兼具ace抑制和抗氧化活性的肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 兼具ace抑制和抗氧化活性的肽及其制备方法和应用 (Peptide with ACE (angiotensin converting enzyme) inhibition and antioxidant activities as well as preparation method and application thereof ) 是由 党亚丽 郝丽 高新昌 潘道东 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一系列兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽及其制备方法和应用,本发明兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽,其氨基酸序列为以下三种：肽1：Cys-Cys-Asn-Lys；肽2：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe；肽3：His-Cys-His-Thr。兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽的制备方法,鲜味肽溶液经过胃蛋白酶水解和胰蛋白酶水解后得到含兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽的溶液。本发明兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽能发挥较强的ACE抑制和抗氧化作用,非常适合用于制备降压药物和抗氧化功能药物,并可用于保健食品,药品或化妆品的研发。(The invention discloses a series of peptides with ACE inhibition and antioxidant activity, and a preparation method and application thereof, wherein the amino acid sequence of the peptide with ACE inhibition and antioxidant activity is as follows: peptide 1: Cys-Cys-Asn-Lys; peptide 2: Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe; peptide 3: His-Cys-His-Thr. The preparation method of the peptide with both ACE inhibition and antioxidant activity comprises the steps of carrying out pepsin hydrolysis and trypsin hydrolysis on an umami peptide solution to obtain a solution containing the peptide with both ACE inhibition and antioxidant activity. The peptide with both ACE inhibition and antioxidant activity can play a strong role in ACE inhibition and antioxidant, is very suitable for preparing antihypertensive drugs and antioxidant drugs, and can be used for research and development of health-care foods, drugs or cosmetics.)
技术领域
本发明涉及降压药物和抗氧化功能药物领域，具体涉及一系列兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽及其制备方法和应用。
背景技术
金华火腿和巴马火腿属于干腌火腿(dry-cured ham)，是用猪的前、后腿为原料，经腌制和发酵等加工工艺制作而成的一种肉制品，是我国和地中海地区最为独特的传统猪肉制品。我国的干腌火腿总年产量基本上稳定在400500万只，其中，金华火腿的年产量为300400万只，宣威火腿的年产量达100万只左右。此外还有江苏的如皋火腿、咸宁火腿和湖北的恩施火腿等，属地方传统特色的猪肉制品。火腿的滋味取决于产生滋味的小分子物质的含量和比例。小分子肽和游离氨基酸是火腿滋味物质的核心成分，它们形成了火腿的鲜味，对滋味的贡献很大。因此，研究火腿中的鲜味肽对于传统火腿行业的发展具有重大意义。
