阅读说明：本技术 一种优化的适用于绵羊染色体二元流式分选的染色体悬液制备方法 (Optimized preparation method of chromosome suspension suitable for binary flow sorting of sheep chromosomes ) 是由 邓学梅 姚延珠 于 2020-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种优化的适用于绵羊染色体二元流式分选的染色体悬液制备方法。本发明提供了一种绵羊染色体悬液的制备方法,包括如下步骤：将同步化至M期的绵羊成纤维细胞依次进行过滤、低渗处理和裂解,得到绵羊染色体悬液。本发明的试验证明了经细胞筛过滤后收集的M期绵羊成纤维细胞所制备的绵羊染色体悬液经流式细胞仪分析后,所得绵羊二元流式核型图比未经过过滤的M期绵羊成纤维细胞制备的染色体悬液所得绵羊二元流式核型图具有更高的分辨率,更清晰。为一种优化的适用于绵羊二元流式分选的染色体悬液制备的方法。(The invention discloses an optimized preparation method of chromosome suspension suitable for binary flow sorting of sheep chromosomes. The invention provides a preparation method of a sheep chromosome suspension, which comprises the following steps: and sequentially filtering, hypotonic treating and cracking the sheep fibroblasts synchronized to the M stage to obtain the sheep chromosome suspension. The experiment proves that after the sheep chromosome suspension prepared from the M-phase sheep fibroblasts collected after filtration by the cell sieve is analyzed by the flow cytometer, the obtained sheep binary flow karyotype chart has higher resolution and is clearer than the sheep binary flow karyotype chart prepared from the chromosome suspension prepared from the M-phase sheep fibroblasts which are not filtered. Is an optimized method for preparing chromosome suspension suitable for sheep binary flow sorting.)

一种优化的适用于绵羊染色体二元流式分选的染色体悬液制 备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种优化的适用于绵羊染色体二元流式分选的染色体悬液制备方法。

背景技术

人类，动物和植物的核基因组形成的亚单位称为染色体。当中期染色体分散在悬浮液中时，可根据光散射和荧光参数使用流式细胞仪对其进行分类。用流式细胞术分析染色体得到的核型图称为流式核型图。动物染色体的流式核型图是某一物种的染色体悬液，用两种分别与AT和GC特异性结合的荧光染料(通常是Hoechst 33258-AT特异性结合和chromomycin A3-GC特异性结合)染色后，经流式细胞仪分析，可以分离出不同大小和AT/GC含量的染色体，所获得流式核型图称之为二元流式核型图。但是，大小和GC含量差异小的染色体不易分离。根据两种染料的荧光强度产生所谓的二元流式核型，在高质量样品和良好条件下，流式分选染色体纯度可达95％以上。

染色体流式分选在核基因组结构分析和特殊染色体和异常染色体分析中有重要作用。经流式细胞术分选的染色体已用于DNA杂交、DNA文库、物理作图和染色体测序等基因组学的研究。染色体的流式分选以其高纯度、大批量分离单个染色体的能力，已成为染色体基因组学研究的一个有吸引力和强大的工具。

绵羊染色体的流式分类早在1992年就有报道，只有前三个大的染色体和其他五个染色体簇能被分辨出来。1997年获得了绵羊的高分辨率流式核型，其中几乎所有的染色体都被分离鉴定。但此后绵羊染色体流式分选的应用鲜有报道。这可能是由于其染色体悬液的制备条件不稳定，较难得到稳定清晰的绵羊二元流式核型图。

二元流式核型图的分辨率与流式细胞仪的硬件设施和详细设备使用参数以及染色体悬液的样品质量等多个因素相关。

染色体悬液制备的质量是染色体流式细胞术分选染色体的关键。高质量的染色体样本在合适的染色体分离缓冲液中含有大量的单染色体，而所含有的细胞核碎片和凝集的染色体团块较少。哺乳动物的染色体悬液一般从处于细胞周期中M期的细胞制备而来。因此细胞的生长状态，M期细胞的处理方式均可能对染色体悬液制备的质量产生影响，从而影响最终的二元流式核型图的清晰度。

发明内容

本发明是在绵羊的二元流式分选的过程中，发现绵羊染色体悬液的制备质量对最终产生的绵羊二元流式核型图的清晰度具有较敏感的影响，从而对染色体悬液的制备的某一因素进行了优化。

