体外共培养研究，按照制造商的说明，使用NK1.1+iNKT细胞分离试剂盒，小鼠(Miltenyi Biotec)，从C57小鼠的脾脏和胸腺中分离iNKT细胞。通过进一步染色细胞的CD3和NK1.1表达来确定分离的iNKT细胞的纯度，并使用FACS进行分析。

在96孔Perfecta3D悬滴板(Sigma)中用小细胞_αGC处理JAWSII细胞。然后将培养物在37℃和5％CO₂下培养48小时，并通过离心收集上清液。然后将上清液用于IL-12分泌的ELISA分析。

将通过用小细胞_αGC初始处理递送的呈递αGC的JAWSII细胞接种在96孔圆底板中，并与从C57小鼠分离的iNKT细胞以1:2的iNKT与JAWSII的比例在AIM V无血清培养基(ThermoFisher Scientific)中共培养。然后收集上清液用于IFNγ、TNFα和IL-4的ELISA分析。

根据制造商的说明，通过来自R&D Systems的标准夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)测量培养物上清液中IL-12p40、IFN-γ、TNFα和IL-4的水平。

结果显示，用小细胞_αGC处理的JAWSII细胞在48小时内导致IL-12的高度显著分泌(图9)。小细胞_αGC处理的JAWII细胞与iNKT细胞的共温育导致所有三种细胞因子IFNγ、TNFα和IL-4的高度显著分泌(图10、11和12)，表明小细胞成功地将αGC递送至JAWSII细胞，αGC经由CD1d展示在细胞表面，iNKT细胞表面受体识别JAWSII细胞表面的CD1d/αGC复合物。

实施例4

本实施例描述了用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理的小鼠脾脏中活化树突细胞的增加。

方法：

脾和胸腺解离

在安乐死后，立即将解剖的脾脏和胸腺转移到Dounce匀浆器在新鲜制备的培养基(10％FBS在无菌RPMI-1640培养基中)中，该方法是通过将内容物直接排空到玻璃匀浆器的管中。然后通过使用玻璃柱塞3-4次通过，轻轻地分解器官。然后将匀浆的器官通过培养基中的70uM筛网过滤器转移到50mL离心管中。然后用4mL RPMI-1640培养基(无血清)洗涤玻璃匀浆器，然后将内容物再次通过相同的70uM筛网过滤器进入离心管。然后将管以330g离心10分钟，然后将细胞沉淀重新悬浮在4mL RPMI-1640培养基(无血清)。按照制造商的说明，使用红细胞裂解缓冲液Hybri-Max(Merk R7757-100mL)裂解红细胞。然后将细胞重新悬浮在5mL冷的无菌autoMACS运行缓冲液(Miltenyi)中，并通过70uM筛网过滤器进入50mL离心管中，然后进行细胞计数。

FACS分析

分离器官的单细胞制剂在1×10⁶个细胞/100mL FACS缓冲液中稀释。然后用合适的抗体对细胞进行过滤，如下表1所示。将未染色的和用单一抗体染色的细胞用作阴性对照。所有样品和试剂在冰上冷藏，并且DAPI用于区分活/死细胞。

制备的样品在Gallios流式细胞仪(Beckman)上运行，并使用Kaluza分析软件(Beckman)进行分析。通过使用Kaluza分析软件中内置的补偿功能分析单抗体染色，最大限度地减少/消除通道之间的任何光谱溢出。

6-7周龄的雌性Balb/c小鼠获自西澳大利亚的Animal Resources Company。小鼠在实验开始前适应环境一周。CT26细胞(小鼠结肠癌)用表达^EpCAM抗原的质粒稳定转化并建立稳定克隆(^Ep克隆12.1)。该克隆在细胞表面表达EpCAM。所有动物实验均按照澳大利亚国家健康和医学研究委员会、澳大利亚实验室动物护理和使用指南进行，并获得EnGeneIC动物伦理委员会的批准。