鲜味肽又称风味增强肽，是补充或增强食品原有风味的肽类物质。当这些肽的含量或用量低于其单独检测阈值时仅增强风味，仅当其含量或用量高于其单独的检测阈值时才产生鲜味。鲜味肽不影响其它味觉(酸、甜、苦、咸)，且增强其各自的风味特征。一般地，鲜味肽多半含有酸性氨基酸Glu或Asp,Glu,Asp,Gln,Asn之间相互结合或与Thr,Ser,Ala,Gly,Met结合也产生鲜味。在适当的浓度下，这类肽与其他适当浓度的呈味成分(盐、味精、酸味剂)会有协同效果或增味之功效。
火腿中的鲜味肽对抗氧化有一定的作用。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。例如常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关。人类应摄取足够的抗氧化剂，延缓身体退化速度，防止肌肤衰老，并时刻保持青春神采。抗氧化肽由于其天然无害性越来越成为抗氧化剂的热门选择。
火腿中的鲜味肽对心血管疾病有一定的作用。随着世界的发展和社会的进步，人们的生活水平不断提高，大众的生活方式和饮食结构都发生了巨大变化，现代文明病也接踵而来。现代文明病主要包括肥胖症、糖尿病、高血压、抑郁症等。在这些常见病中，高血压是严重危害人类健康的慢性病之一，也是世界范围内的普遍病症。据WHO统计，截至2018年世界范围内约有11.3亿成人患有高血压，每年导致940万人死亡。同时，高血压是心血管疾病发展过程中主要的可控危险因子，每降低5mmHg收缩压，患心血管疾病的风险就降低16％；持续升高的血压极可能增加中风、心脏病发作和肾衰竭的风险。高血压已成为危及人类身体健康的主要疾病之一。据世界卫生组织预测，到2020年，非传染性疾病将占死亡原因的79％，而其中高血压等心血管疾病将会占到首位。作为现代文明病标志之一的高血压，通常被人们称为“无预兆”的疾病。那是由于高血压引起的后果总要等到对机体产生明显的损害之后才被发觉，这时往往已经太迟了。
生物活性肽是具有生理调节功能的肽类总称，一般而言，这类肽大多相对分子质量较小，在人体内的消化吸收较蛋白质容易。这些小肽不仅能提供人体生长发育所需要的营养，还能调节人体生理机能，起到预防、甚至治疗疾病的作用。食源性生物活性肽的种类较多，包括血管紧张素转化酶(angiotension converting enzyme，ACE)抑制肽、抗氧化肽、免疫调节肽、抗炎肽、抗菌肽、抗血栓肽、阿片样活性肽、促钙吸收肽等。其中ACE抑制肽和抗氧化肽分别与高血压和防衰老的治疗和预防关系紧密，已引起各国科学家与政府的高度关注。
发明内容
本发明的目的在于提供了一系列兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽及其制备方法和应用，兼具ACE抑制和抗氧化活性，为一系列体外模拟消化鲜味肽制备的功能肽序列，同时具有ACE和抗氧化功能，并可用于保健食品，药品或化妆品的研发。
本发明兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽，其氨基酸序列为以下三种：
肽1：Cys-Cys-Asn-Lys；
肽2：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe；
肽3：His-Cys-His-Thr。
下文中，也可以分别简写为：肽1：CCNK(CK-4)，肽2：AHSVRF(AR-6)，肽3：HCHT(HT-4)。
上述本发明的ACE和抗氧化肽序列，包括所述活性肽序列为核心，任何对其进行的相应调整或修饰。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
(1)火腿中鲜味肽的制备；
本发明中的肽1：Cys-Cys-Asn-Lys；肽2：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe；肽3：His-Cys-His-Thr，采用火腿中鲜味肽的制备，火腿中鲜味肽的氨基酸序列分别为以下三种：
肽4：Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val,
肽5：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr，
肽6：His-Cys-His-Thr-Asn。下文中，也可以分别简写为：肽4：CCNKSV(CV-6)，肽5：AHSVRFY(AY-7)，肽6：HCHTN(HN-5)。
(2)固相合成已知序列的来自火腿的鲜味肽和鲜味肽制备的功能肽；
(3)ACE抑制活性的测定；
(4)抗氧化活性的测定，包括DPPH自由基清除活性，ABTS自由基清除活性；
(5)体外模拟胃肠消化(胃蛋白酶和胰酶制备功能肽)；
(6)活性肽的氨基酸序列分析。
一种兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽的制备方法，包括以下步骤：