本发明一个目的是提供一种优化的适用于绵羊二元流式分选的染色体悬液制备的方法。

本发明提供的一种绵羊染色体悬液的制备方法，包括如下步骤：

1)将同步化至M期的绵羊成纤维细胞过滤，得到过滤后细胞；

2)用所述过滤后细胞制备绵羊染色体悬液。

上述方法中，所述过滤的孔径大小为40μm。

上述方法中，所述过滤采用40μm细胞筛进行。

上述用过滤后细胞制备绵羊染色体悬液包括如下步骤：

2)-A，将所述过滤后细胞低渗处理，得到低渗处理后细胞；

2)-B，裂解所述低渗处理后细胞，得到绵羊染色体悬液。

上述裂解采用PAB溶液(15mM tris，2mM EDTA，0.5mM EGTA，80mM KCl，3mM二硫苏糖醇，0.25％(体积分数)triton X-100，0.2mM亚精胺，0.5mM亚精胺，余量为水，pH 7.5)；

上述低渗处理为收集能够通过滤筛的细胞，并289×g离心5分钟，加入15ml低渗液室温(25℃)低渗30分钟；上述低渗液：75mM KCl，0.2mM亚精胺，0.5mM亚精胺，10mM MgSO4·7H2O，余量为水，pH 8.0。

上述方法中，所述同步化至M期的绵羊成纤维细胞按照如下方法制备：将离体绵羊成纤维细胞通过双TDR阻抑同步化至S期，再将同步化至S期的细胞经Nocodazole处理同步化至M期，得到同步化至M期的绵羊成纤维细胞。

由上述方法制备的绵羊染色体悬液也是本发明保护的范围。

上述方法或上述的绵羊染色体悬液在制备绵羊二元流式核型图中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种提高绵羊二元流式核型图清晰度的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)采用上述方法制备，得到绵羊染色体悬液；

2)将所述绵羊染色体悬液用双激光流式细胞仪检测，实现提高绵羊二元流式核型图清晰度。

上述提高绵羊二元流式核型图清晰度为采用上述方法(包括过滤)制备绵羊染色体悬液的绵羊二元流式核型图清晰度高于不采用上述方法中的过滤步骤制备的绵羊染色体悬液的绵羊二元流式核型图清晰度。

经过40μm细胞筛过滤后同步化至M期的绵羊成纤维细胞在制备绵羊染色体悬液中的应用也是本发明保护的范围；

或，40μm细胞筛在制备绵羊染色体悬液中的应用也是本发明保护的范围；

或，40μm细胞筛、低渗液和细胞裂解液在制备绵羊染色体悬液中的应用也是本发明保护的范围。

本发明提供的方法，包括如下内容：将同步化至M期的绵羊成纤维细胞收集后，经细胞筛过滤，过滤后的M期绵羊成纤维细胞用PAB溶液进行裂解，所得的绵羊染色体悬液适用于流式分选，能获得比未过滤的M期细胞制备的染色体悬液更清晰的绵羊二元流式核型图。

上述方法中，所述M期的绵羊成纤维细胞是绵羊成纤维细胞经双thymidine(TDR,2mM)阻抑至S期，再由nocodazole(终浓度100ng/ml)阻抑至M期。

上述方法中，经40μm细胞筛过滤后的M期绵羊成纤维细胞所制备的染色体悬液比未过率的M期细胞制备的染色体悬液更清晰的绵羊二元流式核型图。

本发明实验证明，经细胞筛过滤后收集的M期绵羊成纤维细胞所制备的绵羊染色体悬液经流式细胞仪分析后，所得绵羊二元流式核型图比未经过过滤的M期绵羊成纤维细胞制备的染色体悬液所得绵羊二元流式核型图具有更高的分辨率，更清晰。为一种优化的适用于绵羊二元流式分选的染色体悬液制备的方法。

