阅读说明：本技术 一种降低血压的豌豆寡肽及其制备方法和应用 (Blood pressure lowering pea oligopeptide and preparation method and application thereof ) 是由 张树成 周泉城 杨进洁 杨国栋 臧庆佳 刘长宝 武世敏 房万才 孙钊 于 2020-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种降低血压的豌豆寡肽及其制备方法和应用,其中豌豆寡肽的分子式：C<Sub>20</Sub>H<Sub>33</Sub>N<Sub>5</Sub>O<Sub>8</Sub>；分子量：471.50；命名为：(S)-5-氨基-2-((S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁胺基)-4-羧基丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺基)-5-氧代戊烷酸。其具有通过抑制ACE活性,阻断肾素-血管紧张素系统,调节肠道菌群多样性、丰富度,以及特定菌群比例,从而发挥显著降压的作用,所述豌豆寡肽可用于功能性食品、补剂中。(The invention discloses a pea oligopeptide capable of reducing blood pressure as well as a preparation method and application thereof, wherein the molecular formula of the pea oligopeptide is as follows: c 20 H 33 N 5 O 8 (ii) a Molecular weight: 471.50, respectively; is named as: (S) -5-amino-2- ((S) -1- ((S) -2- ((S) -2-amino-3-methylbutanamido) -4-carboxybutanoyl) pyrrolidine-2-carboxamido) -5-oxopentanoic acid. It has effects in blocking kidney by inhibiting ACE activityThe vitamin-angiotensin system regulates the diversity and abundance of intestinal flora and the proportion of specific flora, thereby playing a role in remarkably reducing blood pressure, and the pea oligopeptide can be used in functional foods and supplements.)

一种降低血压的豌豆寡肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于寡肽提取应用技术领域，具体涉及一种降低血压的豌豆寡肽及其制备方法和应用。

背景技术

近几年，全球超过三分之一的成年人具有血压高的症状，据《中国心血管病报告2019》统计数据显示，我国高血压总患病率逐年升高趋势明显。此外，高血压还可引发其它并发症，超过半数的心血管病发病与高血压有关，其中以脑卒中和心肌梗死最为常见，严重威胁着我国居民的健康和生活。

但是单纯的靠药物进行高血压的治疗，则会导致各种并发症和副作用的产生，并且现如今很多人只是具有血压高的倾向，并未发展成严重的高血压疾病，在老龄化趋势加强、医保压力增大等其他因素的共同作用下，国家政策对“治未病”越来越重视。国家《“健康中国2030”纲要》强调，推进健康中国建设，要坚持预防为主，强化早诊断、早治疗、早康复。

而功能性食品的主要作用是增强免疫力、促进细胞再生、促进病体康复等，不仅可以改善亚健康、慢性病患者的亚健康状态和治愈程度，也对健康的居民发挥预防和保健作用。因此在诸多政策落地和健康意识提高的利好下，功能性食品相关政策不断完善。

寡肽分子量小，具有良好的溶解性；在受热或在酸碱条件下，有良好抗凝作用，稳定性好。直接补充寡肽可加速体内氨基酸的吸收过程、提高机体对氮的利用率，提供人体生长、发育所需要的营养物质。

同时，有些寡肽的氨基酸序列与体内某些生理活性调节物类似，直接参与机体生理活动的调节，或者具有刺激肠道受体激素或酶的分泌而对人体发挥许多非常重要的生理作用。如调节血压、抵抗自由基、提高免疫力、缓解疲劳、延缓衰老以及防治高血脂等，这是原料食品蛋白或其它氨基酸所不具备的。

目前对于豌豆寡肽的研究较少，同时亦未见豌豆寡肽在降低血压方面的应用报道，因此，开展豌豆寡肽在降低血压以及功能性食品方面的应用具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种降低血压的豌豆寡肽及其制备方法和应用，具有降压作用，可应用于功能性食品、药品、以及药食同源的食品领域，所述豌豆寡肽命名为（S）-5-氨基-2-（（S）-1-（（S）-2-（（S）-2-氨基-3-甲基丁胺基）-4-羧基丁酰基）吡咯烷-2-甲酰胺基）-5-氧代戊烷酸。

