阅读说明：本技术 岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用 (Application of fucooligosaccharide in preparation of intestinal prebiotics ) 是由 邹祥 王振宇 马巍 李姗姗 徐兴然 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用,利用岩藻寡糖具有促进碳水化合物代谢、糖的生物合成与代谢、降低膜运输功能、增强消化系统功能或降低疾病感染的功能,促进肠道内短链脂肪酸产生,改善肠道微生物菌群水平,用于制备肠道益生元,用于人体或畜禽动物,具有广泛的应用前景。(The invention discloses application of fucoidan oligosaccharide in preparation of intestinal prebiotics, wherein the fucoidan oligosaccharide has the functions of promoting carbohydrate metabolism, biosynthesis and metabolism of sugar, reducing membrane transport function, enhancing digestive system function or reducing disease infection, is used for promoting the generation of short-chain fatty acid in intestinal tracts and improving the level of intestinal microbial flora, is used for preparing the intestinal prebiotics, is used for human bodies or livestock and poultry animals, and has wide application prospect.)

岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用。

背景技术

岩藻糖是一种罕见的L-构型的6-脱氧己糖，通常发现于微生物胞外多糖、褐藻和哺乳动 物中。岩藻糖修饰被确定与许多生物学功能有关，其中包括免疫调节和癌症。褐藻中富含的 含硫酸盐的岩藻多糖(fucoidans)具有抗凝血、抗血栓形成、免疫调节、抗癌和抗增殖活性。然 而，植物或藻类中岩藻多糖的产量较低、其组成随气候和季节变化而变化。鉴于微生物具有 更高的生长速率和更易于控制生产条件的优点，其生产的富含岩藻糖的胞外多糖被认为是一 种更好的替代品。在最近的几十年中，其他报道中产量最高的含岩藻糖胞外多糖是由肠杆菌 (Enterobacter A47)产生，产量为13.23g/L。这种富含岩藻糖胞外多糖的多种理化特性，如 流变性、粘合特性、乳化能力，以及生物可降解性薄膜的应用，显示出了其重要的商业价值。

前期研究中，我们分离出了一株Kosakonia菌株，并将其鉴定为Kosakoniasp.CCTCC M2018092，阐明了该菌株的全基因组序列和遗传特性(Complete GenomeSequence of Kosakonia sp.Strain CCTCC 2018092,a Fucose-Rich ExopolysaccharideProducer.Songfeng Niu,2019)。但是并未对Kosakonia sp.产生的荚膜胞外多糖水解的岩藻寡糖的功能进行研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用；本发 明的目的之二在于提供岩藻寡糖在促进肠道内短链脂肪酸产生中的应用；本发明的目的之三 在于提供岩藻寡糖在改善肠道微生物菌群水平中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、岩藻寡糖在制备肠道益生元中的应用。

利用岩藻寡糖具有促进碳水化合物代谢、糖的生物合成与代谢、降低膜运输功能、增强 消化系统功能或降低疾病感染的功能；制备促进碳水化合物代谢、糖的生物合成与代谢、降 低膜运输功能、增强消化系统功能或降低疾病感染的益生元中的应用。

本发明中，所述岩藻寡糖由Kosakonia sp.CCTCC M2018092发酵产生的胞外多糖经三氟 乙酸或酶解等方法水解制得。

优选的，所述三氟乙酸水解为将质量分数为5％的胞外多糖加入三氟乙酸使三氟乙酸终浓 度为0.1M，100℃水解至少1小时，然后用200Da纳滤膜除去三氟乙酸，获得岩藻寡糖。

2、岩藻寡糖在促进肠道内短链脂肪酸产生中的应用。

优选的，所述短链脂肪酸为乙酸或丙酸。

3、岩藻寡糖在改善肠道微生物菌群水平中的应用。

优选的，所述改善肠道微生物菌群门水平为增加拟杆菌门水平，降低厚壁菌门和变形菌 门水平。

优选的，所述改善肠道微生物菌群属水平为增加副拟杆菌属、降结肠拟杆菌和普雷沃菌 属水平，降低乳酸菌属和拟杆菌属水平。

本发明的有益效果在于：本发明提供了岩藻寡糖具有益生功能，首次公开岩藻寡糖具有 促进碳水化合物代谢、糖的生物合成与代谢、降低膜运输功能、增强消化系统功能或降低疾 病感染的功能，能够促进肠道内短链脂肪酸产生，改善肠道微生物菌群水平，因此能够制备 肠道益生元,可以应用到人体健康及畜禽动物养殖等领域。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为单糖标准品的GC-MS总离子流色谱图。

