检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其使用方法 (Kit for detecting susceptibility to diabetic nephropathy and using method thereof ) 是由 吴慧娟 王红羽 黄洁波 蔡小凡 张志刚 许之珩 于 2020-08-14 设计创作，主要内容包括：一种检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其使用方法,其中,试剂盒包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的引物,可特异性扩增样本中ELMO1基因的SNP rs741301位点；试剂盒使用方法,包括步骤(1)提供样本；(2)提供如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的引物；(3)通过PCR,使用引物特异性扩增样本中的ELMO1基因的SNP rs741301位点,取得扩增产物；以及(4)根据扩增产物解读样本的糖尿病肾病易感性基因型。(A kit for detecting susceptibility to diabetic nephropathy and a use method thereof, wherein the kit comprises the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, the primer can specifically amplify the SNP rs741301 site of the ELMO1 gene in the sample; a method of using a kit comprising the steps of (1) providing a sample; (2) providing a polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, or a primer thereof; (3) specifically amplifying SNP rs741301 locus of ELMO1 gene in a sample by PCR (polymerase chain reaction) by using primers to obtain an amplification product; and (4) interpreting the diabetic nephropathy susceptibility genotype of the sample according to the amplification product.)
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种利用单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)评估基因与糖尿病肾病相关性的试剂盒及其使用方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种世界范围内常见慢性代谢性疾病，患者长期的高血糖状态很容易对心、脑、肾、血管壁等实质性器官和组织造成不可逆转的慢性损伤，其中，糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最为严重的并发症之一。文献研究显示，糖尿病肾病已经成为1型糖尿病(Type 1Diabetes Mellitus，T1DM)患者死亡的首要原因；在2型糖尿病(Type 2Diabetes Mellitus，T2DM)患者中，死亡率也仅次于大血管并发症。在美国，40％的终末期肾脏病(End Stage Renal Disease，ESRD)是由糖尿病肾病发展而来；在中国，该比例也占15-22％，且仍然在不断攀升，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。
此外，糖尿病肾病的起病往往较为缓慢，而2型糖尿病所致的肾病则起病更为隐匿，当患者早期以微量蛋白尿就诊时，就已经进入糖尿病肾病临床分期的第3期(GFR下降)，甚至可能已发展到了不可逆转阶段。因此，对于糖尿病肾病的早期预防和诊治就显得尤为重要。
糖尿病是典型的代谢性疾病，糖尿病肾病的发生、发展和个人的生活饮食***对于延缓糖尿病肾病的发展具有相当重要的意义。除了外在的环境因素外，糖尿病肾病同样也具有遗传上的易感性，也就是因为遗传的差异致使带有特定基因的患者发生糖尿病肾病的风险增高。近年来，有许多文献和调查报告针对糖尿病肾病遗传上的易感性进行研究，发现吞噬与细胞运动基因-1(Engulfment and Cell Motility 1，ELMO1)和2型糖尿病所导致的糖尿病肾病的发病具有一定的相关性。国外多项针对日本族群、美国非裔族群和埃及族群的遗传特性调查，以及少部分针对汉族遗传特性调查的研究，均确认了ELMO1基因在糖尿病肾病发病中的重要性，具有充分的理论基础和临床证据支持。因此利用ELMO1基因对糖尿病肾病进行遗传学评估，可达到早期预防的目标。
