阅读说明：本技术 伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合物 (Application of Evans blue in preparation of medicine and medicine composition ) 是由 陈绪林 肖宇 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明提出了伊文思蓝在制备治疗HBV病毒感染药物中的应用及一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。所述药物或药物组合物可有效抑制乙型肝炎病毒的进入和病毒颗粒的组装,可有效用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染引起的肝炎。(The invention provides an application of Evans blue in preparing a medicine for treating HBV infection and a medicine composition for treating or preventing hepatitis B virus infection. The medicine or the pharmaceutical composition can effectively inhibit the entry of hepatitis B virus and the assembly of virus particles, and can be effectively used for treating or preventing hepatitis caused by hepatitis B virus infection.)

伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合物

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合物，更具体地，本发明涉及伊文思蓝在制备药物中的用途及一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是世界上最为普遍的慢性病毒性感染。HBV主要通过血液传播、性行为传播、母婴传播等途径传播。乙肝病毒感染是世界上很严重的健康问题，在全世界约有2.2亿HBV携带者，导致每年有768000人死亡,是世界第十大致死原因。

而目前***病毒感染的药物应用于临床的只有两种干扰素，分为干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)两种形式，先后于1990和2005年被FDA批准；和五种核苷类似物的病毒聚合酶抑制剂药物，即拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)，阿德福韦(Adefovir,ADV)，恩替卡韦(Entecavir,ETV)，替比夫定(Telbivudine,LdT)和替诺福韦(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。但是干扰素具有人群耐受性，且有较大的副作用；而聚合酶抑制剂不能清除cccDNA，停药后病毒复制会迅速反弹，并且长期服用还会使病毒发生变异而产生抗药性。

因此，筛选新的抗乙型肝炎病毒感染的药物显的尤为迫切和重要。

伊文思蓝(Evans blue)一直是作为一个常见的生物染料，通常用于组织切片染色，血脑屏障(BBB)通透性检测和抗超敏递质实验。同时有文献报道，伊文思蓝还有具有抑制HIV感染。

然而，伊文思蓝的用途还有待进一步开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本申请是基于发明人对以下事实的发现和认识而作出的：

伊文思蓝可以明显抑制HBV的感染，同时，伊文思蓝还可以显著抑制HBV病毒颗粒的组装。这说明伊文思蓝具有抑制病毒侵入细胞和抑制病毒颗粒组装的双重抗HBV作用。

为此，本发明提出了伊文思蓝在制备以HBV病毒侵入和病毒颗粒的组装为靶标的、抗乙型肝炎病毒感染的药物中的新用途。

在本发明的第一方面，本发明提出了伊文思蓝在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制乙型肝炎病毒进入细胞；或治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。根据本发明的实施例，伊文思蓝还可显著抑制HBV的核衣壳组装和肝细胞内HBV病毒衣壳总DNA，因此，本发明所提出的伊文思蓝在制备药物中的用途，所述药物可显著抑制乙型肝炎病毒颗粒组装；或显著治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。

根据本发明的实施例，上述伊文思蓝在制备药物中的用途还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染。在本发明的一些实施例中，发明人发现，伊文思蓝可显著抑制HBV对人肝癌细胞系Huh7D^hNTCP，人肝原代细胞(PHH)和稳定表达人源NTCP蛋白的猪原代肝细胞(hNTCP-PPH)的感染。同时，伊文思蓝还能明显抑制人肝癌细胞系HepAD38细胞中HBV核衣壳的组装和核衣壳DNA的水平。因此，本发明所提出的伊文思蓝在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染的效果能进一步提高。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括药学上可接受的载体。根据本发明的实施例，药学上可接受的载体可提高所述药物组合物的稳定性和有效成分的可利用度，从而进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括第二药剂，所述第二药剂不同于伊文思蓝并且用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。根据本发明的实施例，所述第二药剂与伊文思蓝联用进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。

根据本发明的实施例，所述第二药剂包括选自下列的至少一种：干扰素(IFN)、聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)、拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)、阿德福韦(Adefovir,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替诺福韦(Tenofovir disoproxilfumarate,TDF)。拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦是HBV病毒聚合酶抑制剂药物。伊文思蓝抑制HBV病毒感染的靶点不同于上述第二药剂，伊文思蓝以HBV侵入和核衣壳组装为靶点，不存在使病毒产生抗药性突变的风险，能持续有效地达到清除乙型肝炎病毒的目的。根据本发明的实施例，上述第二药剂的至少之一与伊文思蓝联用，所述药物组合物的对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防的效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。各种剂型的药物组合物以可以预期的给药方式给药，抑制HBV侵入和病毒颗粒的组装，从而进一步有效治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。

根据本发明的一些实施例，以伊文思蓝为活性成分的药物组合物可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液或糖浆。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊、长效制剂、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。