具体技术方案如下：

一种降低血压的豌豆寡肽，所述豌豆寡肽具有如图1所示的结构式，所述豌豆寡肽的制备方法，包括以下步骤：

首先以Wang resin为载体结合Fmoc-Gln(Trt)-OH反应生成Fmoc-Gln(Trt)-Resin，之后分三步导入Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Val-OH使其分别与前一步反应产物进行结合；

该过程中每一步的生成产物分别为：

Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Resin、Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin、Fmoc-Val-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin；

之后对生成的Fmoc-Val-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin分子进行裂解得到Val-Glu-Pro-Gln寡肽与其它短肽分子片段混合物，最后通过纯化得到纯度大于98%的Val-Glu-Pro-Gln豌豆寡肽纯品。

优选的，所述豌豆寡肽的应用剂量为100~150 mg/kg。

优选的，所述豌豆寡肽可与血管紧张素转化酶的Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523氨基酸残基以及Zn离子结合，其中豌豆寡肽与Ala356和Arg522形成氢键作用，豌豆寡肽的C末端羧基与Zn离子形成了金属配位键；豌豆寡肽主要通过氢键作用以及与Zn离子的配位作用与血管紧张素转化酶的活性位点结合，对ACE酶起竞争性抑制作用，从而抑制血管紧张素转化酶的活性。

优选的，所述豌豆寡肽通过抑制血管紧张素转化酶活性，阻断肾素-血管紧张素系统，从而发挥显著降低血压的作用。

优选的，所述豌豆寡肽通过调节肠道微环境，使菌群丰富度和多样性维持在正常范围以内，保持了普雷沃氏菌科与毛螺菌科的菌群比例从而保证了肠道菌群正常利用体内物质，以及菌群代谢物质的功能调节作用，保证了营养物质的正常消化、吸收、代谢。

优选的，所述豌豆寡肽通过提高菌群毛螺菌科对糖类物质的分解能力，从而减少因肠道微生物紊乱对血压造成的不良影响。

优选的，所述豌豆寡肽通过对肾脏、脾脏器官产生调节作用，从而使脾脏指数、肾脏指数保持正常范围，避免因高血压而对脏器的损害，进而调节血压至正常范围。

优选的，所述的豌豆寡肽在功能性食品、补剂中的应用。

优选的，所述的豌豆寡肽在作为制备治疗高血压疾病的药物中的应用。

有益效果：

1.本发明提供了一种能够降低血压的豌豆寡肽，所述豌豆寡肽可与血管紧张素转化酶的Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523氨基酸残基以及Zn离子结合，其中豌豆寡肽与Ala356和Arg522形成氢键作用，豌豆寡肽的C末端羧基与Zn离子形成了金属配位键；豌豆寡肽主要通过氢键作用以及与Zn离子的配位作用与ACE的活性位点结合，对ACE酶起竞争性抑制作用，从而抑制ACE的活性，阻断肾素-血管紧张素系统，从而发挥显著降低血压的作用。

2.本发明的豌豆寡肽通过调节肠道微环境，使菌群丰富度和多样性维持在正常范围以内，保持了Prevotellaceae与Lachnospiraceae菌群比例，从而保证了肠道菌群正常利用体内物质，以及菌群代谢物质的功能调节作用，保证了营养物质的正常消化、吸收、代谢，减少因肠道微生物紊乱对血压造成的不良影响。同时豌豆寡肽通过对肾脏、脾脏器官产生调节作用，从而使脾脏指数、肾脏指数保持正常范围，避免因高血压而对脏器的损害，进而调节血压至正常范围。

3.本发明还提供了一种豌豆寡肽在功能性食品、补剂中的应用，属于豌豆新型产品的开发，可以将豌豆寡肽作为添加剂添加到功能性食品、药品或者补剂中，不仅提升了农产品的附加值，而且避免了传统药物产生的副作用，有效降低血压。