CT26(Ep克隆12.1)同种移植物是通过在每只小鼠的左侧皮下注射每100μl PBS2×10⁵个细胞来建立的。肿瘤在植入后8天内生长到～125mm³起始体积。将小鼠随机分组，每个治疗组8只小鼠。与仅用盐水处理相比，小鼠用^EpCAM小细胞_Dox、小细胞_α-GC和^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC(组合)静脉内治疗(尾静脉注射)。

小鼠在实验开始时接受单一剂量。^EpCAM小细胞_Dox在单独和联合治疗中以每剂1×10⁹个小细胞的剂量给药。小细胞_α-GC的剂量为1×10⁷。

对于免疫细胞分析，在初始剂量后4小时、8小时、16小时和24小时处死小鼠并分离总的脾细胞。针对活化树突细胞(CD86+CD40+)的存在对细胞进行染色，并使用FACS分析细胞群。

结果

结果显示(图13A-D)在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理4小时、8小时、16小时和24小时后，活化的树突细胞(CD86+CD40+)群体显著增加小鼠的脾脏。

实施例5

本实施例的目的是评估在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理小鼠异种移植物后免疫细胞浸润到肿瘤微环境中的情况。

本实施例说明了小细胞含有的治疗剂和小细胞含有的CD1d-限制性iNKT细胞抗原(例如，α-GalCer)对肿瘤的疗效。该结果表明，小细胞包封的CD1d-限制性iNKT细胞抗原与肿瘤细胞表面靶向的、封装抗肿瘤剂的小细胞的组合可用于有效激发免疫系统的活化细胞显著浸润到肿瘤中。

处死来自实施例4的CT26异种移植小鼠并移除肿瘤质量并在如下所述的肿瘤解离后提取所有细胞。

安乐死后立即切除异种移植物并置于无血清培养基(RPMI 1640或DMEM)中。小鼠的肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec)用于将肿瘤组织分离成单细胞悬液。最初，使用无菌刀片将肿瘤组织切碎。将组织放置在含有酶混合物的温和MACS C管(Miltenyi Biotec)中，其根据制造商的方案制备。对于CT26异种移植物，在带加热器的Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)上选择了用于软/中型肿瘤的GentleMACS程序。在解离器上温育后，通过MACS SmartStrainer(Miltenyi Biotec)施加细胞悬液并收集解离的细胞。

对细胞进行CD45+细胞染色，该细胞识别免疫系统的所有细胞，例如巨噬细胞、树突细胞和T细胞。通过FACS分析样品。

结果

结果显示(图14A-D)，在16小时(图14C)和24小时(图14D)，仅在小鼠用联合疗法^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC治疗的情况下，肿瘤具有免疫系统细胞显著浸润到肿瘤中。

实施例6

本实施例的目的是评估在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理小鼠异种移植物后细胞毒性T细胞浸润到肿瘤微环境中的情况。

从实施例4和5所述的小鼠异种移植物中切除肿瘤，并如实施例4所述分离细胞。针对鉴定细胞毒性T细胞的CD45+CD3+CD8+细胞对细胞进行染色。

结果

结果显示(图15D)在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理后24小时，小鼠肿瘤微环境中的CD8+细胞毒性T细胞非常显著增加。

还计算了CD8+与CD4+T细胞的比率，结果显示(图16D)在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理后24小时CD8+：CD4+比率有非常显著的增加。

实施例7

本实施例的目的是评估在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理小鼠异种移植物后iNKT细胞浸润到肿瘤微环境中的情况。

从实施例4和5中所述的小鼠异种移植物中切除肿瘤，并如实施例5中所述分离细胞。针对鉴定iNKT细胞的CD45+CD3+CD49B+细胞对细胞进行染色。

结果

结果显示(图17D)在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理后24小时，小鼠肿瘤微环境中的iNKT细胞非常显著增加。