1)取鲜味肽溶液，于33～40℃水浴锅中预热5～30min，加入HCl水溶液调pH值至2～4，得到待胃蛋白酶水解溶液，加入胃蛋白酶，混匀，水解，水解完成后得到胃蛋白酶水解液；
2)胃蛋白酶水解液用NaOH水溶液调pH值至7～8，得到待胰蛋白酶水解溶液，加入胰蛋白酶，混匀，水解1～3h，到时间后沸水浴灭活，冷却后得到含兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽的溶液。
步骤1)中，所述的鲜味肽溶液的浓度为0.5～2mg/mL(最优选1mg/mL)，所述的鲜味肽溶液为第一鲜味肽溶液、第二鲜味肽溶液或第三鲜味肽溶液；
所述的第一鲜味肽溶液的制备包括：将火腿来源的鲜味肽用蒸馏水溶解，所述的火腿来源的鲜味肽的氨基酸序列为肽4：Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val，使肽浓度为0.5～2mg/mL(最优选1mg/mL)，得到第一鲜味肽溶液；
所述的第二鲜味肽溶液的制备包括：将火腿来源的鲜味肽用蒸馏水溶解，所述的火腿来源的鲜味肽的氨基酸序列为肽5：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr，使肽浓度为0.5～2mg/mL(最优选1mg/mL)，得到第二鲜味肽溶液；
所述的第三鲜味肽溶液的制备包括：将得到的火腿来源的鲜味肽用蒸馏水溶解，所述的火腿来源的鲜味肽的氨基酸序列为肽6：His-Cys-His-Thr-Asn，使肽浓度为0.5～2mg/mL(最优选1mg/mL)，得到第三鲜味肽溶液。
于35～39℃水浴锅中预热5～15min，最优选的，于37℃水浴锅中预热10min。
所述的HCl水溶液的浓度为0.5～1.5mol/L。最优选的，所述的HCl水溶液的浓度为1mol/L。
加入HCl水溶液调pH值至2.5～3.5。最优选的，加入HCl水溶液调pH值至3。
所述的胃蛋白酶的加入量为待胃蛋白酶水解溶液质量的2％～6％，最优选的，所述的胃蛋白酶的加入量为待胃蛋白酶水解溶液质量的4％。所述的胃蛋白酶来源于猪胃，胃蛋白酶1：10,000U。
水解0.5～1.5h，最优选的，水解1h。
步骤2)中，所述的NaOH水溶液为1mol/L。
胃蛋白酶水解液用NaOH水溶液调pH值至7.5～8.5，最优选的，胃蛋白酶水解液用NaOH水溶液调pH值至8。
所述的胰蛋白酶的加入量为待胰蛋白酶水解溶液2％～6％。最优选的，所述的胰蛋白酶的加入量为待胰蛋白酶水解溶液4％。所述的胰蛋白酶的酶活力为1：250。
水解1.5～2.5h，最优选的，水解2h。
到时间后沸水浴5～15min灭活。最优选的，到时间后沸水浴10min灭活。
第一鲜味肽溶液经过胃蛋白酶水解和胰蛋白酶水解后得到含Lys-Ser-Val(KSV)、Cys-Cys-Asn-Lys(CCNK，肽1)的溶液。即所述的鲜味肽溶液为第一鲜味肽溶液，所述的兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽为肽1：Cys-Cys-Asn-Lys。
第二鲜味肽溶液经过胃蛋白酶水解和胰蛋白酶水解后得到含Ala-His-Ser-Val(AHSV)、Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe(AHSVRF，肽2)的溶液。即所述的鲜味肽溶液为第二鲜味肽溶液，所述的兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽为肽2：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe。
第三鲜味肽溶液经过胃蛋白酶水解和胰蛋白酶水解后得到含His-Cys-His-Thr(HCHT，肽3)的溶液。即所述的鲜味肽溶液为第三鲜味肽溶液，所述的兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽为肽3：His-Cys-His-Thr。
所述的兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽能发挥较强的ACE抑制和抗氧化作用，非常适合用于制备降压药物和抗氧化功能药物。
本发明中，体外模拟消化后的鲜味肽具有ACE抑制活性和抗氧化活性，相当于鲜味肽兼具生物活性，具有很多优点：肽不仅在口腔中能被感觉到鲜味，增加适口感，经胃肠消化后，还表现出ACE抑制活性和抗氧化活性，起到预防、甚至治疗疾病的作用。以体外实验结合胃肠道消化吸收研究多肽的生物功能活性，对功能活性多肽的实际生产以及理论研究具有重要意义。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的火腿来源的鲜味肽制备的功能肽不仅可以增强物质的鲜味，而且其ACE抑制活性和抗氧化活性还具有潜在的医学价值。
