中枢神经系统疾病的预防或治疗用丝氨酸衍生化合物
阅读说明：本技术 中枢神经系统疾病的预防或治疗用丝氨酸衍生化合物 (Serine derivative compounds for the prevention or treatment of central nervous system diseases ) 是由 金英浩 黄寿卿 田桃连 赵英经 李民龙 于 2020-01-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的透过力得到改善的新型丝氨酸衍生化合物(serine derivative compound)及其用途,更具体地,涉及与L-丝氨酸(L-serine)相比较,血-脑屏障透过力更加改善的新型丝氨酸衍生化合物和包含上述化合物作为有效成分的用于预防或治疗/改善认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、里特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等中枢神经系统疾病(centralnervous system diseases)的药学组合物等。作为本发明的中枢神经系统疾病的预防或治疗用药学组合物等的有效成分,化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐与L-丝氨酸相比,呈现显著改善的血-脑屏障透过率,使神经细胞的增殖激活,通过抑制氧化应激引起的线粒体膜电位受损和/或内质网应激引起的神经细胞凋亡的神经细胞保护效果,认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等中枢神经系统疾病的预防、治疗及改善效果优秀,故而上述化合物等是非常有用于医药产业、食品产业及畜牧业的发明。(The present invention relates to a novel serine derivative compound (serine derivative compound) having improved permeability of blood-brain barrier (BBB) and use thereof, and more particularly, to a novel serine derivative compound having improved permeability of blood-brain barrier compared to L-serine (L-serine), and a pharmaceutical composition for preventing or treating/improving central nervous system diseases (centralnervous system diseases) such as cognitive disorders, intellectual disorders, cerebellar disorders, epilepsy, neurodevelopmental disorders, dementia, autism spectrum disorders, down syndrome, reiter syndrome, fragile X syndrome, alzheimer disease, parkinson disease, huntington disease, and amyotrophic lateral sclerosis, which contains the above compound as an active ingredient. As the active ingredient of the pharmaceutical composition for preventing or treating central nervous system diseases of the present invention, the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof exhibits significantly improved blood-brain barrier permeability compared to L-serine, activates proliferation of nerve cells, has a neuronal protection effect by inhibiting mitochondrial membrane potential damage due to oxidative stress and/or neuronal apoptosis due to endoplasmic reticulum stress, and is excellent in the prevention, treatment and improvement effects of central nervous system diseases such as cognitive impairment, intellectual impairment, cerebellar disease, epilepsy, neurodevelopmental disorder, dementia, autism spectrum disorder, Down syndrome, Rett syndrome, Fragile X syndrome, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis, and the like, and therefore, the compound is very useful in the pharmaceutical industry, and the like, The invention of food industry and animal husbandry.)
技术领域
本发明涉及血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的透过力得到改善的新型丝氨酸衍生化合物(serine derivative compound)及其用途，更详细地，涉及与L-丝氨酸(L-serine)相比，血-脑屏障透过力更加改善的新型丝氨酸衍生化合物和包含上述化合物作为有效成分的用于预防或治疗/改善认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、里特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等的中枢神经系统疾病(centralnervous system diseases)的药学组合物等。
背景技术
L-丝氨酸在生物体内不仅是蛋白质的组成成分，也是在嘌呤(purine)、嘧啶(pyrimidine)、甘氨酸(glycine)、半胱氨酸(cystein)等的生物合成和脑中的鞘磷脂(sphingomyeline)、脑苷脂(cerebrosides)、D-丝氨酸(D-serine)等的生物合成中息息相关的氨基酸，可由食品供给，但可在生物体内合成而被分类为非必需氨基酸。但是，L-丝氨酸通过血-脑屏障时，呈现低的透过力，因而脑中的生物合成缺陷被视为小脑症、癫痫、智力障碍等脑神经发育障碍的病因。因此，最近L-丝氨酸被认为是“条件必需氨基酸(conditionally essential amino acid)”[Smith QR,1987；de Koning et al.,2003；Metcalf et al.,2018]。
据报道，作为因脑中的丝氨酸生物合成路径的缺陷而导致的脑神经发育障碍的病因，L-丝氨酸不仅起到神经细胞的神经营养因子(neurotrophic factor)作用[Furuya etal.,2000]，与作为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体的协同激动剂(co-agonist)的D-丝氨酸供给相关而在脑神经发育、突触精细化(synapse refinement)、神经可塑性(neuronal plasticity)及兴奋细胞毒性(excitotoxicity)等中也起到重要作用[Wolosker et al.,2002；Lench et al.,2014]。