更具体而言，Wu等人(J.Endocrinol.Invest.36:298-302,2013)针对汉族进行ELMO1基因研究指出，位于ELMO1基因的SNP是影响研究对象糖尿病肾病易感性的重要关键，但Wu等人仅得出结论rs741301位点等位基因A可能对糖尿病肾病有预测作用，未详细理出等位基因的具体影响；Hou等人(Diabetol.Metab.Syndr.11:97,2019)指出rs741301是ELMO1的重要SNP位点，但Hou等人仅得出结论等位基因G可能与糖尿病肾病相关，未详细理出等位基因的具体影响。由此可见，针对ELMO1基因的SNP进行检测以评估糖尿病肾病的易感性是可靠的方向，然而却缺乏对rs741301等位基因的细化了解，难以作为可靠的检测指标。
此外，针对SNP检测，目前常用的方法包括测序、多聚酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)、探针方法等，其中涉及测序的方法所需试剂、仪器昂贵，较难普及应用；多聚酶链式反应扩增配合限制性内切酶片段多样性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)应用的方法，通常需要搭配探针方法、DNA测序方法、酶切反应才得以精确检测；其中探针方法则依赖杂交反应(hybridization)，通常需要设计繁复的探针并配合精细昂贵的光学检测仪器使用方可准确探测荧光，不仅制备步骤繁复，且检测成本昂贵，亦不利于推广使用。
更具体说明，虽然Wu等人及Hou等人提出的研究调查了ELMO1基因SNP特性和糖尿病肾病的关系，但对于研究的人群缺乏严谨的筛选，并未考虑到糖尿病肾病具有很长的潜伏期的特性，因此刚罹患糖尿病的患者中，可能还没有体现出肾脏受累，作为对照组来说不够严谨，非常影响研究的科学性，应当被划除。此外，Wu等人的研究中使用质谱分析(MassArray)方法分析SNP，其经济费用高昂；Hou等人则是采用PCR搭配限制性内切酶片段多样性(RFLP)的方法分析SNP，具体作法是先利用PCR扩增(复制)含有SNP的序列片段，然后用特定限制性内切酶酶切PCR扩增产物的片段，然后根据酶切图确定SNP位点的基因型，这种方法首先是酶的成本高，其次，酶切结果的精确性也有限制，并不具有绝对的可信度。
以上需求表示，目前常用的SNP检测方法在临床检测工具的应用上明显受限，因此，建立方法简便、仪器简单、效率高、成本低廉又精确的糖尿病肾病易感性SNP检测方法，显然是本领域亟待解决的需求。
发明内容
综合上述现有技术的缺陷，本发明提供一种检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其使用方法，以解决前述的技术问题。本发明提出的检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其方法，是利用设计精良的引物进行单步骤PCR，即可准确检测出糖尿病肾病易感性基因型，具备准确、快捷、简便、经济等特点，适合用于各种临床环境或健康产业中，作为评估糖尿病肾病易感性风险的辅助工具，并可帮助糖尿病患者提前预防糖尿病肾病发生或发展，做好疾病管理，从而提高糖尿病患者的生活品质。
为解决前述的技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种检测糖尿病肾病易感性的试剂盒，包括针对吞噬细胞运动蛋白-1(ELMO1)基因的单核苷酸多态性(SNP)rs741301位点设计的引物，如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的引物，这些引物特异性扩增样本中ELMO1基因的SNP rs741301位点，使这些扩增产物的序列包含与所述rs741301位点互补之碱基。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒中，如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示的引物，其扩增产物的序列长度为187bp。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒中，如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示的引物，其扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为鸟嘌呤(Guanine)。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒中，如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3所示的引物，其扩增产物的序列长度为273bp。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒中，如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3所示的引物，其扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为腺嘌呤(Adenine)。