根据本发明的实施例，本发明的以伊文思蓝为活性成分的药物组合物在无细胞毒性的浓度下，能显著地抑制乙型肝炎病毒侵入和病毒颗粒的组装，从而可以在治疗或预防乙型肝炎病毒感染时被给药。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在乙型肝炎病毒感染治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物组合物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指乙型肝炎病毒感染)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防乙型肝炎病毒感染)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述以伊文思蓝为活性成分的药物组合物给予有需要的个体。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的伊文思蓝(Evans blue)抗HBV活性检测结果图，

其中，图1A是伊文思蓝的结构图，

图1B是伊文思蓝对Huh7D^hNTCP的细胞毒性和上清中HBeAg的抑制率，

图1C是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制细胞中的HBV总DNA的实时定量PCR结果图，

图1D是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制myr-preS1-FITC结合到Huh7D^hNTCP细胞上，

图1E是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染人原代肝细胞结果图，

图1F是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染稳定表达人源NTCP蛋白的猪原代肝细胞结果图；

图2是根据本发明实施例2的伊文思蓝影响HBV病毒颗粒组装的结果图；

其中，图2A显示了伊文思蓝处理4天对HepAD38细胞的细胞毒性和抗原水平，

图2B显示了伊文思蓝对胞内的HBV总DNA的影响，

图2C显示了伊文思蓝对胞内HBV核衣壳(HBV capsid)和核衣壳总DNA的影响；

图2D显示了伊文思蓝对HBV core蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1伊文思蓝抗HBV活性的评价

1.实验材料

1.1细胞和药物

HepAD38细胞系：人肝癌稳定转染细胞系，其染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成和蛋白表达，可产生感染性病毒粒子。在这个细胞系中病毒的复制是由四环素调控的CMV启动子控制的。

Huh7D^hNTCP细胞系：稳定转染人NTCP蛋白的人肝癌细胞系，可支持HBV的感染。

人原代肝细胞(PHH)：购买自上海瑞德肝脏，用于HBV感染。

猪原代肝细胞(PPH)和humanNTCP慢病毒表达载体：购买自立沃生物科技。

伊文思蓝，恩替卡韦购自Sigma公司。

1.2试剂

DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；HBV表面抗原(S抗原)和e抗原检测试剂盒购于上海科华生物科技有限公司；试剂购自Invitrogen公司；iTaqUniversal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司；DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II购自Roche公司。

2.实验方法与结果

2.1伊文思蓝(Evans blue)的细胞毒性检测

1)将HepAD38和Huh7D^hNTCP细胞按8000细胞/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)加药处理细胞：用细胞培养液将药物以2倍梯度稀释6-10个梯度，每梯度3个复孔。将200μL含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中，37℃细胞培养箱中继续培养72h后以备检测。

3)弃去含有药物的细胞培养物上清，每孔加入含10％试剂的培养液100μL，37℃培养箱中孵育0.5h-1h后，用全波段酶标仪检测540nm波长处吸光值，校正波长为620nm，并计算各浓度细胞存活率，或检测荧光值(激发光波长：540nm。发射光波长：595nm)用以计算细胞存活率。

结果如图1B，2A所示。

图1B结果显示：伊文思蓝处理3天对Huh7D^hNTCP细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)大于1000微摩尔/升。

图2A结果显示：伊文思蓝处理4天对HepAD38细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)为351.8微摩尔/升。

2.2伊文思蓝(Evans blue)抑制HBV感染实验

1)将Huh7D^hNTCP/PHH、PPH-hNTCP细胞按8000细胞/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)加药和病毒处理细胞：用细胞培养液将药物以2倍梯度稀释，每梯度3个复孔，将200μL含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中，同时加入HBV病毒颗粒感染细胞，37℃细胞培养箱中继续培养5天以备检测。

3)分别收集细胞上清和细胞，用ELISA检测试剂盒检测细胞上清中的HBeAg(分泌型e抗原)和HBsAg(表面抗原)的含量。

4)另外分别提取步骤(3)中收集的细胞上清和细胞内的HBV总DNA，用实时定量PCR的方法检测细胞上清和细胞内的HBV总DNA。

实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO：1～4所示：

引物(HBV S144-正向引物):5’-TCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物):5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

结果如图1B～1F所示。其中，图中的PreS1表示加入myr-preS1药物组，Ctrl为空白对照组，即未病毒感染组。结果显示：伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染Huh7D^hNTCP细胞的上清HBeAg水平和细胞内总HBV DNA，其EC₅₀(半数效应浓度)分别约为2.1微摩尔/升和6.25微摩尔/升(如图1C所示)；同时伊文思蓝也能剂量依赖的抑制HBV对PHH的感染，在较高浓度50微摩尔/升时能抑制80％的HBV总DNA和cccDNA(如图1E所示)；在PPH-hNTCP细胞细胞感染中，伊文思蓝也能剂量依赖的抑制HBV感染(如图F所示)。