附图说明

图1为分离纯化的绵羊原代成纤维细胞(200×)。

图2为绵羊皮肤成纤维细胞S期同步化效果；(A)为经双TDR阻抑后细胞周期分布图；(B)未经任何处理的正常对照组细胞各细胞周期分布图。

图3为绵羊皮肤成纤维细胞M期同步化效果；(A)为M期同步化后细胞周期分布图；(B)未经任何处理的正常对照组细胞各细胞周期分布图。

图4为绵羊二元流式核型；(A)和(B)为经40μm细胞筛过滤的M期细胞所制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图；(C)和(D)为未经过滤处理的M期细胞所制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下所有实施例中的完全培养基成分为：含有10％(体积分数)FBS和1％(体积分数)Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100×)(Gibco,货号10378016)的DMEM培养基(gibico公司，货号11995065)。

实施例1、绵羊原代皮肤成纤维细胞的分离、纯化及培养

从一只25岁的健康美利奴公绵羊身上切下一小块耳组织(10×10mm)。将组织灭菌眼科剪剪碎成肉糜状(1mm×1mm),均匀铺于培养皿，倒置于37℃的含有5％CO₂的恒温培养箱中，30min后将培养皿正置并且加入少量的完全培养基。过夜后，再向其中加入10mL完全培养基。之后每两天换一次液，直至组织块周围有细胞爬出。

绵羊原代成纤维细胞进行传代培养，待细胞生长至汇合率约80％时，弃掉培养基，PBS溶液洗清2次，加入0.1％胰蛋白酶溶液，至于37℃培养箱孵育60-90s，待细胞变圆后，加入适量消化终止液，轻拍培养皿，并用枪头吹吸终止消化液清洗培养皿底部几次，使得尽可能多的细胞被消化下来，转移至15mL离心管，1500rpm离心8min，收集细胞。弃掉离心管中的上清，将底部细胞重新悬浮于完全培养液中，分装于新的培养皿中，至于37℃的含有5％CO₂的恒温培养箱中继续培养，得到传代的绵羊原代皮肤成纤维细胞。

分离纯化的绵羊原代成纤维细胞结果如图1所示。

实施例2、绵羊皮肤成纤维细胞S期同步化

1、绵羊皮肤成纤维细胞S期同步化

1)第1次TDR阻断培养

将传代至第5代次(图2具体采用的是传代5次，第5代细胞)的绵羊原代皮肤成纤维细胞，加入胸腺嘧啶核苷(TDR，Sigma,T1895-1G)终浓度为2mM/L，继续培养18h。

2)第2次TDR阻断培养

将经过1)处理后的细胞用PBS清洗细胞三次以去除胸腺嘧啶核苷，加入完全培养基继续培养10h后，加入胸腺嘧啶核苷(TDR，Sigma,T1895-1G)终浓度为2mM/L，继续培养18h。

相同代次，不做任何药物处理的绵羊皮肤成纤维细胞作为正常对照组细胞。

2、检测

收获上述各组细胞，PBS缓冲液洗一遍，用70％酒精固定过夜后，用40μg/mL的PI染液染色，经BD-FACS-Calibur流式细胞仪分析检测细胞周期。使用FlowJo软件计算细胞周期。

绵羊皮肤成纤维细胞S期同步化效果如图2所示，(A)为是经TDR两次阻抑后各细胞周期分布图；(B)未经TDR处理的正常对照组细胞各细胞周期分布图；图中纵坐标count是指细胞数目，横坐标PE-A是流式检测设定的门，该门使用的是近似于二倍体细胞的DNA荧光值的积分面积，用来表示DNA的含量；由图2可见，经TDR两次阻抑后，有76.4％的细胞处于S期(图2A)，而未经同步化处理的对照组仅有18.74％的细胞处于S期(图2B)。

因此，可以看出，经双TDR处理后，76.4％的细胞可同步化至S期，上述2次TDR阻断培养后绵羊皮肤成纤维细胞为同步化至S期的绵羊皮肤成纤维细胞。

实施例3、绵羊皮肤成纤维细胞M期同步化

1、绵羊皮肤成纤维细胞M期同步化

将实施例2中获得的同步化至S期的绵羊皮肤成纤维细胞，PBS缓冲液洗3遍除去TDR，然后再置于含有终浓度100ng/ml的诺考达唑(Sigma公司，货号M1404-2MG)完全培养基中培养6h。

