阅读说明：本技术 一种藏花橙g及其衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用 (Application of crocus aurantium G and derivatives thereof in preparation of amyloid probe or amyloid inhibitor ) 是由 陈志俊 张丽霞 于 2019-03-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种藏花橙G在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用,涉及生物检测或生物医药技术领域。本发明研究证实：藏花橙G及其衍生物酸性铬蓝等对淀粉样蛋白比如“溶菌酶纤维”或“牛胰岛素纤维”等具有识别或抑制的功能；并且识别作用较强,具有较低的检测限和较高的检测灵敏度。通过SERS技术及分子模拟(MD)相结合,本发明研究确定：藏花橙G与淀粉样蛋白比如牛胰岛素的结合方式主要是藏花橙G的磺酸基与淀粉样蛋白的氨基酸残基Gly、Tyr和Ile相结合；其作用力主要为疏水作用和静电作用的结合。利用藏花橙G及其衍生物的这一特性,可以将藏花橙G及其衍生物应用于淀粉样蛋白的探针或抑制剂的制备。(The invention provides an application of Tibet orange G in preparation of an amyloid probe or an amyloid inhibitor, and relates to the technical field of biological detection or biological medicine. The research of the invention proves that: the crocus orange G and the acid chrome blue and the like of the derivatives thereof have the functions of identifying or inhibiting amyloid protein such as lysozyme fiber or bovine insulin fiber and the like; and the identification function is stronger, and the detection limit and the detection sensitivity are lower. Through the combination of SERS technology and molecular simulation (MD), the invention researches and determines that: the combination mode of the Tibet orange G and amyloid protein such as bovine insulin is mainly that the sulfonic group of the Tibet orange G is combined with amino acid residues Gly, Tyr and Ile of the amyloid protein; the acting force is mainly the combination of hydrophobic action and electrostatic action. By utilizing the characteristic of the crocus sativus orange G and the derivatives thereof, the crocus sativus orange G and the derivatives thereof can be applied to preparation of amyloid probes or inhibitors.)

一种藏花橙G及其衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂 中的应用

技术领域

本发明涉及生物检测或生物医药技术领域，具体涉及一种藏花橙G及其衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用。

背景技术

异构化蛋白即通过一些外界条件使蛋白的二级结构发生变化后的蛋白，包括淀粉样蛋白、变性蛋白、组装蛋白等。其中，淀粉样蛋白(又叫蛋白纤维)是正常蛋白错误折叠聚集的结果。不同类型的淀粉样蛋白尽管在结构上不具有同源性，但是有一个共同的特点：错误折叠多数是将蛋白的二级结构改变，由α-helix转化为β-sheet，纤维化程度越严重，β-sheet的含量也就越多。

本领域公知，淀粉样蛋白纤维化的产生通常与疾病相关。比如：阿尔茨海默症，Ⅱ型糖尿病等重大神经退行性疾病。现有很多研究都在寻找或者合成荧光探针来预防纤维的形成，已经报道过很多种类型的小分子可以作为某种淀粉样蛋白特异性识别的探针，最常用于标记淀粉样蛋白的染料有刚果红、THT衍生物、姜黄素衍生物等。他们基本都是和淀粉样蛋白的某个残基结合发荧光，但是也存在一些常见的问题，比如说容易荧光淬灭、特异性差、出现假阳性，甚至灵敏度差等。要从根源上解决淀粉样纤维疾病，需要开发、寻找多种抑制剂，对临床研究有实际的应用作用。现在对于抑制剂的研究比较火热，抑制剂的种类也有很多种，比如：有机或者无机纳米粒子、茶多酚、吲哚等小分子，但是仍然存在抑制机理不明确的问题，主要原因在于蛋白纤维化后的序列不明确，这也是一个有待解决的突破性难题。

拉曼散射是一种能够反映分子的振动或转动信息的非弹性散射光谱。拉曼光谱可以得出待测物的指纹信息，由于拉曼本身的峰很窄，便于多组分待测物的定量及定性，而且水的存在对拉曼光谱的测试不会产生影响，这使得在水体系或者生理环境中进行测试不会产生干扰。而表面增强拉曼光谱(SERS)可以在分子水平上提供丰富的结构信息，其灵敏度与荧光光谱相当。当在一些贵金属(例如Au和Ag)纳米结构上时有超高SERS检测灵敏度，甚至达到单分子水平。因此为蛋白以及小分子抑制剂之间的作用机理的研究提供了可行性的技术支持。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藏花橙G及其衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用，检测限低，检测灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了藏花橙G在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用。