另一方面，为解决前述的技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种检测糖尿病肾病易感性的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)提供样本；(2)提供如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的引物；(3)通过多聚酶链式反应(PCR)，使用引物特异性扩增样本中的吞噬细胞运动蛋白-1(ELMO1)基因的单核苷酸多态性(SNP)rs741301位点；以及(4)根据步骤(3)的扩增产物解读样本的糖尿病肾病易感性基因型。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒使用方法中，如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示的引物，其扩增产物的序列长度为187bp。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒使用方法中，如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示的引物，其扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为鸟嘌呤(Guanine)。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒使用方法中，如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3所示的引物，其扩增产物的序列长度为273bp。
根据上述目的，本发明提供的试剂盒使用方法中，如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3所示的引物，其扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为腺嘌呤(Adenine)。
附图说明
图1表示本发明提供之糖尿病肾病易感性检测的试剂盒使用方法流程示意图。
图2表示本发明实施例1的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，在此配合所附的附图、具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举较佳实施例进一步说明。以下文中所对照的附图，为表达与本发明特征有关的示意，并不需要依据实际情形完整绘制。而关于本案实施方式的说明中涉及本领域技术人员所熟知的技术内容，亦不再加以陈述。
本发明提供一种检测糖尿病肾病易感性的试剂盒，包含特殊设计的引物，四段引物之序列分别如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。前述的引物可通过多聚酶链式反应(简称PCR)，针对吞噬细胞运动蛋白-1(以下简称ELMO1)基因中的SNP位点：rs741301，检测其基因型的确切碱基，并藉由解读其确切的基因型，评估糖尿病肾病发病的相关性。
由于目前对于rs741301的研究缺乏细化分析，本发明先针对rs741301进行严谨的病例统计分析，细化到rs741301位点等位基因与糖尿病肾病的关联性，从而根据其关系设计可靠的检测试剂盒。
经复旦大学基础医学院伦理委员会批准，从上海普陀区中心医院、龙华医院肾内科、内分泌科收集总计符合条件的糖尿病肾病患者88例(病例组)、糖尿病无肾病患者52例(对照组)。接着，对收集到的所有病例组和对照组患者的临床数据进行了采集，用以进行纳入和排除以及相关性分析，采集内容包括但不限于以下指标：年龄、性别、临床诊断、肾穿诊断、血压、呼吸频率、心率、糖尿病病龄、血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、肾功能(尿毒氮【BUN】、肌酐【SCR】)、24h尿蛋白定量及尿白蛋白肌酐比值(UACR)、有无合并高血压、糖尿病视网膜病变等。此外，同时针对收集到的所有病例组和对照组患者采集全血，并用于进行核酸提取以进行检测。
经由临床数据与核酸分析发现，就变异情况而言，rs741301位点上等位基因A变异更多见于糖尿病肾病，而等位基因G变异更多见于糖尿病无肾病的患者(P<0.05)，说明具有等位基因A变异的糖尿病患者更有可能发展为糖尿病肾病，而等位基因G对糖尿病肾病的发展却具有保护意义；就基因型而言，AA更多见于糖尿病肾病患者(P<0.05)，且与糖尿病肾病的患病风险升高呈显著正相关，同样佐证了在该位点上具有A变异的糖尿病患者发展为糖尿病肾病的风险更高。由此分析结果反观前述Wu等人和Hou等人发表的文献结果，虽然针对的SNP目标相同，同样为rs741301位点，但经由本发明细化分析可知，rs741301位点的等位基因A和G的作用显然不同，因此本发明提出的检测试剂盒，明显改善了先前文献较粗略的预测作用缺点，在预测糖尿病肾病的检测应用上更加精确而实用。