本发明所涉及的功能肽同时兼具降血压和抗氧化功能，具有结构简单、安全、活性强等特点，发挥出营养和保健的作用，有望为开发无毒副作用的降压和抗氧化功能新药物提供有效成分，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val(CV-6)溶液中混合肽段的离子峰图。
图2为MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr(AY-7)溶液中混合肽段的离子峰图。
图3为MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽His-Cys-His-Thr-Asn(HN-5)溶液中混合肽段的离子峰图。
图4为Cys-Cys-Asn-Lys(CK-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图。
图5为Lys-Ser-Val(KV-3)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图。
图6为Ala-His-Ser-Val(AV-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图。
图7为Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe(AF-6)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图。
图8为His-Cys-His-Thr(HT-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
火腿中鲜味肽的制备
我们参考党亚丽已发表的方法制备火腿中的鲜味肽(党亚丽.金华火腿和巴马火腿风味的研究[D].江南大学,2009.)。切碎混匀的火腿(10g)+纯水(50mL)、匀浆(8min，冰浴)、搅拌(40℃，1h)、离心(2000g,4℃,30min)、重复提取一次，合并二次提取液、离心(10,500g,4℃,30min)过滤、浓缩、冻干。冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(2.6*100cm)，上样浓度为198mg/mL，上样量5mL，流速为39.6mL/h，灵敏度为1.0,吸光度为220nm。将凝胶层析分离得到的呈味最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化。分离条件：进样体积，100μL；流速，3mL/min；洗脱液，A液:0.05％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.05％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0-20min,10-20％B；20-25min,20％-100％B；柱温：35℃；检测波长，220nm。分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对呈味最强的组分进行结构和序列的鉴定。得到火腿中鲜味肽的氨基酸序列分别为以下三种：肽4：Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val,肽5：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr，肽6：His-Cys-His-Thr-Asn。下文中，也可以分别简写为：肽4：CCNKSV(CV-6)，肽5：AHSVRFY(AY-7)，肽6：HCHTN(HN-5)。
本发明采用火腿来源的鲜味肽(肽4：Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val,肽5：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr，肽6：His-Cys-His-Thr-Asn)制备的本发明兼具ACE抑制和抗氧化活性的肽，其氨基酸序列为以下三种：肽1：Cys-Cys-Asn-Lys；肽2：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe；肽3：His-Cys-His-Thr。下文中，也可以分别简写为：肽1：CCNK(CK-4)，肽2：AHSVRF(AR-6)，肽3：HCHT(HT-4)。具体详见实施例2。
实施例2
1.胃蛋白酶和胰酶模拟消化制备功能肽
将得到的火腿来源的鲜味肽(肽4：Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val)用蒸馏水溶解，使肽浓度为1mg/mL，得到第一鲜味肽溶液；
将得到的火腿来源的鲜味肽(肽5：Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr)用蒸馏水溶解，使肽浓度为1mg/mL，得到第二鲜味肽溶液；