图2为寡糖完全酸水解产物的GC-MS总离子流色谱图。

图3为岩藻寡糖对发酵液pH的影响。

图4为岩藻寡糖对短链脂肪酸的影响。

图5为试管发酵肠道菌群门水平(SGCON为对照组，SGFOP为添加岩藻寡糖组)。

图6为试管发酵肠道菌群属水平(SGCON为对照组，SGFOP为添加岩藻寡糖组)。

图7为粘膜小球的制备。

图8为粘膜小球模拟结果(A：内腔；B：粘膜；S、H、J分辨代表升结肠、横结肠、降 结肠，后面的数字代表发酵天数，w代表停止添加样品)。

图9为模拟肠道结果(A：肠道门水平；B：肠道属水平；C：粘膜门水平；D：肠道粘 膜属水平；S为升结肠，H为横结肠，J为降结肠；0,3,w分别代表：对照组，添加岩藻寡糖 第3天，停止添加岩藻寡糖)。

图10为岩藻寡糖对肠道菌群代谢活动的影响(左边柱状图为该代谢途径在所有二级代谢 途径中占的比例，右边为两组比较的显著性值，蓝色代表对照组强的代谢途径，橘色代表0.1％ 岩藻寡糖实验组代谢强的途径，代谢途径按照显著性值从小到大依次排列)。

图11为岩藻寡糖安全性评价结果(A：岩藻寡糖对重量的影响；B：岩藻寡糖对脑和心 脏的影响；C：岩藻寡糖对结肠长度的影响；D：岩藻寡糖对肝重量的影响；E：岩藻寡糖对肝功能和肾功能的影响)。

图12为小鼠粪便中短链脂肪酸测定结果(A：HPLC；B：GC；C：GC-MS；D：短链脂 肪酸含量统计结果)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、微生物胞外多糖(EPS)的制备

EPS由Kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株在分批补料的条件下发酵生产，具体步骤如 下：取Kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株在含30mL培养基的250mL摇瓶中于30℃、200rpm转速下培养20小时，然后30ml细菌培养液转移到15L大小的发酵罐中于30℃、300rpm条件进行预成长培养13小时(通气量1.5m³/h)。之后，取3L预生长的细菌液转移到50L发 酵罐中(含30L培养基)进行分批补料发酵。根据残糖量使用蠕动泵在发酵开始13h后以 0.9-3.8rpm的速率开始分批补入200g/L的葡萄糖溶液。发酵罐通气量为1.5m³/h，通过转速联动自动调节转速(300-550rpm)将溶氧浓度控制在10％以上。50L发酵罐的pH通过补入氢氧化钠控制在7.0，温度控制在30℃。培养过程中的各培养基组成见表1。

表1.Kosakonia sp.CCTCC M2018092发酵产生胞外多糖的培养基成分

胞外多糖的提取：

方法1：第一条路线为发酵结束后，用硫酸将发酵液pH调至2.0，然后12000rpm高速离 心20min去除菌体和硫酸钙；上清通过Sevage法去除蛋白后，去离子水进行透析(截留分子 量8000-14000Mw)后冻干得原始发酵多糖(EPS)，得率为13.5g/L。但由于菌体体积小，需要高速离心去除，不利于多糖的工业化大规模制备。

方法2：提取路线为发酵结束后，用硫酸将发酵液pH调至2.0，在80℃条件下水解4h。 然后通过0.22μm陶瓷膜过滤去除菌体与硫酸钙，再用10kDa截流量的超滤膜过滤去除色素 等小分子。过滤浓相除蛋白后，透析(截留分子量8000-14000Mw)并冻干得部分水解多糖 (AH-EPS)，得率为12.6g/L。