由于本发明仅需使用单次PCR即可准确、有效又快速地检测rs741301的基因型(等位基因)，不同于以往PCR和RFLP的联合应用或存有类似缺陷的检测方法，因此本发明提供的试剂盒可进一步包含PCR所需的试剂，相关试剂的选用为本领域技术人员可轻易依需求选择，故不加以限制。
本发明提供的检测试剂盒适用的样本以人类的检体为主，一般含有可分离核酸的检体均可用于本发明的试剂盒，无需特别限制。具体而言，就不同方面应用举例说明如后述。依据一般医疗实务的便利性，优选检体为人类全血，较容易在临床检测工作中取得；另一方面，由于PCR检测灵敏度高，本发明除了适合用于一般抽血取得的常规检体外，更特别适用于微量检体(例如针刺采集的微量血液检体)，因此可降低采检对受测者的干扰(例如采血时从抽血改为针刺采血，减少创口)，对于糖尿病患者特别有益处。除了直接来自人体的样本之外，人为制备的核酸亦适用作为本发明之试剂盒的样本，例如依据ELMO1基因复制的核酸序列或cDNA等，原则上只要可能涵盖rs741301的基因型的核酸序列，均可作为本发明所指的样本。
具体而言，本发明所提供试剂盒中，如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示的引物分别为对应ELMO1基因中特定序列的正向引物和反向引物，经过PCR特异性(specifically)扩增后，取得长度为187bp(bp，base pair，碱基对数)的扩增产物，而此扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为鸟嘌呤(Guanine，以下简称G)。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3所示的引物分别为对应ELMO1基因中另一特定序列的正向引物和反向引物，经过PCR特异性扩增后，取得长度为273bp的扩增产物，而此扩增产物对应表示rs741301位点的碱基为腺嘌呤(Adenine，以下简称A)。
依据上述引物设计原理，本发明进一步提供一种糖尿病肾病易感性检测的试剂盒使用方法，请参见图1，说明其步骤如下：
步骤S1是提供任何类型的样本，其选用条件如前述，不加以特别限制。步骤S2是提供如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的引物，共4条引物。步骤S3是通过多聚酶链式反应(以下简称PCR)，使用四条引物特异性扩增样本中ELMO1基因的SNP rs741301位点，分别取得两种扩增产物。步骤S4是根据扩增产物的状态，解读样本的rs741301位点基因型是否符合糖尿病肾病易感性基因型，藉此评估此基因型与糖尿病肾病易感性的关系。
基于上述本发明之试剂盒及其使用方法之特性，列举实施方式如后述。
实施例1：样本的选取
根据前述引用的研究文献，初步得知汉族人群的ELMO1基因和糖尿病肾病易感性的大致关系，然而先前研究中对于患者(可视为样本)的选取原则较为宽松，不仅未限制人群的分布区域，而且在筛选糖尿病无肾病研究对象时，并未限定病龄，忽略了糖尿病肾病潜伏期长的因素。因此为验证本发明试剂盒及其使用方法的检测效果，本实施例对样本的选取更加科学和严格。本实施例中，样本来源是糖尿病患者，从上海普陀区中心医院、龙华医院肾内科、内分泌科收集总计符合条件的糖尿病肾病患者88例(病例组)、糖尿病患者52例(对照组)，主要人群为中国南方的汉族。主要的选入和排除标准如下描述。
病例组选入标准：(1)符合《中国2型糖尿病防治指南(2013版)》的糖尿病诊断标准。(2)满足以下分条中的一条：①肾功能不全(两次及两次以上生化检测BUN、SCR高于医院规定正常值，取BUN>9mmol/L，SCR>100umol/L)；②两次及以上24小时尿蛋白定量检测UCAR>30mg/g；③肾脏穿刺诊断提示糖尿病肾病改变；(3)排除其他可能的肾脏疾病，如IgA肾病、膜性肾炎、***等。
对照组选入标准：(1)符合《中国2型糖尿病防治指南(2013版)》的糖尿病诊断标准。(2)糖尿病肾病病龄>5年且无肾脏损害表现者，需同时满足以下所有分条：①无肾功能不全表现者(两次及两次以上生化检测BUN、SCR低于医院规定正常值，取BUN<9mmol/L，SCR<100umol/L)；②两次及以上24小时尿蛋白定量检测UCAR<30mg/g；③如有肾脏穿刺诊断，未见到糖尿病肾病改变。
根据上述标准，针对所收集到的患者(可视为样本)进行临床数据采集，用以进行纳入和排除样本，采集的临床数据内容包括但不限于以下指标：年龄、性别、临床诊断、肾穿诊断、血压、呼吸频率、心率、糖尿病病龄、血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、肾功能(BUN、SCR)、24h尿蛋白定量及UACR、有无合并高血压、糖尿病视网膜病变等。据此原则，本实施例纳入符合条件的糖尿病肾病患者88例(病例组)、糖尿病患者52例(对照组)。