2.3伊文思蓝抑制myr-preS1-FITC结合到Huh7D^hNTCP细胞

1)将Huh7D^hNTCP细胞按8000细胞/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)将梯度稀释的伊文思蓝加入步骤1的细胞孔中，同时每孔加入0.1微摩尔/升的myr-preS1-FITC，0.1微摩尔/升的myr-preS1作为阳性对照。

3)37℃孵育1小时后，吸去培养基并用PBS洗3次，用4％多聚甲醛固定后加入DAPI染细胞核，在PerkinElmer Operetta CLS高内涵成像分析系统上分析结果。

结果如图1D所示。

伊文思蓝在50微摩尔/升时能抑制99％的myr-preS1-FITC结合到Huh7D^hNTCP上，该实验室体外模拟HBV病毒的LHBs与细胞的结合，说明伊文思蓝能抑制HBV病毒结合到细胞表面。

实施例2伊文思蓝(Evans blue)直接作用于HBV核衣壳组装而发挥抗病毒作用

1.实验材料

1.1细胞、质粒和药物

HepAD38细胞系：人肝癌稳定转染细胞系，其染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成，蛋白表达，可产生感染性病毒粒子。在这个细胞系中病毒的复制是四环素调控的CMV启动子控制的。

伊文思蓝，奥昔卡因和恩替卡韦购自Sigma公司。

1.2试剂

DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；试剂购自Invitrogen公司；iTaq Universal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司；抗HBVcore蛋白的兔源多抗，抗GAPDH的鼠源单抗分别购自Dako公司和碧云天公司；HBV表面抗原(S抗原)和e抗原检测试剂盒购于上海科华生物科技有限公司。

2.实验方法与结果

2.1伊文思蓝(Evans blue)对HepAD38细胞中乙型肝炎病毒的抗原水平的研究

1)将HepAD38细胞按8000细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

2)加入梯度稀释的伊文思蓝处理步骤1中细胞4天。

3)收集细胞上清，通过Elisa Kit检测上清中病毒HBeAg和HBsAg水平。

结果如图2A所示。图2A结果显示，伊文思蓝剂量依赖的抑制HepAD38细胞分泌的HBeAg和HBsAg水平。

2.2伊文思蓝(Evans blue)对HBV总DNA的影响

1)在HepAD38细胞中，四环素诱导病毒复制起始后，撤掉四环素，细胞中整合的HBV基因组开始复制，产生HBV dsDNA，rcDNA，ssDNA和cccDNA。

2)将上述诱导后的HepAD38细胞按8000细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

3)加药处理细胞：用DMEM/F12培养基将伊文思蓝稀释成各种浓度，每组3个重复，将不同剂量药物加入到细胞培养板中培养细胞，加药处理4天。

4)收集细胞，分别提取胞内的总的HBV DNA得到的总的HBV DNA，用定量PCR的方法分析研究药物抗病毒活性。

实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO：

引物(HBV S144-正向引物)：5’-ACTCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物)：5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

结果如图2B所示。与未加药处理对照组相比伊文思蓝处理组对于胞内HBV总DNA有显著的剂量依赖的抑制效果，31.3微摩尔/升的药物能抑制50％的HBV总DNA。

2.3伊文思蓝(Evans blue)对乙型肝炎病毒核衣壳组装的作用的研究：

伊文思蓝被报道是BK通路的抑制剂，能降低细胞内钙离子浓度，而相关研究表面HBV核衣壳的组装与细胞内钙离子的浓度有关。因此发明人探讨了伊文思蓝对HBV核衣壳组装的作用。实验过程如下：

1)将HepAD38细胞按2×10⁵细胞/孔接种于6孔细胞培养板板中，37℃细胞培养箱中培养过夜。

2)加药处理细胞72小时。

3)加入300微升温和细胞裂解液，室温裂解30min后收集裂解液到EP管中，并离心去除细胞碎片。裂解液样品用1％的琼脂糖凝胶电泳分成各种成分，随后用毛细管转移法转移到尼龙滤膜上，转膜缓冲液使用10×SSC，检测滤膜上的HBV核衣壳用抗HBV core的抗体(Dako)检测。检测完的滤膜用碱变性处理释放核衣壳内的病毒DNA，用Southern blot方法检测核衣壳内病毒DNA的水平。

另外用western blot的方法检测HBV核心蛋白(core protein，组成核衣壳外壳的蛋白)，检测的抗体抗HBV core的抗体(Dako)检测。

结果显示如图2C和2D所示。伊文思蓝对HBV的核衣壳组装和核衣壳内的HBV DNA均有显著的剂量依赖的抑制效果，且该抑制不是通过影响HBV core蛋白水平发挥作用的。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。