阅读说明：本技术 一种***相关基因甲基化检测方法 (Methylation detection method for cervical cancer related gene ) 是由 刘文兰 徐迹 李赟 徐勇 余志英 黄建林 林穆奇 于 2020-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法。述检测方法包括以下步骤：(1)样本DNA的提取：从宫颈脱落细胞样本中提取得到样本DNA；(2)样本DNA的转化纯化：将提取得到的样本DNA进行重硫酸盐转化反应后纯化,得到Bis DNA；(3)Bis DNA的PCR扩增：采用PCR扩增液对Bis DNA进行探针荧光定量PCR扩增；(4)根据探针荧光定量PCR扩增的结果确定待检测样本的甲基化值。所述检测方法具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点。(The invention provides a methylation detection method of a gene related to cervical cancer. The detection method comprises the following steps: (1) extraction of sample DNA: extracting sample DNA from a cervical exfoliated cell sample; (2) transformation and purification of sample DNA: performing a bisulfate conversion reaction on the extracted sample DNA, and then purifying to obtain Bis DNA; (3) PCR amplification of Bis DNA: performing probe fluorescent quantitative PCR amplification on the Bis DNA by using a PCR amplification solution; (4) and determining the methylation value of the sample to be detected according to the result of the fluorescent quantitative PCR amplification of the probe. The detection method has the characteristics of high speed, high flux, sensitivity and good specificity.)

一种***相关基因甲基化检测方法

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种***相关基因甲基化检测方法。

背景技术

高危型人类***瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续性感染是***的病因。但宫颈上皮的癌变过程还包括许多基因和表观基因的改变。DNA甲基化是最常见的表观遗传改变，常发生于肿瘤抑制基因的启动子区域，造成该基因的转录失活，从而促使肿瘤的发生。现有文献报道的***中可检测到DNA甲基化，且可见于30％～80％的***前期病变中。已有研究表明，检测宫颈脱落细胞中特定基因的甲基化可能作为潜在的分子标志物用于***的早期检测。

目前采用的***常规筛查技术为HPV检测，其中HPV-DNA检测：该技术灵敏度高，特异性低，检测方法通量高，适用于大规模临床筛查，但是假阳性率高，只能预警而非早期发现。HPV-E6E7mRNA检测：该技术灵敏度高，特异性一般，检测方法分型体系复杂，RNA不稳定，检测的是病毒而非个体基因，也只能预警而非早期发现。而以往采用甲基化特异PCR(methylation specific PCR，MSP)的方法发现CDH1、p16、SOX1、RASSFA1基因在***前期病变和浸润性***中的甲基化状态存在差异。传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。

因此，有必要提供一种***基因的甲基化检测方法来克服上述缺陷。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种***相关基因甲基化检测方法。所述检测方法通过设计特异性高的引物及探针，并设计出科学合理的PCR反应体系，具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种***相关基因甲基化检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)样本DNA的提取：从宫颈脱落细胞样本中提取得到样本DNA；

(2)样本DNA的转化纯化：将提取得到的样本DNA进行重硫酸盐转化反应后纯化，得到Bis DNA；

(3)Bis DNA的PCR扩增：采用PCR扩增液对Bis DNA进行探针荧光定量PCR扩增，所述PCR扩增液包括：PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1检测探针、HPV16正向引物、HPV16反向引物、HPV16检测探针、HPV18正向引物、HPV18反向引物、HPV18检测探针、ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB检测探针、脱氧核糖核苷三磷酸和无核酸酶水；

(4)根据探针荧光定量PCR扩增的结果确定待检测样本的甲基化值。

在本发明中，在人基因组中PAX1基因和内标基因ACTB(b-actin)的启动子区分别设计一对特异性的甲基化检测的引物及探针。然后用该引物及探针去扩增经亚硫酸盐转化的样本DNA，根据PAX1与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待测样本的甲基化值，根据甲基化值来评判***变的风险。在此基础上，将HPV16和HPV18相结合，作为辅助PAX1基因检测***的生物标志物，避免了非甲基化DNA的影响，从而使具有快速、灵敏度和特异性高等优点。

优选地，步骤(1)中所述提取具体包括以下步骤：先将宫颈脱落细胞样本进离心后移除上清液，得到样本沉淀物；将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，涡旋后进行孵育，得到样本DNA。

优选地，所述离心的时间为1-2min，例如可以是1min、1.2min、1.4min、1.6min、1.8min、2min等，所述离心的转速为10000-15000rpm，例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm等。

优选地，所述宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为(100-200):(1-3):(20-30)；