由此可知，对于糖尿病肾病，依据本实施例的标准，针对一些肾脏受累不明显(不全然符合临床检测要求)、或者糖尿病受累年限较短的患者，纳入肾脏穿刺诊断的部分(为条件之一，但非必要条件，并依照不违反伦理要求的原则进行选取)，从而纳入了一些早年发病(即有大概率遗传相关的患者)的患者，使病例组纳入的患者更完整，足以严谨代表糖尿病肾病的人群。
另一方面，对于对照组，本实施例严格要求对照组糖尿病病龄大于或等于5年，化除刚罹患糖尿病、可能还没有体现出肾脏受累的患者，尽可能排除样本选取偏差可能对检测带来的干扰。
由本实施例的具体内容可见，从样本选取、纳入、排除的标准都较先前研究基础严格，有助于更清楚展现本发明试剂盒对于检测糖尿病肾病易感性的各项优点。
实施例2：样本的临床特征
确认病例组和对照组的纳入样本后，继续运用实施例1采集的临床数据，针对病例组及对照组进行相关性分析，得到糖尿病肾病和糖尿病无肾病样本的临床特征统计结果，如表1所示。
表1：病例组及对照组样本的临床特征
由表1可知，病例组和对照组在基本生命体征(血压、呼吸、心率)、血脂和血糖水平的差异不具有明显的统计学意义(P>0.05)，其中血糖水平具体包含：空腹血糖(fastingplasma glucose，缩写为FPG)、餐后血糖(postprandial plasma glucose，缩写为PPG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，缩写为HbA1c)、糖化血清白蛋白(glycated serum albumin,缩写为GSA)等参数；而在年龄、血脂、肾功能水平上的差异则具有统计学意义(P<0.05)，其中肾功能水平具体包含：血尿素氮(blood urea nitrogen,缩写为BUN)、血肌酐(serumcreatinine缩写为SCr)、肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,缩写为eGFR)和尿白蛋白-肌酐比值(urine albumin-creatinine ratio,缩写为UACR)。此结果也支持病例组及对照组的样本选取对于糖尿病肾病的区别具有代表性。
实施例3：ELMO1基因rs741301位点变异情况和糖尿病肾病与糖尿病无肾病的数据分析
为进一步确认糖尿病肾病与糖尿病无肾病患者在ELMO1基因rs741301位点变异情况，于本实施例中，利用R软件(版本号3.6.1)对前述纳入实施例1纳入样本ELMO1基因rs741301位点基因型数据进行分析：计算病例组和对照组在临床数据上的平均值和标准差，利用独立t检验和卡方检验检测二组之间在临床指标上的统计学差异，P<0.05认为两组之间在该性质上存在差异；统计PCR结果，利用Hardy-Weinberg平衡判断收集样本的遗传稳定性，P>0.1可以认为本实施例收集的样本在遗传上是稳定的，符合孟德尔定律在人群中的分布情况；利用卡方检验和Fisher检验判断SNP位点变异的相关性,P<0.05可以认为SNP位点在病例组和对照组之间的变异是存在差异的；利用OR值来判断这种差异相关性的强弱。分析结果如表2所示。
表2：ELMO1 rs741301位点变异分析结果
a:AA,AG,GG三组间比较做得P＝0.041；
＊:P值及风险比(OR)为在等位基因型AA和GG之间计算所得；
&:P值及风险比(OR)为在等位基因型AA和AG之间计算所得；
#:P值及风险比(OR)为在等位基因型AG和GG之间计算所得
表2显示，就ELMO1 rs741301位点变异情况而言，该位点上碱基A变异更多见于糖尿病肾病，且与糖尿病患病风险正相关，碱基G变异则更多见于糖尿病无肾病的患者(P<0.05)，说明具有A变异的糖尿病患者更有可能发展为糖尿病肾病，而等位基因G对糖尿病肾病的发展具有保护意义；就基因型而言，AA更多见于糖尿病肾病患者(P<0.05)，且与糖尿病肾病的患病风险升高呈显著正相关，同样佐证了在该位点上具有A变异的糖尿病患者发展为糖尿病肾病的风险更高。
基于上述实施例1～3的描述，以下根据本发明提出的糖尿病肾病易感性检测试剂盒及其使用方法，进行PCR扩增实验以说明本发明提出的试剂盒及其使用方法达成的技术效果。
实施例4：样本核酸提取、保存与PCR扩增检测SNP位点
PCR扩增使用的样本来自糖尿病肾病和非糖尿病肾病患者各四例。本实施例中，优选的样本为指定患者的外周血全血检体，优选的作法是在取得样本后立即进行核酸提取，或严格保存于-80℃冰箱。
核酸的提取：利用市售核酸提取试剂盒Qiagen DNA Blood Mini Kit(货号：51104)提取外周血的全基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行，提取DNA浓度在20-40ng/μl(取决于样本放置时间)，纯度(A260/A280)介于1.8-2.0。将提取后的核酸保存于-20℃。
SNP位点检测：利用PCR技术对SNP突变情况进行检测。检测所需引物序列如序列表的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示。详细操作方法为：