实施例2、制备低分子量岩藻寡糖

将实施例1制得的水解多糖以去离子水溶解配置成质量分数为5％的多糖水溶液，加入三 氟乙酸使其终浓度为0.1M，100℃油浴水解0.5h、1h、1.5h、2h、3h，得到的多糖水解液使 用200Da纳滤膜除去三氟乙酸，在40℃旋蒸浓缩至小体积，冻干得到寡糖样品，使用高效液 相色谱进行分子量测定，色谱柱为G3000PWXL，柱温40℃，流动相为0.1M NaNO₃，进样体 积15μl，结果如表1所示。结果显示，使用200Da纳滤膜除三氟乙酸岩藻寡糖提取率在93％， 能在除去三氟乙酸的情况下有较高的岩藻寡糖提取率，同时经过硫酸一次水解的岩藻多糖分 子量为47916Da，且PDI(聚合物分散度)较高，表明样品分子量处于极不均一状态，而经 过三氟乙酸水解0.5h、1h、1.5h、2h、3h后得到岩藻寡糖分子量分别为14813Da、1702Da、 2650Da、7528Da、1875Da，在水解1h后分子量不再减小，表明该浓度三氟乙酸能够断裂 的多糖分子糖苷键已经达到上限，在水解2h时出现分子量异常上升，表明酸水解多糖具有不 稳定性。

表1、三氟乙酸水解多糖

组分名	保留体积(mL)	数均分子量(Mn)	重均分子量(Mw)	PDI
					一次水解	7.42	3940.89	47916.31	12.16
0.1M TFA,0.5h,100℃	8.08	10932.02	14813.61	1.36
					0.1M TFA,1h,100℃	8.77	1613.3	1702.95	1.06
0.1M TFA,1.5h,100℃	8.78	2042.87	2650.55	1.3
					0.1M TFA,2h,100℃	8.73	2600.63	7528.55	2.89
0.1M TFA,3h,100℃	8.83	1683.18	1875.48	1.11

GC-MS分析岩藻寡糖中单糖组成：

以木糖作为内标物，采用内标法测定岩藻寡糖中岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸 的定量校正因子。精确称取14.6mg岩藻寡糖溶解于0.5mL木糖溶液(8g/L)中再加入3mL TFA(2mol/L)，压盖后在120℃油浴中加热2h，55℃条件下氮气吹干。加入2mL乙 硫醇和1mL TFA于25℃水浴中磁力搅拌25min。再于55℃条件下氮气吹干，然后加入 4mL醋酸酐-吡啶混合物(1:1，V/V)，于55℃水浴中磁力搅拌5h后，取0.5mL样品 氮气吹干后，复溶于甲醇中，进样进行GC-MS分析。移取8g/L的岩藻糖、葡萄糖、半乳 糖、木糖、葡萄糖醛酸标样各0.5mL于同一玻璃管中混合。氮气吹干后，按上述方法进行 衍生化后进样GC-MS分析。GC-MS条件：Shimadzu(GCMS-QP2010，日本)，Rtx-5毛 细管柱(0.25mm×30m)，汽化室温度为280℃，以高纯氦气为载气，流速为1mL/min； 进样量为1μL。柱温升温程序：初始温度为80℃，保持2min，以15℃/min的速率升温 到200℃，再以1℃的速率升温至210℃，以25℃/min的速率升温到280℃，保持6 min。接口温度为260℃；正离子电离方式，质量范围：m/z 35–600。标准品GC-MS总离子 流色谱图如图1所示，寡糖完全酸水解产物GC-MS总离子流色谱图如图2所示。

以木糖为内标的GC-MS分析表明岩藻寡糖由岩藻糖，葡萄糖，葡萄糖醛酸和半乳糖组成，分析得到岩藻寡糖中的岩藻糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸的摩尔比为 1.58:1.00:1.00:1.46。

实施例3、试管模拟肠道发酵岩藻寡糖

取发酵培养基1L，培养基组分如下：蛋白胨2g/L；酵母提取物2g/L；NaCl 0.1g/L；K₂HPO₄ 0.04g/L；KH₂PO₄ 0.04g/L；MgSO₄·7H₂O 0.01g/L；CaCl₂·6H₂O 0.01g/L；NaHCO₃ 2g/L；吐温 80 2mL/L，灭菌后按0.02g/L加入血红素；10mL/L维生素K₁；0.5g/L胆盐；0.5g/L半胱氨酸 盐酸盐，按质量分数0.1％加入岩藻寡糖。

先将6支试管接入25ml培养基，接种10％粪便菌液，通入厌氧气体保持5min(85％N₂， 10％CO₂，5％H₂)，并用石蜡液封，每12h取样一次，测定发酵液pH及气体，结果如图3所示。结果显示，添加0.1％岩藻寡糖的发酵液pH下降速度高于对照组。