将得到的火腿来源的鲜味肽(肽6：His-Cys-His-Thr-Asn)用蒸馏水溶解，使肽浓度为1mg/mL，得到第三鲜味肽溶液；
第一鲜味肽溶液、第二鲜味肽溶液、三鲜味肽溶液分别进行以下处理：
取1mg/mL鲜味肽溶液5mL,于37℃水浴锅中预热10min。加入浓度为1mol/L的HCl调pH值至3,加入胃蛋白酶(4％w/w，来源于猪胃，胃蛋白酶1：10,000U)，混匀，水解1h。水解完成后用浓度为1mol/L的NaOH调pH值至8。加入胰蛋白酶(4％w/w，1：250),加入到水解液中,混匀，水解2h。到时间后沸水浴10min灭活。冷却后进行体外活性检测。
第一鲜味肽溶液经过处理后得到含Lys-Ser-Val(KSV)、Cys-Cys-Asn-Lys(CCNK，肽1)的溶液，作为样品溶液。
第二鲜味肽溶液经过处理后得到含Ala-His-Ser-Val(AHSV)、Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe(AHSVRF，肽2)的溶液，作为样品溶液。
第三鲜味肽溶液经过处理后得到含His-Cys-His-Thr(HCHT，肽3)的溶液，作为样品溶液。
MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val(CV-6)溶液中混合肽段的离子峰图如图1所示。其中离子峰467为多肽CCNK，离子峰333为多肽KSV，其结构鉴定图见图4、5。
MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr(AY-7)溶液中混合肽段的离子峰图如图2所示。其中离子峰413为多肽AHSV，离子峰716为多肽AHSVRF，其结构鉴定图见图6、7
MALDI-TOF-TOF测得的消化后鲜味肽His-Cys-His-Thr-Asn(HN-5)溶液中混合肽段的离子峰图如图3所示。其中离子峰497为多肽HCHT，其结构鉴定图见图8。
Cys-Cys-Asn-Lys(CK-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图如图4所示。
Lys-Ser-Val(KV-3)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图如图5所示。
Ala-His-Ser-Val(AV-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图如图6所示。
Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe(AF-6)的MALDI-TOF-TO F结构鉴定图，如图7所示。
His-Cys-His-Thr(HT-4)的MALDI-TOF-TOF结构鉴定图，如图8所示。
2.血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性检测方法
在离心管中加入80μL 5mmol/L HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)(溶于HEPES缓冲液，PH8.3)和30μL不同浓度的样品溶液(溶于双蒸水)，混合后置于37℃水浴5min，再加入40μL0.025U/mL ACE(溶于HEPES缓冲液，PH8.3)，37℃孵育1h，然后加入150μL 1M盐酸终止反应。空白组在加入ACE的同时加入盐酸，对照组使用30μL双蒸水代替样品溶液，卡托普利(10ng/mL)作为阳性对照。反应完成后用RP-HPLC检测样品中马尿酸(HA)的含量，通过与马尿酸标准品峰面积比较计算得出检测样品中马尿酸含量。色谱条件：色谱柱(CAPCELL PAK C18 AQS-5,4.6*150mm)，柱温30℃，流动相A：水+0.2％三氟乙酸，流动相C：乙腈，流动相比例A：C＝80％：20％，流速1.0ml/min，检测波长：228nm，进样体积100μL，分析时间10min。
抑制率I％＝([HA]b-[HA]s)/([HA]b-[HA]c)×100％，其中[HA]b表示对照组的马尿酸峰面积，[HA]s表示样品的马尿酸峰面积，[HA]c表示的空白组的马尿酸峰面积。
3.抗氧化活性检测方法
①DPPH自由基清除活性
样品组是以不同浓度的样品溶液与0.2mmol/L DPPH(避光，溶于95％乙醇)1：1(v/v)混合；对照组是不同浓度的样品与95％乙醇1：1(v/v)混合；空白组是95％乙醇与0.2mmol/L DPPH(在95％乙醇中)1：1(v/v)混合。摇动混合物并在室温下保持30分钟避光。通过用多功能酶标仪测量517nm处的吸光度来确定DPPH自由基的减少。每个样品重复5次。根据方程式DPPH自由基清除活性(％)＝1-[(As样品-Ac对照)/(Ab空白-Ac对照)]×100％来计算馏分清除DPPH自由基的能力，其中As，Ac和Ab代表分别为样品，对照和空白组的吸光度。VC,GSH用作阳性对照。