附图说明：

图1：为豌豆寡肽的化学结构式；

图2：为豌豆寡肽与ACE蛋白活性位点的结合图；

图3：豌豆寡肽碱基序列与结构；

图4：寡肽合成方法；

图5：“科”水平大鼠肠道菌群Heatmap图。

具体实施方式

以下将结合附图及实施例对本发明进行详细清楚的描述。

本发明提供了一种具有降压作用的豌豆寡肽（S）-5-氨基-2-（（S）-1-（（S）-2-（（S）-2-氨基-3-甲基丁胺基）-4-羧基丁酰基）吡咯烷-2-甲酰胺基）-5-氧代戊烷酸，本发明所述的豌豆寡肽的分子式：C₂₀H₃₃N₅O₈；分子量：471.50。

所述豌豆寡肽可与ACE的Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523氨基酸残基以及Zn离子结合，其中豌豆寡肽与Ala356和Arg522形成氢键作用，而豌豆寡肽的C末端羧基与Zn离子形成金属配位键。因此豌豆寡肽主要通过氢键作用以及与Zn离子的配位作用与ACE的活性位点结合，对ACE酶起竞争性抑制作用，从而抑制ACE的活性。（ACE（AngiotensinConverting Enzyme, 血管紧张素转化酶）。

豌豆寡肽通过抑制ACE活性，从而阻断肾素-血管紧张素系统，进而发挥显著降低血压的作用。

因此，本发明所述的豌豆寡肽在高血压领域的应用机理或途径是：通过抑制ACE，抑制肾素-血管紧张素系统，从而发挥降低血压的作用。

本发明涉及的豌豆寡肽通过调节肠道微环境，使菌群丰富度和多样性维持在正常范围以内，保持了普雷沃氏菌科Prevotellaceae与毛螺菌科Lachnospiraceae菌群比例从而保证了肠道菌群正常利用体内物质，以及菌群代谢物质的功能调节作用，保证了营养物质的正常消化、吸收、代谢。

同时，本发明涉及的豌豆寡肽可通过提高菌群Lactobacillaceae对糖类物质的分解能力，从而减少因肠道微生物紊乱而对血压造成的不良影响。通过对肾脏、脾脏器官产生调节作用，从而使脾脏指数、肾脏指数保持正常范围，避免因高血压而对脏器的损害，进而调节血压至正常范围。

本发明的豌豆寡肽的制备方法，包括以下步骤：

首先以Wang resin为载体结合Fmoc-Gln(Trt)-OH反应生成Fmoc-Gln(Trt)-Resin，之后分三步导入Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Val-OH使其分别与前一步反应产物进行结合；

该过程中每一步的生成产物分别为：

Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Resin、Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin、Fmoc-Val-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin；

之后对生成的Fmoc-Val-Glu(otBu)-Pro-Gln(Trt)-Resin分子进行裂解得到Val-Glu-Pro-Gln寡肽与其它短肽分子片段混合物，最后通过纯化得到纯度大于98%的Val-Glu-Pro-Gln豌豆寡肽纯品。

其中，Wang resin为王树脂，Fomc为芴甲氧羰酰基，在氨基酸合成过程中起保护作用，可用二乙胺脱除；Trt为三苯甲基，用于保护谷氨酰胺(Gln)的α-羧基，可用三氟乙酰基(TFA)脱除。otBu:侧链叔丁氧基，用于保护谷氨酸(Glu)的侧链羧基。可用TFA脱除。

所述的豌豆寡肽可应用在功能性食品、补剂中，起到降低血压的作用，应用剂量为100~150 mg/kg。

同时，所述豌豆寡肽也可在制备治疗高血压疾病的药物中应用。

实施例1：

通过对豌豆寡肽进行与ACE的分子对接模拟，分子对接采用AutoDock 4.2.6软件包实现，设定1O8A晶体结构中的Zn离子所在的位置为活性位点，将多肽VGPG对接到活性位点，对接盒子的中心坐标设为（36.99, 41.25, 43.45），XYZ各方向的格点数设为80×60×60，格点间距为0.375 Å，对接次数设为100，其余参数采用默认值。