36小时后，取样送至测定16s rRNA，取1mL发酵液测定短链脂肪酸，发酵液中短链脂 肪酸测定方法如下：

短链脂肪酸提取：取1ml上清液，6000rpm/min离心10min，吸出上清液，加入100μL浓盐酸和5mL***混匀，常温萃取20分钟后以5000r/min在4℃下离心10分钟，收集上清 液。将上清液转移到另一管中，加入500μL的1M NaOH混匀，常温萃取20分钟后以5000r/min 在4℃下离心10分钟，收集下层水相。将下层水相转移到另一管中，加入100μL浓盐酸混 匀，所得样品用0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

色谱条件：采用ZORBAX SB-Aq(4.6×250mm 5-Micron)色谱柱进行分析，流动相为0.025％ 磷酸水溶液(pH＝2.8)：乙腈＝95：5，以1.0mL/min进行洗脱，每针进样量20μL；检测波长： 210nm；柱温：30℃。

短链脂肪酸标曲测定：分别配置浓度为1mL/L的乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸的标准样 品溶液，在上述检测条件下进行高效液相色谱分析，确定每个酸的保留时间。根据预实验估 算的发酵液中短链脂肪酸浓度，配置乙酸浓度为2mL/L，丙酸浓度为4mL/L，正丁酸浓度为 2mL/L，正戊酸浓度为1ml/L的混标溶液。再按比例用超纯水稀释。在上述检测条件下对混 标溶液进行高效液相色谱分析，测定各个浓度下的峰面积，绘制短链脂肪酸标准曲线，结果 如表2所示。

表2、短链脂肪酸标准曲线

计算结果如图4所示。结果显示，添加0.1％的岩藻寡糖后丙酸产量为对照组的2倍，可 以初步证实岩藻寡糖可以促进肠道菌产生丙酸而促进人体健康。

试管发酵16s rRNA测序

1)DNA提取与PCR扩增

微生物基因组使用天根试剂盒，提取自人体粪便和发酵后人体粪便基因组。细菌16S rRNA 基因的V4-V5区通过PCR进行扩增，扩增引物为：338F 5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’其中 barcode是每个样本特有的八碱基序列。扩增体系为(20μL)：4μL 5×FastPfu Buffer，2μL of 2.5 mM dNTPs，0.8μL of正反引物(5μM)，0.4μL of FastPfu聚合酶，10ng DNA模板；扩增程 序如为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s；72℃后延 伸5min；循环25次。

2)Illumina MiSeq高通量测序

扩增子经2％琼脂糖凝胶电泳后凝胶回收提取，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒按照制 造商的说明进行纯化，并使用QuantiFluor^TM-ST(Promega,U.S.)进行定量。纯化后的扩增子汇 集在等分子量的测序池中，在成都罗宁生物科技有限公司Illumina MiSeq上进行配对测序 (2×300)。

3)测序数据处理与分析

原始fastq文件经割库后用QIIME(1.17版)按照以下标准对其进行质量过滤：在10个bp 滑动窗口的平均质量得分小于20的任何位点上截断250个bp的reads，丢弃短于50bp的截 断reads。去除barcode序列、引物中有2个核苷酸错配的序列、含有模糊碱基的reads。仅组 装重叠区域大于10bp的reads，无法组装的reads则被丢弃。具有97％相似性的序列通过 UPARSE聚类为一个操作单元(OTUs)，并使用UCHIME识别和去除嵌合体序列。利用RDP 分类器(http://rdp.cme.msu.edu/)对置信阈值为70％的silva(SSU115)16S rRNA数据库中每个 16S rRNA基因序列的系统发育亲缘关系进行分析及注释。

结果如图5和图6所示，结果显示拟杆菌门(Bacteroidetes)(p＜0.05)水平显著增加， 而包含多种革兰氏阴性致病或条件致病菌的变形菌门(Proteobacteria)(p＜0.05)水平显著降 低。

实施例4、CDMN模拟肠道发酵

配置肠道发酵培养基2L：(g/L)：玉米淀粉8.0g/L；蛋白胨3.0g/L；酵母提取物4.5g/L； 胰蛋白胨3.0g/L；粘液素0.5g/L；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L；3号胆盐0.4g/L；血红素0.05 g/L；氯化钠4.5g/L；吐温80 1.0mL/L；氯化钾2.5g/L；磷酸二氢钾0.4g/L；六水氯化镁4.5 g/L；六水氯化钙0.2g/L；微量元素2mL/L。

微量元素储备液(g/L)：七水硫酸镁3.0；七水硫酸亚铁0.1；二水氯化钙0.1；四水氯化 锰0.32；七水硫酸钴0.18；五水硫酸铜0.01；七水硫酸锌0.18；六水氯化镍0.092。