②ABTS自由基清除活性
ABTS储备液的制备：ABTS储备液的浓度为7.4mmol/L。取ABTS 96mg，加蒸馏水25mL。
K2S2O8储备液的制备：K2S2O8储备液的浓度为2.6mmol/L。取K2S2O8 378.4mg，加蒸馏水10mL。
ABTS工作液的制备：将5ml 7.4mmol/L ABTS储备液与88μL 2.6mmoL/L K2S2O8混匀，避光静置12-16小时，配制成ABTS工作液。
操作步骤：取0.4mL ABTS工作液，用PBS溶液稀释，要求在常温下734nm处吸光值为0.7±0.02。0.2mL ABTS工作液与10μL不同浓度受试物混合，常温避光静置6min，在734nm波长处测吸光度。每个样品重复5次。ABTS自由基清除能力由下式计算：清除率(％)＝[A0-Ai/A0]×100％。式中：A0为不加样品，加入ABTS的吸光度；Ai为加入样品和ABTS工作液的吸光度。
4.活性肽的氨基酸序列分析
样品溶解后直接采用5800型MALDI-TOF-TOF进行分析：
①点样方式：先点0.5μL的样品于FMALDI靶板上，自然干燥后，再点上0.5μL的0.5g/mL CHCA溶液(溶剂：0.1％TFA+50％ACN)中，在室温下自然干燥。
②样品用5800串联飞行时间质谱仪5800MALDI-TOF-TOF进行质谱分析，激光源为335nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20kV，采用正离了模式和自动获取数据的模式采集数据。仪器先用myoglobin酶解肽段进行外标校正。基质和样品的质量扫描范围为100-1200Da。进行完MS后，直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。
③MS采用Reflector Positive参数:CID(OFF),mass rang(100-1200Da)FocusMass(500Da)Fixed laser intensity(5000)Digitizer:Bin Size(0.5ns)。MS/MS采用2KVPositive参数:CID(ON)，Precursor Mass Windows(Relative 80resolution(FWHM)Fixedlaser intensity(6000)Digitizer:Bin Size(1ns)。
④得到的MS/MS谱图后采用仪器软件TOF/TOF Explorer自带的分析工具：DeNovoExplorer结合数据库比对进行从头测序。得到序列后，再采用软件Data Explorer将MS/MS图标上a,b,c,x,y,z等由母离子碎裂后得到的子离子。
5.结果分析
鲜味肽在体外经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化两小时后，对酶切前后的肽溶液进行ACE抑制活性和抗氧化活性测定，结果见表1。由表1知，CV-6、AY-7、HN-5的ACE抑制活性体外经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后较稳定，且消化前后活性变化小，说明CV-6、AY-7、HN-5在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下的降血压活性非常稳定，具有广泛的应用前景。AY-7和HN-5的抗氧化活性在消化过程中整体比较稳定，是较为理想的抗氧化剂。虽然CV-6的DPPH自由基清除活性经消化后有所降低，但其兼具两种功能且活性很强，具有非常好的前药应用前景。
表1活性肽体外模拟胃肠消化前后ACE和DPP-IV抑制活性的变化
注：ACE抑制活性的实验中肽浓度为200μg/mL；DPPH自由基清除活性的实验中肽浓度为50μg/mL；ABTS自由基清除活性的实验中肽浓度为5μg/mL。
经MALDI-TOF-TOF对体外模拟胃肠消化的鲜味肽可能产生的活性肽序列进行分析，结果如表2所示。
表2鲜味肽经体外模拟胃肠消化制备的肽序列
经体外模拟胃肠消化制备的肽的ACE抑制活性和抗氧化活性见表3。由表3可知，KSV和AHSV的ACE抑制活性和抗氧化活性较弱，然而CCNK、AHSVRF和HCHT的ACE抑制活性都很强，IC50低至9、18和115μM左右。而且，CCNK和HCHT的抗氧化活性都很高，AHSVRF的抗氧化活性稍差一点。由此，CCNK、AHSVRF和HCHT同时具有ACE抑制活性和抗氧化活性。
表3体外模拟胃肠消化制备的肽的ACE抑制活性和抗氧化活性
注：DPPH自由基清除活性的实验中肽浓度为50μg/mL；ABTS自由基清除活性的实验中肽浓度为20μg/mL。Nd代表未测定。
理论上，在血液及细胞中蛋白酶作用下会形成多种具有生物活性的小肽，可能会发挥更强的ACE抑制和抗氧化作用，在食品和药品中具有较大的应用意义。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。