优选的，所述藏花橙G通过磺酸基与淀粉样蛋白中的氨基酸残基Gly、Tyr和Ile中的一种或多种相结合。

优选的，所述藏花橙G与淀粉样蛋白通过疏水作用和静电作用相结合。

本发明还提供了藏花橙G的衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂的应用。

优选的，所述藏花橙G的衍生物包括酸性铬蓝，立春红2R，变色酸二钠盐，铬变素2R，对磺基苯偶氮变色酸钠，酸性媒介蓝K和橙黄G中的一种或多种。

优选的，所述淀粉样蛋白包括牛胰岛素，溶菌酶，α-突触核蛋白，Aβ淀粉样蛋白，Tau蛋白，甲状腺素运载蛋白，血清淀粉样蛋白A，胰淀素，凝溶胶蛋白，微球蛋白，催乳素，朊病毒，亨廷顿蛋白，降血钙素，心房肽，载脂蛋白A1，乳凝集素，转变生长因子，半胱氨酸蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白轻链中的一种或多种。

本发明研究证实：藏花橙G及其衍生物比如酸性铬蓝等对淀粉样蛋白比如“溶菌酶纤维”或“牛胰岛素纤维”等具有识别或抑制的功能；并且识别作用较强，具有较低的检测限和较高的检测灵敏度。本发明利用碘离子包覆银纳米粒子作为SERS基底，对该体系(淀粉样蛋白-配体抑制剂体系)进行了检测，同时以分子模拟(MD)方式进行辅助，从而来分析淀粉样蛋白与藏花橙G之间的抑制作用机理，结果表明：藏花橙G与淀粉样蛋白比如牛胰岛素的结合方式主要是藏花橙G的磺酸基与淀粉样蛋白的氨基酸残基Gly、Tyr和Ile相结合；其作用力主要为疏水作用和静电作用的结合。利用藏花橙G及其衍生物的这一特性，可以将藏花橙G及其衍生物应用于淀粉样蛋白的探针或抑制剂的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1在Tht作为探针下，不同浓度的藏花橙G抑制牛胰岛素蛋白纤维化过程图；

图2为本发明实施例1共聚焦检测结果；

图3为本发明实施例1原子力测试结果；

图4为本发明实施例1拉曼测试结果；

图5为本发明实施例1分子模拟结果；

图6为本发明实施例2在Tht作为探针下，不同浓度藏花橙G抑制溶菌酶蛋白纤维化过程图；

图7为本发明实施例3酸性铬蓝与牛胰岛素纤维的识别情况图。

具体实施方式

本发明提供了藏花橙G及其衍生物在制备淀粉样蛋白的探针或抑制剂中的应用。

本发明所述藏花橙G为黄色粉末状固体，易溶于水。所述藏花橙G的结构式如式I所示：

在本发明中，所述藏花橙G的衍生物优选包括酸性铬蓝，立春红2R，变色酸二钠盐，铬变素2R，对磺基苯偶氮变色酸钠，酸性媒介蓝K和橙黄G中的一种或多种，更优选包括酸性铬蓝。

所述酸性铬蓝的结构式如式II所示：

本发明研究证实：藏花橙G对淀粉样蛋白比如“溶菌酶纤维”或“牛胰岛素纤维”等具有识别或抑制的功能；并且识别作用较强，具有较低的检测限和较高的检测灵敏度。通过SERS技术及分子模拟(MD)相结合，本发明研究确定：藏花橙G与淀粉样蛋白比如牛胰岛素的结合方式主要是通过藏花橙G的磺酸基与淀粉样蛋白的氨基酸残基Gly、Tyr和Ile相结合；其作用力主要为疏水作用和静电作用的结合。

本发明依据藏花橙G的结构对其衍生物酸性铬蓝进行了研究，研究发现：酸性铬蓝对淀粉样蛋白比如牛胰岛素纤维具有一定的抑制作用，并且该衍生物与其形成的淀粉样纤维结合发光，具有识别淀粉样纤维蛋白的能力。此外，与藏花橙G类似，其衍生物如酸性铬蓝，立春红2R，变色酸二钠盐，铬变素2R，对磺基苯偶氮变色酸钠，酸性媒介蓝K，橙黄G等，也部分可用于溶菌酶、牛胰岛素纤维，CsgA蛋白等淀粉样蛋白或其他类型的变性蛋白检测，与这些异构化蛋白相结合而激发荧光(其中，立春红2R、酸性媒介蓝K对牛胰岛素、溶菌酶、Csga蛋白具有识别作用)，并且部分可以抑制淀粉样蛋白纤维的生长(其中，变色酸二钠盐、铬变素2R、橙黄G、对磺基苯偶氮变色酸钠对牛胰岛素、溶菌酶具有抑制作用。