先将玉米淀粉用蒸馏水在100℃溶解5min，再加入肠道发酵培养基(不含粘液素、血红 素、3号胆盐、半胱氨酸、微量元素)，121℃灭菌15min后在超净台加入粘液素、血红素、3 号胆盐、半胱氨酸、微量元素。

粘膜小球的制备：称取2g琼脂于100mL蒸馏水中加热溶解，待琼脂溶液澄清透明后， 冷却至60±5℃，称取0.5g粘液素趁热溶解，调节pH为6.8左右，转移到在超净工作台中紫 外灭菌30min后球形磨具中得直径为7-8mm粘膜凝胶小球并将凝胶小球装袋悬挂于三个发酵 罐中以模拟肠道粘膜(图7)，参数如表3所示。

表3、各结肠段参数

参数	升结肠	横结肠	降结肠
				发酵体积(ml)	300	400	300
温度(℃)	37	37	37
				转速	150	130	170
pH	5.8	6.2	6.8

肠道菌液：收集两名正常青年(24周岁)男性的粪便共20g，溶解至160ml PBS溶液中， 使用三层纱布过滤，除去固体不溶物，得到粪便菌液，粪便微生物以10％的接种量分别接入 到3个发酵罐中，每个罐子中加入15颗黏膜小球。pH自动控制系统补充0.5mol/L的NaOH溶液和0.5mol/L HCl来调节发酵pH，依靠加热冷凝系统保持发酵温度恒定在37℃。 为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。 接种培养24h之后，为维持微生物的正常生长，每日补给养料和排出300mL，以维持发酵 体积不变，每天用3个新的黏膜小球替换罐中的黏膜小球，以模拟黏膜的再生。

结果如8所示，结果显示在肠腔中岩藻寡糖促进了乙酸和丙酸产生，而在粘膜主要分布 的为丁酸和乙酸，岩藻寡糖促进了乙酸的产生，且停止添加样品后，肠道菌产生短链脂肪酸 水平变化不大，可以表明岩藻寡糖有类似重塑肠道菌群的效果。

16s rRNA测序：微生物基因组使用天根试剂盒，提取自人体粪便。细菌16S rRNA基因 的V4-V5区通过PCR进行扩增，扩增引物为：338F：5’-barcode- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’其中barcode 是每个样本特有的八碱基序列。扩增体系为(20μL)：4μL 5×FastPfu Buffer，2μL of 2.5mM dNTPs，0.8μL of正反引物(5μM)，0.4μL of FastPfu聚合酶，10ng DNA模板。扩增程序 如为：95℃2min；95℃30s；55℃30s；72℃30s；72℃5min；循环25次。

Illumina MiSeq高通量测序：扩增子经2％琼脂糖凝胶电泳后凝胶回收提取，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂剂盒按照制造商的说明进行纯化，并使用QuantiFluor^TM-ST(Promega,U.S.) 进行定量。纯化后的扩增子汇集在等分子量的测序池中，在成都罗宁生物科技有限公司 Illumina MiSeq上进行配对测序(2×300)。

测序数据处理与分析：原始fastq文件经割库后用QIIME(1.17版)按照以下标准对其进行 质量过滤：在10个bp滑动窗口的平均质量得分小于20的任何位点上截断250个bp的reads， 丢弃短于50bp的截断reads。去除barcode序列、引物中有2个核苷酸错配的序列、含有模糊 碱基的reads。仅组装重叠区域大于10bp的reads，无法组装的reads则被丢弃。具有97％相 似性的序列通过UPARSE聚类为一个操作单元(OTUs)，并使用UCHIME识别和去除嵌合体 序列。利用RDP分类器(http://rdp.cme.msu.edu/)对置信阈值为70％的silva(SSU115)16S rRNA 数据库中每个16S rRNA基因序列的系统发育亲缘关系进行分析及注释。