实施例8

本实施例的目的是评估在用^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理小鼠异种移植物后PBMC和树突细胞中CD1d表达的显著增加。

如实施例4和5中所述进行小鼠异种移植研究。在该实验中，添加另一组小鼠并且该组接受^EpCAM小细胞₆₈₂+小细胞_α-GC。药物PNU159682(在本研究中指定为682)是一种奈莫柔比星衍生物，其毒性是阿霉素的2,000多倍。各种治疗施用后8小时，从实施例4和5中描述的小鼠异种移植物中收集外周血单核细胞(PBMC)。使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商的说明从收集的样本中分离RNA。通过测量260nm和280nm处的吸光度来确定RNA的质量和数量。1.8或以上的260/280比例被认为是可以接受的。

根据制造商的方案，使用Superscript Vilo(ThermoFisher Scientific)进行cDNA合成。每个qPCR反应使用10ng cDNA。

使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)和SYBR绿色染料进行qPCR。使用δδCT方法针对2个管家基因β-2-微球蛋白(B2M)和葡萄糖醛酸酶β(GUSB)计算结果。

使用泛树突细胞分离试剂盒、小鼠(Miltenyi Biotec)按照制造商的说明从肿瘤异种移植物和内脏(脾、胸腺)的单细胞悬浮液中分离组织泛树突细胞。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数并用于下游过程。分离激活的和未激活的DC。

结果

结果显示(图18)，两个处理组^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC和^EpCAM小细胞₆₈₂+小细胞_α-GC的CD1d mRNA显著增加，与^EpCAM小细胞_Dox+小细胞_α-GC处理相比，后一组显示出进一步高度显著的增加。

在同一时间点，仅在用^EpCAM小细胞₆₈₂+小细胞_α-GC处理的组中，CD1d mRNA表达在树突细胞中显著增加(图19)。

****

对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本发明旨在涵盖本发明的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。

引用的出版物

Ablasser等人，Nat.Immunol.,10(10):1065-72(2009).

Ablasser等人，Nature,498:380–384(2013a).

Ablasser等人，Nature,503:530–534(2013b).

Adamus等人，Contemp.Oncol(Ponzn),22(1A):56-60(2018).

Aduro Biotech Inc.(2016),Novartis Pharmaceuticals.Study of the Safetyand Efficacy of MIW815(ADU-S100)in Patients with Advanced/Metastatic SolidTumors or Lymphomas.2020.ClinicalTrials.gov[Internet].Bethesda(MD):NationalLibrary of Medicine(US).Identifier:NCT02675439.可获得自：https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02675439.(2016年7月1日引用).

Ahmadzadehfar等人，Semin Nucl Med.40(2):105–121(2010).

Ahmadzadehfar等人，Oncotarget7(11):12477–12488(2016).

Alexopoulou等人，Nature,413:732-738(2001).

Alzahrani等人，Clin Nucl Med.37(3):229–234(2012).

Anderson等人，Molecules 18:15662-15688(2013).

Andersson等人，Pept Sci.55:227–250(2000).

Anguille等人，Pharmacological Reviews 67,731-753(2015).

Barber等人，Curr.Opin.Immunol.,23(1):10-20(2011).

Belardelli等人，TRENDS in Immunology 23,201-208(2002).

Bernardini等人，Frontiers in immunology 7,402(2016).

Birkholz等人，J Biol Chem.290(25):15365-70(2015).

Birkholz and Kronenberg,Biomedical Journal 38:470-482(2015).

Bobanga等人，Oncoimmunology 7(3):e1393598(2017).

Bredel,Brain Res.Rev.35:161(2001).

Britton等人，Genes Dev.12:1254-9(1998).

Brody等人，J.Clin.Oncol.,28:4324-4332(2010).

Burckstummer等人，Nat.Immunol.,10:266–272(2009).

Burger等人，Blood 106:1824–1830(2005).

Caplen,N.J.,Expert Opin.Biol.Ther.3:575-86(2003).