本发明利用藏花橙G及其衍生物的上述特性，可以将藏花橙G及其衍生物应用于淀粉样蛋白的探针、试剂盒或抑制剂的制备。在本发明中，所述检测用试剂盒中包括藏花橙G，优选还包括其他可用的溶剂、缓冲液等试剂。在本发明中，所述淀粉样蛋白优选包括牛胰岛素，溶菌酶，α-突触核蛋白，Aβ淀粉样蛋白，Tau蛋白，甲状腺素运载蛋白，血清淀粉样蛋白A，胰淀素，凝溶胶蛋白，微球蛋白，催乳素，朊病毒，亨廷顿蛋白，降血钙素，心房肽，载脂蛋白A1，乳凝集素，转变生长因子，半胱氨酸蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白轻链中的一种或多种，更优选包括牛胰岛素和/或溶菌酶。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例所用各原料来源为：藏花橙G，购买自上海如吉生物科技(上海，中国)。牛胰岛素，溶菌酶(鸡蛋清)，氯化钠(NaCl)，Tris，盐酸(HCl)，甘氨酸，购买自北京鼎国长生生物技术(北京，中国)。

将上述购买的牛胰岛素准确称取2.8mg溶解在含有25mM氯化钠溶液(pH＝1.6)的缓冲溶液中，在65℃的水浴中，加热6h，得到牛胰岛素淀粉样，保存在4℃冰箱中备用。

将上述购买的溶菌酶称取适量溶解于含有80mM氯化钠和70mM甘氨酸(pH＝2.7)的缓冲溶液中，使得溶菌酶的终浓度为10μM；用磁力搅拌器加热搅拌，加热温度为65℃，搅拌转数为220rmp，加热6h，得到溶菌酶淀粉样，保存在4℃冰箱中备用。

(1)荧光检测藏花橙G抑制牛胰岛素纤维化：

用从日本岛津公司购买的型号为RF-5301PC的荧光光谱仪，在纤维化过程中每隔30min取样50μL，加入到930μL的PBS缓冲液中，再加入1mM的硫黄素T(Tht)20μL。用从晔辉玻璃仪器厂购买的狭缝3mm的石英池子测其荧光强度，Tht的激发波长440nm，测量时激发和发射狭缝分别1.5mm和1.5mm。重复做以上实验三组，扣除偏差大的点，做成曲线及折线图，结果见图1。图1中，曲线代表藏花橙G对纤维生长的抑制情况。由图1可以看出：随着抑制剂浓度的增加，其对于蛋白纤维化的抑制能力越强。

(2)共聚焦测试：

采用从德国蔡司公司购买的LSM710型号的激光共聚焦倒置显微镜。将上述以Tht为探针研究藏花橙G对纤维的抑制情况样品，选取几个时间段分别取3uL制片，载玻片要轻放，保证样品均匀铺展到载玻片上。用405nm激光扫面样品，得到结果如图2所示：当抑制剂浓度为0时，随着时间增加，纤维与Tht结合发光情况越来越亮；而当COG浓度逐渐增加后，发光情况越来越弱；最后当COG浓度增加到80μM时，完全看不到荧光。

(3)原子力测试：

用从日本购买的型号为SPA300的原子力显微镜，分别检测加入不同浓度抑制剂藏花橙G和不加入抑制剂不同加热时间段的样品。取适量滴在处理过的硅片上，待其蒸干，检测加热时间在60，120，240和360min的样本，检测结果如图3所示。图3表明：随着抑制剂COG浓度的增加，纤维明显减少。

(4)SERS测试：

用从Horiba公司购买的激光型号为633nm激发线的拉曼光谱仪，研究了抑制剂藏花橙G与牛胰岛素之间的结合方式。首先合成常规的银纳米粒子，离心后加入等量的碘离子，以碘离子包覆的银纳米粒子为SERS基底，加入待测的牛胰岛素，藏花橙G以及两者的混合样品进行检测。检测结果如图4所示，其中，a为牛胰岛素的SERS信号，b为藏花橙G的SERS信号，c为两者的结合后SERS信号。由图4可以分析出藏花橙G和牛胰岛素两者的相互作用。

(5)分子模拟：

采用Autodock vina进行分子对接，然后采用Pymol软件进行处理得到蛋白与小分子抑制剂藏花橙G之间的结合方式。结果如图5所示。图5表明：COG与氨基酸残基Phe、Gly、Tyr和Ile以疏水作用及静电作用相结合。

实施例2

按照实施例1的方法，对藏花橙G抑制溶菌酶进行测试，结果见图6。图6表明，以Tht为纤维化指示剂，通过荧光光谱探究，藏花橙G对溶菌酶具有较好的抑制作用。

实施例3

采用荧光光谱法检测藏花橙G的衍生物酸性铬蓝对牛胰岛素纤维的识别情况，结果见图7。其中，图7-a为不同浓度的纤维化蛋白与20μM的酸性铬蓝的发光情况。图7-b为左图的统计结果，得出：线性范围为1～50μM，检出限为0.6μM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。