结果如图9所示，图9中A为肠道门水平，可以看出添加岩藻寡糖三天后，横结肠厚壁 菌门(Firmicutes)与变形菌门(Proteobacteria)水平降低，拟杆菌门(Bacteroidetes)增加， 且停止添加岩藻寡糖，横结肠与降结肠拟杆菌门(Bacteroidetes)维持在相对稳定的水平。图 9中B为肠道属水平，可以看出添加岩藻寡糖三天后，横结肠乳酸菌属(Lactobacillus)水平 显著降低，拟杆菌属(Bacteroidetes)略微降低，副拟杆菌属(Parabacteroides)显著增加(p ＜0.05)，降结肠拟杆菌(Bacteroides)显著增加(p＜0.05)，副拟杆菌属(Parabacteroides) 显著增加(p＜0.05)，且在停止添加岩藻寡糖后横结肠副拟杆菌属(Parabacteroides)水平与 未添加岩藻寡糖相比有所增加(p＜0.05)。图9中C为肠道粘膜门水平，可以看出添加岩藻 寡糖3天后，升结肠、横结肠、降结肠中拟杆菌门(Bacteroidetes)显著上升，升结肠中拟杆 菌门(Bacteroidetes)提升显著，且其中变形菌门(Proteobacteria)水平显著下降，厚壁菌门 (Firmicutes)水平下降。停止添加岩藻寡糖后升结肠厚壁菌门(Firmicutes)水平增加，变 形菌门(Proteobacteria)水平增加。图9中D为粘膜中添加岩藻寡糖后Prevotella(p＜0.05) 属在升结肠中增加最多，横结肠中拟杆菌(Bacteroidetes)(p＜0.05)增加，乳酸菌 (Lactobacillus)(p＜0.05)水平在各个肠段均减少；停止添加岩藻寡糖后，升结肠和降结 肠粘膜乳酸菌(Lactobacillus)水平回升。

岩藻寡糖对肠道菌群代谢活动的影响，结果如图10所示。结果显示，寡糖具有促进碳水 化合物代谢、糖的生物合成与代谢、降低膜运输功能、增强消化系统功能、降低疾病感染等 功能。

实施例5、岩藻寡糖体内安全性评价

取8周龄雄性野生型小鼠，随机分为3组，每组6只，分别灌胃生理盐水(0.9％氯化钠)、 0.1％岩藻寡糖(79.2mg/d/kg)、0.5％岩藻寡糖(396mg/d/kg)，每周收集一次粪便，1个月 后收集小鼠各个器官测定重量，结果如图11中A所示。

粪便采集：固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，收集新鲜粪便于对 应编号的带盖塑料管中，立即密封，将小管置于冰盒中保存，将所有样品管置于-80℃低温冰 箱中保存备用。

各项生理指标能够初步反映岩藻寡糖对小鼠机体是否有不良效果，1个月后测定小鼠体重、 脑、结肠、胰腺、肝重量，以及结肠长度，结果如图11中B～D。

实验结束时，摘眼球取血，血清样本分析一式三份，γ谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸氨基 转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)作为肝脏功能的评价指标，按照试剂盒说明书的方法处理并 用全自动酶标仪进行检测，结果如图11中E所示。

摘眼球取血，血清样本分析一式三份，尿素氮(BUN)、肌酸酐(CRE)等作为肾功能的评价指标，按照试剂盒说明书的方法处理并用全自动酶标仪进行检测，结果如图11中E所示。

结果表明，岩藻寡糖处理小鼠生理指标及肝肾功能与对照组比较无显著性差异(P＞ 0.05)，表明岩藻寡糖是一种较为安全的寡糖，能够用于生物体食用。

岩藻寡糖处理小鼠生理指标及肝肾功能与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，表明 岩藻寡糖是一种较为安全的寡糖，能够用于生物体食用。

小鼠粪便中短链脂肪酸测定：

分别取少量小鼠新鲜排出粪便称重，将其溶于含500μL甲醇溶液的EP管中，静置5～ 10min，振荡混匀，制成粪便悬液。用硫酸调节悬液pH至2～3，静置5min，其间震荡混匀数次。将EP管于5 000r/min离心20min后，取上清以5 000r/min离心5min后，其上清 用于气相色谱－质谱联用分析。分别使用HPLC、GC-MS、GC测定小鼠粪便中短链脂肪酸进 行初实验，摸索最佳提取方法，结果如图12所示。

结果显示，上述三种测定方法测定出的图谱表明，GC-MS峰分离及峰形较好，并且根据 标准得到上述峰，从左到右依次为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸可以用于测定小鼠粪便中的短链 脂肪酸。测定结果表明，添加0.1％岩藻寡糖的小鼠产生乙酸及丙酸有所增加，表明我们的岩 藻寡糖样品在小鼠肠道内被特殊肠道菌群利用并刺激其产生短链脂肪酸，从而对人体表现出 益生效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。