其中，“100-200”可以是100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200等；

其中，“1-3”可以是1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3等；

其中，“20-30”可以是20、22、24、26、28、30等。

优选地，所述孵育的时间为20-40min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min、40min等，所述孵育的温度为60-70℃，例如可以是60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃等。

优选地，步骤(2)中所述重硫酸盐转化反应的具体步骤为：先将步骤(1)提取得到的样本DNA、亚硫酸氢钠溶液、DNA凝胶加样缓冲液和水混合，升温至90-100℃(例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃等)反应5-15min(例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、15min等)，后降温至60-65℃(例如可以是60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃等)反应2-3h(例如可以是2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h等)，最后以0-10℃(例如可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃等)保持4-5h(例如可以是4h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h、5h等)。

优选地，所述样本DNA、亚硫酸氢钠溶液、DNA凝胶加样缓冲液和水的体积比为1:(80-90):(30-40):1；

其中，“80-90”例如可以是80、82、84、86、88、90等；

其中，“30-40”例如可以是30、32、34、36、38、40等。

优选地，所述亚硫酸氢钠溶液的质量浓度为40-50wt％，例如可以是40wt％、42wt％、44wt％、46wt％、48wt％、50wt％等。

优选地，步骤(2)中所述纯化的具体步骤为：将重硫酸盐转化反应得到的反应液采用UNIQ-10柱进行纯化，并用洗涤缓冲液清洗，脱磺化液脱磺化，最后用TE洗脱液洗脱，得到Bis DNA。

优选地，所述洗涤缓冲液按物质的量浓度计包括：1-3mM(例如可以是1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM等)的Tris、1-3mM(例如可以是1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM等)的NaCl和0.1-0.5mM(例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM等)的EDTA二钠，所述洗涤缓冲液的溶剂为乙醇水溶液。

优选地，所述磺化液按物质的量浓度计包括：40-60mM(例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM、60mM等)的Tris、50-150mM(例如可以是50mM、70mM、90mM、110mM、130mM、150mM等)的NaCl、150-250mM(例如可以是150mM、170mM、190mM、210mM、230mM、250mM等)的NaOH，所述磺化液的溶剂为乙醇水溶液。

优选地，步骤(2)中所述PAX1正向引物的序列为5'-TTAGGGGGTAGTTGAGTAAGTT-3'，所述PAX1反向引物的序列为5'-AAAATAACCTATAAATCCCCAAACAA-3'，所述PAX1检测探针的序列为5'-AAATAAAACGCGACGCATTAT-3'。

优选地，所述HPV16正向引物的序列为5'-TGACACAGAAAATGCTAGTGCT-3'，所述HPV16反向引物的序列为5'-TCACCTGGATTTACTGCAACAT-3'，所述HPV16检测探针的序列为5'-AGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCC-3'。

优选地，所述HPV18正向引物的序列为5'-AATGTCTGCAGATCCTTATGGG-3'，所述HPV18反向引物的序列为5'-CTTGGAGAGGGAGAATACACAC-3'，所述HPV18检测探针的序列为5'-CAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCA-3'。

优选地，所述ACTB正向引物的序列为5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'；所述ACTB反向引物的序列为5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3'；所述ACTB检测探针的序列为5'-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'。

上述所有引物和探针检测探针的序列的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

优选地，步骤(2)中所述PCR扩增液按物质的量浓度计包括：0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的PAX1正向引物、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的PAX1反向引物、0.2-0.5μM(例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等)的PAX1检测探针、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的HPV16正向引物、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的HPV16反向引物、0.2-0.5μM(例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等)的HPV16检测探针、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的HPV18正向引物、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的HPV18反向引物、0.2-0.5μM(例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等)的HPV18检测探针、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的ACTB正向引物、0.1-0.3μM(例如可以是0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM等)的ACTB反向引物、0.2-0.5μM(例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等)的ACTB检测探针、0.2-0.5μM(例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等)的脱氧核糖核苷三磷酸，所述PCR扩增液的溶剂为无核酸酶水。

优选地，步骤(2)中所述PCR扩增液和所述Bis DNA的体积比为(2-4):1，例如可以是2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1等。

优选地，步骤(2)中所述扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸40s，共50个循环；4℃保存。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所述***相关基因甲基化检测方法具有快速、灵敏度和特异性高等优点。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

选取在深圳市第二人民医院就诊的发现宫颈异常的门诊患者为研究对象，排除妊娠、宫颈切除史，恶性肿瘤史患者。***前病变组(宫颈上皮内瘤变CIN Ⅰ，CIN Ⅱ，CINⅢ)。取材在非经期内进行，检查前三天内禁止性生活，禁止***内反复清洁及用药。用颈管刷收集宫颈口及宫颈管脱落的细胞样本，***镜下钳取少量宫颈组织进行病理活检。样本保存于-20℃待用。