结果发现（见说明书附图2），豌豆寡肽与Ala356和Arg522氨基酸残基形成氢键作用。同时豌豆寡肽的C末端羧基与Zn离子形成了金属配位键。因此豌豆寡肽主要通过氢键作用以及与Zn离子的配位作用与ACE的活性位点结合，对ACE起竞争性抑制作用，从而抑制ACE的活性。

实施例2：

实验步骤：

通过给予大鼠含5% NaCl的高盐饮食和含20%果糖的高糖饮水构建高血压大鼠模型，持续喂养两周后采用无创尾动脉血压计测定大鼠血压水平确定是否造模成功，以连续三天血压收缩压（SBP）大于140 mmHg并稳定作为建模成功的判定标准，对大鼠进行分组，分为正常组（标记Z，生理盐水）、模型组（标记M，生理盐水）、对照组（标记C，非洛地平缓释片0.5 mg/mL）、VGPG高剂量组（标记1，30 mg/mL）、VGPG中剂量组（标记2，25 mg/mL）、VGPG低剂量组（标记3，20 mg/mL），灌胃5 mL/kg。每隔3 d测量一次血压，喂养实验持续21 d。

在喂养实验结束后，采用眼眶取血法采集大鼠血液，室温静置1 h自然凝固，平衡后离心（3000 r/min，10 min）取上清液并通过ACE酶联免疫试剂盒进行血液中ACE酶活检测。

实验结果：

实验结束，测定大鼠血压，结果如表1所示，ACE活性发现（见表2），与模型组相比，豌豆寡肽对ACE活性抑制率达到35.8%，显著降低血压至正常水平，降低率达19.2%。因此豌豆寡肽在高血压领域的应用机制或途径是：通过抑制ACE活性，抑制肾素-血管紧张素系统，从而发挥显著降压作用。

表1大鼠喂养期间血压变化

喂养时间（d）

正常组（mmHg）

模型组（mmHg）

药物组（mmHg）

VGPG低剂量组（mmHg）

VGPG中剂量组（mmHg）

VGPG高剂量组（mmHg）

0

104±0.6

141±1.6

144±1.8

138±1.4

139±0.5

141±1.6

3

110±1.2

142±0.9

146±0.8

142±1.9

141±2.1

143±2.4

6

113±1.5

146±1.4

142±1

140±0.5

145±0.5

146±1.2

9

105±1

150±0.5

133±1.5

146±0.8

140±1.5

140±1

12

110±1.5

148±1

128±2

142±1.5

132±1.6

136±2.6

15

111±0.5

153±2.2

124±2.5

138±1.8

128±2.2

130±1.8

18

108±2

149±1.4

122±1

135±2.2

124±1.6

128±1.5

21

110±1.5

151±0.6

115±0.8

127±1.8

122±0.5

129±0.7

表2大鼠血清中ACE活性

组别

正常组

模型组

药物组

VGPG低剂量组

VGPG中剂量组

VGPG高剂量组

ACE酶活（mU）

511±20<sup>a</sup>

897±22<sup>b</sup>

521±35<sup>a</sup>

655±52<sup>c</sup>

576±40<sup>d</sup>

732±34<sup>e</sup>

注：同行不同小写字母表示差异性显著（P<0.05）。

实施例3：肠道菌群多样性分析（Alpha多样性分析以及“科”水平的菌群群落分析）

实验步骤：

1）样品收集

大鼠饲养结束后，通过脊椎脱臼将其致死后解剖，从回肠中取出2-3 g粪便装入无菌PE管液氮冷冻后-80℃低温保存。

2） DNA 抽提和 PCR 扩增

根据 E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, 美国) 试剂盒说明书进行微生物群落总 DNA 抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA 浓度和纯度；使用338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 对 16S rRNA基因V3-V4 可变区进行 PCR 扩增，扩增程序如下：95℃ 预变性 3min，27 个循环（95℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s, 72℃ 延伸 30s），然后 72℃ 稳定延伸 10min，最后在4℃进行保存（PCR 仪：ABI GeneAmp® 9700 型）。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu 缓冲液4 μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物（5uM） 0.8 μL，下游引物（5uM）0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。每个样本3个重复。