Caplen and Mousses,Ann.NY Acad.Sci.1002:56-62(2003).

Caravella and Lugovskoy,Curr.Opin.Chem.Biol.14:520-28(2010).

Carreno等人，Clin Transl.Immunology5(4):e69(2016).

Caskey等人，J.Exp.Med.208:2357-2366(2011).

Cauwels等人，Cancer Research 78,463-474(2018).

Chatalic等人，J Nucl Med.56:1809–1812(2015).

Chen等人，Int.J.Cancer93:107(2001).

Chikuma等人，Cancer Sci.108:574-580(2017).

Chiu等人，Cell138:576–591(2009).

Chu等人，PLoS Biology4:1122-36(2006).

Civril等人，Nature498:332–337(2013).

Clark-Curtiss and Curtiss,Methods Enzymol.101:347-362(1983).

Colonna等人，Nat.Immunol.5:1219–1226(2004).

Corrales等人，Cell Rep.11:1018-1030(2015).

Cory等人，Cancer Commun.3(7):207-12(1991).

D’Aloia等人，Cell Death&Disease 9,282(2018).

D’Angiolella等人，Cell,149:1023-34(2012).

Da Silva等人，Breast Cancer Res.,12:R46(1-13)(2010).

Debinski等人，J.Neurooncol.,48:103-11(2000).

Debinski and Gibo,Mol.Med.,6:440-49(2000).

de Boer等人，J.Bacteriol.,174(1):63-70(1992).

Deutscher SL.Chem Rev.110:3196–3211(2010).

Dine等人，Asia-Pacific journal of oncology nursing 4,127-135(2017).

Dobbs等人，Cell Host Microbe,18(2):15-24(2015).

Dong等人，International journal of molecular sciences 17,320(2016).

Dowling等人，PLoS One,8:e58164(2013).

Dredge等人，Cancer immunology,immunotherapy:CII 51,521-531(2002).

Duan等人，Mol.Cancer Ther.,3:833-8(2004).

Duxbury等人，Ann.Surg.,240:667-74(2004).

Dynavax Technologies Corporation(2016).Study of SD-101in Combinationwith Localized Low-dose Radiation in Patients with Untreated Low-grade B-cellLymphoma.2016.ClinicalTrials.gov[Internet].Bethesda(MD):National Library ofMedicine(US).Identifier:NCT02266147.可获得自：https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02266147.(2016年7月1日引用).

Emens等人，European journal of cancer 81,116-129(2017).

Erathodiyil和Ying,Acc Chem Res.44:925–935(2011)

Fang等人，Seminars in immunology 31,37-54(2017).

Farkona,等人，BMC medicine 14,73(2016).

Faveeuw等人，Cancer Res.74(6):1632-1638(2014).

Ferlazzo等人，The Journal of Immunology 172,1333-1339(2004).

Fernandes-Alnemri等人，Nature,458:509–513(2009).

Field等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,58:1004-1010(1967).

Fitzgerald-Bocarsly等人，Biochimie 89,843-855(2007).

Fu等人，Sci.Transl.Med.,7(283):283ra252(2015).

Fukuda,Curr.Protocols Molec.Biol.(Suppl.26),17.5.1-17.5.8(1994).

Gao等人，Nat Biotechnol.,22(8):969-976(2004).

Gao等人，Science,341:903–906(2013a).

Gao等人，Cell,153:1094–1107(2013b).

Gerard和Cavalieri,Clin Nucl Med.27(1):1–8(2002).

Ghosh和Heston,J Cell Biochem.91(3):528–539(2004).

Giaccone等人，Clin.Cancer Res.8:3702-3709(2002).

Gitlin等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,103:8459-8464(2006).

Goh和Sorkin,Cold Spring Harb.Perspect.Biol.,5:a017459(2013).

Graversen和Moestrup,Membranes 5:228-52(2015).

Gray和Brown,Chem Rev.114:1020–1081(2013).