相同代次，不做任何处理的正常生长的绵羊成纤维细胞作为正常对照组细胞。

2、检测

收获细胞，PBS缓冲液洗一遍，用70％酒精固定过夜后，用40μg/mL的PI染液染色，经BD-FACS-Calibur流式细胞仪分析检测细胞周期。

使用FlowJo软件计算细胞周期。

绵羊皮肤成纤维细胞M期同步化效果如图3所示，图中纵坐标count是指细胞数目，横坐标PE-A是流式检测设定的门，该门使用的是近似于二倍体细胞的DNA荧光值的积分面积，用来表示DNA的含量；图3A是经M期同步化处理后，各细胞周期分布图，图3B是未经任何处理的正常对照组细胞各细胞周期分布图；由图3可见，经M期同步化后，有88.2％的细胞处于M期(图3A)，而未经同步化处理的对照组仅有21.93％的细胞处于M期。经M期同步化处理后，大部分的细胞可同步化至M期，M期细胞比例可达88.2％。

实施例4、绵羊染色体悬液的制备及绵羊二元流式核型图的产生

一、绵羊染色体悬液的制备

经实施例3制备的同步化至M期的绵羊皮肤成纤维细胞。轻拍培养皿后收集培养基于15ml离心管中，289×g离心5分钟，弃掉上清，保留离心管底部的M期细胞。

1、过筛和低渗处理

试验组：向收集的约0.5×10⁵个M期细胞中加入1ml PBS缓冲液(配方，直接购买的，Gibco公司，货号14190250)，经40μm细胞筛(Corning公司,货号431750)过滤；收集能够通过滤筛的细胞，并289×g离心5分钟，加入15ml低渗液室温(25℃)低渗30分钟，得到试验组低渗处理后细胞。

对照组：向收集的约0.5×10⁵个M期细胞直接加入15ml低渗液室温低渗30分钟，得到对照组低渗处理后细胞。

上述低渗液：75mM KCl，0.2mM亚精胺，0.5mM亚精胺，10mM MgSO4·7H2O，余量为水，pH 8.0。

2、制备染色体悬浮液

将上述对照组低渗处理后细胞和实验组低渗处理后细胞，289×g离心5分钟，弃掉上清液，收集沉淀加入1ml PAB裂解缓冲液(15mM tris，2mM EDTA，0.5mM EGTA，80mM KCl，3mM二硫苏糖醇，0.25％(体积分数)triton X-100，0.2mM亚精胺，0.5mM亚精胺，余量为水，pH 7.5)，在冰上孵育10分钟后，涡旋30秒，然后以201×g的速度离心2分钟，所获得的悬液即为染色体悬液，得到对照组染色体悬浮液和实验组染色体悬浮液。

3、流式检测

上述2得到的染色体悬液用5μg/mL的Hoechst 33258(Sigma)，40μg/mL的Chromomycin A3(Sigma)包含10mM MgSO₄染色过夜后进行流式检测。

在流式细胞术分析之前至少1小时，将终浓度为10mM柠檬酸钠和25mM亚硫酸钠添加到对照组染色体悬浮液和实验组染色体悬浮液中。使用FACSAria SORP Plus双激光流式细胞仪(Becton Dickinson)进行双变量分析。

实验组(经细胞筛过滤的M期细胞)和对照组(未经细胞筛过滤的M期细胞)所产生的绵羊二元流式核型图如图4所示，图4A和图4B为试验组制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图，其中图4A为实验组悬液获得的完整的绵羊二元流式核型图，图4B为图4A左下方方框区域的放大图；图4C和图4D为对照组制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图，其中图4C为对照组悬液获得的完整的绵羊二元流式核型图，图4D为图4C左下方方框区域的放大图。由图4可见，经40μm细胞筛过滤的M期细胞所制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图(图4A和图4B)分辨率较高，背景清晰，杂质较少，各染色体簇可被清晰辨认。而未经过滤的M期细胞所制备的染色体悬液经流式细胞仪分选后产生的绵羊二元流式核型图(图4C和图4D)含有大量的其他杂质碎片，分辨率较低，图像模糊，只能辨认少数染色体簇，还有较多染色体不能被清晰辨认。

由图4可见，经40μm细胞筛过滤后收集的M期绵羊成纤维细胞所制备的绵羊染色体悬液经流式细胞仪分析后，所得绵羊二元流式核型图比未经过过滤的M期绵羊成纤维细胞制备的染色体悬液所得绵羊二元流式核型图具有更高的分辨率，更清晰。