PCR体系的配置：采用10μl的溶液体系进行PCR扩增，采用的聚合酶是GXL DNA polymerase(TAKARA，日本)，PCR体系的内容物包括：DEPC水2.0μl、5xGXL 2.0μl、引物混合物(四条引物各2.5μmol/L，总计10μmol/L)2.0μl、dNTP 0.8μl、GXLpolymerase 0.2μl，提取DNA1μl。
PCR程序设置：(1)95℃5min；(2)95℃10s，54℃40s，72℃1min，循环30次；(3)72℃5min，(4)4℃保存。
扩增后检测：完成扩增后，添加6x上样缓冲液(TAKARA，日本)2μl，混匀，上样于2％琼脂糖凝胶中，于110V电泳中电泳50min，于紫外光下记录结果，如图2所示。图2中的407bp对应非特异性条带，273bp条带对应rs741301位点碱基为A，187bp条带对应rs741301位点碱基为G。
实施例5：解读糖尿病肾病易感性
由于本发明设计PCR扩增的靶序列涵盖ELMO1 rs741301位点，因此经由本发明特殊设计的引物，可从快速扩增产物，简便解读目标位点(rs741301位点)突变情况，从而解读基因型，并评估糖尿病肾病的易感性。
具体而言，当检测的扩增产物仅限长度为273bp的序列单一种扩增产物时，对应表示rs741301位点的碱基为A，基因型为AA；当检测的扩增产物仅限长度为187bp的单一种扩增产物时，对应表示rs741301位点的碱基为G，基因型为GG；当扩增产物同时包含长度为273bp及187bp两种序列的扩增产物时，对应表示rs741301位点基因型为AG。
据此基因型的对应关系，请参考图2的PCR扩增产物解读糖尿病肾病易感性。涵盖rs741301位点的基因型为纯合子AA和杂合子AG时，表示带有这两种基因型的患者，糖尿病肾病易感性相对较高；相反的，涵盖rs741301位点的基因型为纯合子GG时，表示带有这两种基因型的患者，糖尿病肾病易感性相对较低。
具体而言，图2是依据本发明之优选实施方式，对于糖尿病肾病患者及糖尿病非肾病患者，利用PCR对目标位点(rs741301位点)进行特异性扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳的结果。上样顺序从左至右依次为DNA Ladder2000(DNA分子量标记)、糖尿病肾病样本4例(①～④)、糖尿病非肾病样本4例(⑤～⑧)。扩增产物的条带长度从上至下依次为407bp、273bp和187bp：其中，407bp对应非特异性条带；273bp对应ELMO1 rs741301位点的碱基为腺嘌呤(等位基因A)；187bp对应ELMO1 rs741301位点的碱基为鸟嘌呤(等位基因G)。
此外，须强调的是，由于PCR是现今十分普及的分子生物检验技术，故以上实施例之PCR体系仅为具体示范说明本发明之特性，实际上，本发明对于引物以外的相关试剂、扩增条件与样本处理均不做限制，使本试剂盒能够广泛应用于各种临床、健康照护场景中，不受限地实现本发明糖尿病肾病易感性检测试剂盒的各项优点。
综上述说明可知，本发明提供的检测糖尿病肾病易感性的试剂盒及其使用方法可轻易同步利用四条设计精良的引物，透过PCR方式检测其糖尿病肾病易感性SNP rs741301位点基因型，借以评估糖尿病患者发生肾病的风险，以达到及早预防的目标。整个检测过程只需要进行单步骤PCR，不需任何探针、内切酶及昂贵仪器配合，也无需繁复的酶切作用、比对及分析探测，即可准确检测出糖尿病肾病易感性基因型，实现了准确、快捷、简便、经济等特点，适合用于各种临床环境或健康产业中，作为评估糖尿病肾病易感性风险的辅助工具。
更具体举例，对于评估结果显示具有糖尿病肾病高危遗传因素的糖尿病患者，可以根据其血糖水平和血压水平，采用更加严格的血糖血压控制标准、采用对肾脏具有一定保护性作用的降压药、降糖药、抑制肾素-血管紧张素-喹诺酮系统(RASS)等措施，来延缓糖尿病肾病的发病时间和进展速度。
以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明之权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域之技术人员应可明了及实施，因此其他未脱离本发明所揭示之精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在申请专利范围中。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> ELMO1 SNP
<130> 1
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atagcaatag attttatgag gtggtagt 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tcattagtga taacataacc tctggtag 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
agtcttgagg atgaatgaat tctagg 26
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
tgtcctaaca attcgttcat gattaatg 28