Gregory等人，Methods in Molecular Biology,342:33-47(2006).

Gupta等人，“Abstract CT091:Safety and pharmacodynamic activity ofMEDI9197,aTLR 7/8agonist,administered intratumorally in subjects with solidtumors,”Cancer Research,AACR Annual Meeting 2017；April 1-5,2017(2017年7月发表)).

Hansen等人，EMBO J.,33(15):1654-66(2014).

Harry,E.J.,Mol.Microbiol.,40(4):795-803(2001).

He等人，Materials Today Chemistry 4:106-16(2017).

Hershey,J.Allergy Clin.Immunol.,111:677-90(2003).

Hiraga等人，J.Bacteriol.,171:1496-1505(1989).

Hobbs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(8):4607-4612(1998).

Holman和Tumeh,JAMA263(4):561–564(1990).

Hornung等人，Nature,458:514–518(2009).

Hu&Lutkenhaus,Mol.Microbio.,34(1):82-90(1999).

Iftode等人，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,34:141-80(1999).

Igarashi等人，Int J Clin Med.2:500–508(2011).

Immune Design(2016),Merck Sharp&Dohme Corp.Study of IntratumoralG100with or without Pembrolizumab in Patients with Follicular Non-Hodgkin’sLymphoma.2017.ClinicalTrials.gov[Internet].Bethesda(MD):National Library ofMedicine(US).Identifier:NCT02501473.可获得自：https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02501473.(2016年7月1日引用).

Ireton等人，J.Bacteriol.,176:5320-29(1994).

Jarboe等人，Cancer Res.,67:7983-86(2007).

Jenkins等人，British journal of cancer 118,9-16(2018).

Jung等人，Translational oncology 11,686-690(2018).

Kao等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.,191(12):1467-1469(2015).

Kao等人，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine191,1467-1469(2015).

Kawai和Akira,Nat.Immunol.,11:373–384(2010).

Kelly等人，J.Drug Delivery(2011).

Khalil等人，Proc Nat’l Acad.USA,106:11667-72(2009).

Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:15181–15186(2010).

Kota等人，Cell,137:1005-17(2009).

Kramer-Marek等人，Tumour Biol.33(3):629–640(2012).

Kranzusch等人，Cell Rep.,3:1362–1368(2013).

Krieg等人，Nature,374:546-549(1995).

Kwekkeboom等人，J Clin Oncol.26(13):2124–2130(2008).

Landskron等人，Journal of immunology research 2014,149185(2014).

Lee等人，Cancers 3,3856-3893(2011).

Lemmon和Schlessinger,Cell,141(7):1117-134(2010).

Leung和Amarasinghe,Curr.Opin.Struct.Biol.,36:133–141(2016).

Li等人，Acta Biomater.73:412-23(2018).

Li等人，Science,341:1390–1394(2013b).

Liu等人，Science,347(6227):aaa2630(2015).

Lu等人，Structure,18:1032–1043(2010).

Ma等人，Mol.Microbiol.,54:99-108(2004).

MacDiarmid等人，PLoS One,11(4)(2016).

MacDiarmid等人，Nature biotechnology 27,643-651(2009).

MacDiarmid等人，Cell cycle 6,2099-2105(2007a).

MacDiarmid等人，Cancer cell 11,431-445(2007b).

Majkowska等人，Appl Radiat Isot.67(1):11–13(2009).

Mankan等人，EMBO J.,33:2937–2946(2014).

McWhirter等人，J.Exp.Med.,206:1899–1911(2009).

Marq等人，J.Biol.Chem.,286:6108–6116(2011).

Matsuno et al.J Gastroenterol.32:579–586(1997).

MedImmune LLC(2016).A Study of MEDI9197 Administered in Subjects withaSolid Tumor Cancer.2018.ClinicalTrials.gov[Internet].Bethesda(MD):NationalLibrary of Medicine(US).Identifier:NCT02556463.可获得自：https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02556463.(2016年7月1日引用).