3）Illumina Miseq 测序

将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA GelExtraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer (Promega, USA) 对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库: (1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI SRA数据库。

4）数据处理

使用Trimmomatic软件原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接：

（1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；

（2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；

（3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；

（4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

5）实验结果：

①Alpha多样性分析：

使用的 UPARSE 软件，根据97%的相似度对序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体，进行Alpha多样性指数分析计算。实验结果如表3所示：

表3 Alpha多样性指数

组别	sob	shannon	simpson	ace	chao	coverage
							正常组	117	2.148988	0.179802	302.606541	184.5625	0.998588
模型组	102	1.27666	0.459744	146.318748	139.1875	0.999058
							药物组	361	2.139282	0.2659	524.477435	519.275862	0.996129
VGPG低剂量组	137	1.466976	0.346202	293.584437	237.647059	0.998416
							VGPG中剂量组	116	2.108043	0.158656	157.792987	145.076923	0.99913
VGPG高剂量组	167	2.584842	0.14277	191.259088	185.37037	0.99913

鼠喂养实验结束后取其肠道粪便进行Alpha多样性分析。从上表中可以看出，接受豌豆寡肽治疗的高血压大鼠其肠道菌群的丰富度和多样性与正常大鼠相比无显著差异；

与高血压（模型组）大鼠相比，sob指数平均升高37.2%，ace指数平均升高了45.7%。

②“科”水平的菌群群落分析：

大鼠喂养实验结束后取其肠道粪便进行“科”水平的菌群群落分析。利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 数据库（SSU128），设置比对阈值为70%，得到“科”水平大鼠肠道菌群Heatmap图（图5），从图中可以看出，相对于高血压大鼠，接受豌豆寡肽治疗的高血压大鼠肠道中产短链脂肪酸菌科Prevotellaceae降低84.4%；产乙酸、丁酸菌科Lachnospiraceae上升770.2%；此外，与糖类物质代谢有关的Lactobacillaceae菌科含量上升121.3%。

从上述数据可以看出，豌豆寡肽具有改善因高血压而造成的菌群丰富度与多样性下降的能力，从而使肠道菌群微环境维持在正常范围之内，进而起到降压的效果。

实施例5：脾脏、肾脏变化情况

实验方法：喂养实验结束，解剖大鼠取出脾脏、肾脏，滤纸吸干残血后，分别称其质量并计算平均值作为大鼠脏器指数。

实验结果：

表4 大鼠脾脏、肾脏变化情况

组别

Z

M

C

VGPG低剂量组

VGPG中剂量组

VGPG高剂量组

脾/(g)

0.87±0.02<sup>a</sup>

1.01±0.01<sup>b</sup>

0.86±0.01<sup>a</sup>

0.98±0.04<sup>b</sup>

0.87±0.06<sup>a</sup>

0.95±0.03<sup>b</sup>

肾/(g)

0.65±0.02<sup>a</sup>

0.42±0.01<sup>b</sup>

0.48±0.03<sup>c</sup>

0.45±0.03<sup>b</sup>

0.50±0.04<sup>c</sup>

0.42±0.02<sup>b</sup>

注：同行不同小写字母表示差异性显著（P<0.05）。

大鼠喂养实验结束后解剖大鼠取出脾脏、肾脏，滤纸吸干残血后，分别称其质量作为脏器指数。与正常大鼠相比，接受豌豆寡肽治疗的中剂量组的高血压大鼠脾脏指数无显著差异；肾脏指数下降23.1%；与高血压大鼠（模型组）相比，接受豌豆寡肽治疗的中剂量组的高血压大鼠脾脏指数下降13.9%，肾脏指数上升19.0%。这表明豌豆寡肽通过对肾脏、脾脏器官产生调节作用，从而使脾脏指数、肾脏指数保持正常范围，避免因高血压而对脏器的损害，进而调节血压至正常范围。

显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明保护范围之内。