蛋白酶K购于北京索莱宝科技有限公司、裂解液ABL购于北京碧橙蓝生物科技、DNA凝胶加样缓冲液(10×DNA Loading Buffer)购于北京雷根生物技术有限公司、TE洗脱液购于上海研拓生物科技有限公司，脱氧核糖核苷三磷酸翊圣生物、无核酸酶水购于上海联迈生物工程有限公司

实施例1

本实施例提供一种***相关基因甲基化检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)样本DNA的提取：取1.5mL的宫颈脱落细胞样本加入无菌EP管中以12000rpm的转速离心1.5min后移除上清液，得到样本沉淀物；向得到的沉淀物中依次加入25μL的蛋白酶K、300μL的裂解液ABL，涡旋震荡10s，并65℃下孵育30min，得到样本DNA；

(2)样本DNA的转化纯化：将10μL提取得到的样本DNA、85μL的45wt％的亚硫酸氢钠溶液、35μL的DNA凝胶加样缓冲液和10μL的纯化水混合，升温至95℃反应10min，后降温至65℃反应2.5h，最后以5℃保持4.5h；将转化反应得到的反应液采用UNIQ-10柱进行纯化，并用洗涤缓冲液清洗，脱磺化液脱磺化，最后用TE洗脱液洗脱，得到Bis DNA；

其中，所述洗涤缓冲液按物质的量浓度计包括：2mM的Tris、2mM的NaCl和0.3mM的EDTA二钠，所述洗涤缓冲液的溶剂为乙醇水溶液；所述磺化液按物质的量浓度计包括：50mM的Tris、100mM的NaCl、200mM的NaOH，所述磺化液的溶剂为乙醇水溶液。

(3)采用PCR扩增液对Bis DNA进行探针荧光定量PCR扩增；

其中，所述PCR扩增液按物质的量浓度计包括：0.2μM的PAX1正向引物、0.2μM的PAX1反向引物、0.3μM的PAX1检测探针、0.2μM的HPV16正向引物、0.2μM的HPV16反向引物、0.3μM的HPV16检测探针、0.2μM的HPV18正向引物、0.2μM的HPV18反向引物、0.3μM的HPV18检测探针、0.2μM的ACTB正向引物、0.2μM的ACTB反向引物、0.3μM的ACTB检测探针、0.3μM的脱氧核糖核苷三磷酸，所述PCR扩增液的溶剂为无核酸酶水。

上述引物和检测探针序列如下所示：

所述扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸40s(在退火延伸过程中采集荧光)，共50个循环；4℃保存；

(4)根据探针荧光定量PCR扩增的结果确定待检测样本的甲基化值；根据PAX1、HPV16、HPV16与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待检测样本的甲基化值，其中，对同一样本DNA进行检测发现，PAX1、HPV16、HPV16的甲基化值的平均值达到15.5。

实施例2

按照实施例1的方法提取10个***患者的宫颈刷片样本和10个非***对照人群的宫颈刷片样本的基因组DNA，然后对提取的基因组DNA进行实施例1的中亚硫酸盐转化，将亚硫酸盐转化后的DNA作为模板，分别针对PAX1、HPV16、HPV16与ACTB基因，按照实施例1的PCR反应体系和反应条件，分别进行qPCR扩增(ThermoFisher公司的ABI7500荧光定量仪器)，分别计算PAX1、HPV16、HPV16相对于ACTB基因的甲基化值。

具体测试结果如表1所示：

表1

序号	***组甲基化平均值	非***组甲基化平均值
			1	15.62	0.12
2	10.18	0.11
			3	20.69	0.11
4	21.43	0.25
			5	16.55	0.09
6	15.29	0.25
			7	30.02	0.40
8	35.14	0.25
			9	10.21	0.15
10	14..88	0.08

从表1测试数据可知，***患者的宫颈细胞PAX1、HPV16、HPV16相对于ACTB基因甲基化值的平均值在10以上，非***的宫颈细胞PAX1、HPV16、HPV16相对于ACTB基因甲基化值的平均值在0.3以下，即***患者极显著高于非***对照的宫颈细胞中PAX1、HPV16、HPV16相对于ACTB基因平均值(P﹤0.01)，可见，本发明的检测方法能准确区分出***患者和非***对照，因此PAX1、HPV16、HPV16、ACTB基因可以作为辅助检测***生物标志物，就怀疑所检测的宫颈刷片样本中含有***细胞，可以通过病理方法对宫颈细胞的癌变情况进行进一步确认。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述***相关基因甲基化检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。