Mellman等人，Nature 480,480-489(2011).

Merrifield,Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol.32:221–296(2006).

Meulen和Brady,Hum.Vaccin.Immunother.,13(1):15-16(2017).

Mhawech-Fauceglia等人，Histopathology50(4):472–483(2007).

Morvan等人，Nature reviews Cancer 16,7-19(2016).

Muller等人，Frontiers in immunology 8,304(2017).

Müller等人，J Nucl Med.53(12):1951–1959(2012).

Nakamura等人，J.of Controlled Release 171:216-224(2013).

NHMRC Clinical Trials Centre,University of Sydney Australian NewZealand Clinical Trials Registry:Sydney(NSW):(2017)-IdentifierACTRN12617000037303APhase 1Study of Anti-Human EGFR(Vectibix Sequence)Targeted EDVs Carrying the Cytotoxic Drug PNU-159682(EGFR(V)-EDV-PNU)withConcurrent Non-Targeted EDVs Carrying an Immunomodulatory Adjuvant(EDV-40mer)in Subjects with Advanced Solid Tumours who have No Curative TreatmentOptions 2017January 10；https://www.anzctr.org.au/ACTRN12617000037303.aspx.

Nielsen et al,Biochim.Biophys.Acta,,1591(1-3),109-118(2002).

Nieth等人，FEBS Lett.,545:144-50(2003).

Oh和Park,Advanced Drug Delivery Rev.,61:850-62(2009).

Ohki-Hamazaki et al.Int J Dev Biol.49:293–300(2005).

Oiseth等人，Journal of Cancer Metastasis and Treatment 3,250(2017).

Okada等人，J.Bacteriol.,176:917-22(1994).

Okano等人，J.Am.Chem.Soc.,128:7136-37(2006).

Oncovir Inc.(2016),National Institutes of Health,Icahn School ofMedicine at Mount Sinai,Bay Hematology Oncology,Emory University,Universityof Pittsburgh,National Cancer Institute.In Situ,Autologous TherapeuticVaccination Against Solid Cancers with Intratumoral2018.ClinicalTrials.gov[Internet].Bethesda(MD):National Library of Medicine(US).Identifier:NCT02423863.可获得自：https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02423863.(2016年7月1日引用).

Oritz-Zapater等人，Nature Medicine,18(1):83-90(2011).

Orzalli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109:E3008–E3017(2012).

Park等人，Breast Cancer Res.,4(3):95-99(2002).

Palmedo H.Radionuclide therapy of bone metastases.In:Biersack HJ,Freeman LM,editors.Clinical Nuclear Medicine.Berlin,Heidelberg:SpringerBerlin Heidelberg；2007:433–442.

Pillai等人，Appl Radiat Isot.59(2–3):109–118(2003).

Quintieri等人，Clinical Cancer Research 11,1608-1617(2005).

Raskin&de Boer,J.Bacteriol.,181:6419-6424(1999).

Reeve和Cornett,J.Virol.,15:1308-16(1975).

Reid等人，Annals of Oncology:Official Journal of the European Societyfor Medical Oncology 24,3128-3135(2013).

Rezvani等人，Molecular therapy:the journal of the American Society ofGene Therapy25,1769-1781(2017).

Rice等人，Semin.Nucl.Med.,41:265-282(2011).

Ruoslahti,Annu Rev Cell Dev Biol.12:697–715(1996).

Sagnella等人，Molecular cancer therapeutics 17,1012-1023(2018).

Santoni等人，J Biol Regul Homeost Agents.28(4):555–563(2013).

Sawa-Wejksza等人，Archivum immunologiae et therapiae experimentalis66,97-111(2018).

Sazar,“Activating the Natural Host Defense；Hiltonol(Poly-ICLC)andMalignant Brain Tumors,Oncovir,Inc.,www.oncovir.com/id2(2018年7月11日访问).

Sharma等人，Cell 168,707-723(2017).

Sharpe,Immunological reviews 276,5-8(2017).

Showalter,Cytokine 97,123-132(2017).

Silver等人，Clin Cancer Res.3(1):81–85(197).

Simmons等人，The Journal of Immunology 188,3116-3126(2012).

Singh,Biomed Res Int.2014:874610(2014).

Sioud,M.,Trends Pharmacol.Sci.,25:22-8(2004).

Schoggins等人，Nature,505:691–695(2014).

Solomon等人，PLos One,10:1-17(2015).

Staudacher等人，British journal of cancer 117,1736-1742(2017).

Strand,FL.Neuropeptides:Regulators of Physiological Processes.MITpress；1999.

Stewart和D’Ari,J.Bacteriol.,174:4513-6(1992).

Sun等人，Science,339(6121):786–791(2013).

Sun等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,280:788(2001).

Sun等人，Adv Drug Deliv Rev.110-111:38-51(2017).

Szkandera等人，British journal of cancer 110,183-188(2014).

Takahashi等人，Adv Funct Mater.18:2079–2088(2008).

Takaoka等人，Nature,448:501–505(2007).

Takeshita等人，Molec.Ther.,18:181-87(2010).

Tanpure等人，Bioorg.Med.Chem.,21:8019-32(2013).

Tatemoto,K.Neuropeptide Y:history and overview,Neuropeptide Y andRelated Peptides.Springer；2004.p.1-21.

Teunissen等人，Best Pract Res Clin Gastroenterol.19(4):595–616(2005).

Tyler-McMahon等人，Regul Pept.93:125–136(2000).

Unterholzner等人，Nat.Immunol.,11:997–1004(2010).

Unterholzner等人，Immunobiology,128(11):1312-21(2013).

van Zandwijk等人，Lancet Oncol.,18(10):1386-1396(2017).

van Zandwijk等人，The Lancet Oncology 18,1386-1396(2017).

Ventola,Pharmacy and Therapeutics 42,452-463(2017).

Wallace等人，Springer seminars in immunopathology 27,49-64(2005).

Walrand等人，J Nucl Med.56(3):494–495(2015).

Wang等人，Nat.Struct.Mol.Biol.,17:781–787(2010).

Wang等人，Immunity,41(6):919-33(2014).

Weckbecker等人，Nat Rev Drug Discov.2:999–1017(2003).

White&McCubrey,Leukemia,15:1011-1021(2001).

Whittle等人，J.Clin.Neurosci.,22(12):1889-1894(2015).

Whittle等人，Journal of clinical neuroscience:official journal of theNeurosurgical Society of Australasia 22,1889-1894(2015).

Wu等人，Science,339:826–830(2013).

Wykosky等人，Clin Cancer Res.,14:199-208(2008).

Xia等人，Nat.Immunol.,16:366–375(2015).

Yague等人，Gene Ther.,11:1170-74(2004).

Yang等人，Clin Cancer Res.14:5494–5502(2008).

Yang等人，Nat.Immunol.,11:487–494(2010).

Yi等人，PLoS One,8(10):e77846(2013).

Yuan等人，Scientific reports 5,14273(2015).

Zhang等人，J.Immunol.,186:4541–4545(2011a).

Zhang等人，Nat.Immunol.,12:959–965(2011b).

Zhang等人，Cell Rep.,6:421–430(2014).

Zibert等人，Human Gene Therapy 15,21-34(2004).

Ziegler-Heitbrock等人，Frontiers in immunology 4,23(2013).

Zitvogel等人，Nature reviews Immunology 15,405-414(2015).

美国专利号8,591,862.

美国专利号7,183,105.

US2008/0051469.

US2008/0038296

US2015/0283235

US2017/0368002

WO 2000/067776.

WO 2003/033519.

WO 2004/113507.

WO 2005/056749.

WO 2005/079854.

WO 2009/027830。