因丝氨酸的生物合成基因3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-phosphoglyceratedehydrogenase，PHGDH)、磷酸丝氨酸转氨酶(phosphoserine aminotransferase，PSAT)和磷酸丝氨酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase，PSP)变异所导致的丝氨酸代谢缺陷患者身上确认到先天性精神肢体障碍、肢体畸形(limb malformation)、小头畸形(microcephaly)、神经管缺损(neural tube defects)，当以100～600mg/kg/day给这些患者口服给药L-丝氨酸时，症状可得到改善及治疗[Pineda et al.,2000；De Koning etal.,2002]，当同时给药200～700mg/kg丝氨酸和200～300mg/kg甘氨酸时，被认为痉挛减少、脑白质体积增加及髓鞘恢复[Tabatabaie et al.,2011；El-Hattab 2016]，以这些研究结果为基础可知，供给根据脑中的丝氨酸代谢缺陷所需的L-丝氨酸对于目标疾病的治疗非常重要。
并且，在基于β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-L-alanine，L-BMAA)的关岛型肌萎缩侧索硬化症(Guamanian amyotrophic lateral sclerosis，ALS)/帕金森综合征痴呆复合征(Parkinsonism dementia complex，PDC)治疗研究[Dunlop et al.,2018]和用于治疗肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)的临床研究中报告了L-丝氨酸的效果[Dunlop et al.,2018]，并且L-丝氨酸作为神经疾病治疗剂的可能性被熟知。
像这种L-丝氨酸作为治疗剂的潜力(therapeuic potential)是因为丝氨酸将胸苷(thymidine)和嘌呤生物合成中所需的一个碳原子(one-carbon)提供至叶酸循环(folate cycle)，不仅维持生物体内氧化还原(redox)稳态，也被用作甘氨酸和半胱氨酸前体及细胞性抗氧化剂(cellular antioxidant)谷胱甘肽(GSH)的抗氧化系前体。
另一方面，据报告，包括自闭症谱系障碍(autism spectrum disoeder,ASD)的认知障碍[Valenti et al.,2014]、阿尔茨海默病(Alzheimer)[Wang et al.,2014]、帕金森病(Parkinson's Disease)[Franco-Iborra et al.,2018]、肌萎缩侧索硬化症(amyotropic lateral sclerosis，ALS)[Cozzolino and Carri,2012]之类的神经系统疾病的发病原因为与生物能量代谢和氧化还原维持密切相关的线粒体受损引起的氧化应激导致的神经细胞凋亡。线粒体是细胞的凋亡(apoptosis)或坏死(necrosis)的执行机构，为了从外部环境应激中维持细胞稳态，通过如线粒体的分裂及融合一样的线粒体数的量化调节来保护细胞或者恢复或去除受损的细胞[Youle and van der Bliek,2012；Ni et al.,2014]。
尤其，神经细胞是需要高于其他组织的细胞的能量代谢，容易过氧化(peroxidation)的脂肪酸和金属离子比率高且细胞抗氧化系水平比较低的分裂后非增殖细胞(post-mitotic non-proliferating cell)，其非常弱于活性氧簇或活性氮簇引起的氧化应激[Ogawa et al.,2007；Bhat et al.,2015]。据报告，基于这种神经细胞的特征，主要发病原因互不相同，但是，认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征之类的神经发育障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症之类的退行性神经疾病的共同症状为氧化应激引起的线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)。
现有技术文献
非专利文献
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发明内容
技术问题
本发明可在上述现有技术的延长线上进行讨论，本发明中要解决的问题在于，提供血-脑屏障的透过力得到显著改善的新型丝氨酸衍生化合物(serine derivativecompound)及包含上述化合物作为有效成分的用于预防或治疗认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等中枢神经系统疾病(centralnervous system diseases)的药学组合物等。
解决问题的方案
为了解决如上所述的问题，本发明提供以下化学式(Ⅰ)的化合物、上述化合物的药剂学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或异构体：
并且，本发明提供上述化学式(Ⅰ)的化合物的制备方法，其包括连续3次向2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin)导入H-Ser(Trt)-OH，并导入H-Lys(Boc)-OH之后切割树脂的步骤。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的中枢神经系统疾病的预防或治疗用药学组合物。
优选地，上述中枢神经系统疾病选自由认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症组成的组中。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的中枢神经系统疾病的预防或改善用保健食品。
优选地，上述中枢神经系统疾病选自由认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症组成的组中。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的饲料添加用组合物。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的神经细胞凋亡抑制用试剂组合物。
并且，本发明提供包括在体外(in vitro)将上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐处理于神经细胞的步骤的神经细胞的细胞凋亡抑制方法。
发明的效果
作为本发明的中枢神经系统疾病的预防或治疗用药学组合物等的有效成分，化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐与L-丝氨酸相比，呈现显著改善的血-脑屏障透过率，激活神经细胞的增殖，并通过抑制氧化应激引起的线粒体膜电位损伤及/或内质网应激引起的神经细胞凋亡的神经细胞保护效果，认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫症、神经发育障碍、痴呆症、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、里特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等的中枢神经系统疾病的预防、治疗及改善效果优秀，因此上述化合物等是在医药产业、食品产业及畜牧业中非常有用的发明。
附图说明
图1显示根据由本发明的化学式(Ⅰ)表示的丝氨酸衍生化合物(以下，还由“AST-009”表示)的处理浓度的小鼠海马神经元HT-22细胞(mouse hippocampal neuronal HT-22cells)的细胞活化。(A)显示丝氨酸/甘氨酸缺失培养基中的细胞活力(cellviability)，(B)显示完全培养基中的细胞活力(cell viability)。
图2显示根据由本发明的化学式(Ⅰ)表示的丝氨酸衍生化合物(AST-009)的处理浓度的2,3-二甲氧基-1,4-萘醌(2,3-dimethoxy-1,4-napthoquinone，DMNQ)处理的小鼠海马神经元HT-22细胞的细胞保护效果。
图3将本发明的化学式(Ⅰ)表示的丝氨酸衍生化合物(AST-009)给药至ICR小鼠之后，对分布在血液和脑中的浓度进行定量，求得脑/血中比例，显示血-脑屏障透过力。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的发明人开发可改善对患有神经发育障碍的患者呈现效果而被熟知的L-丝氨酸的低血-脑屏障透过力，并对与先天性神经疾病及神经退行性疾病等中枢神经系统相关的疾病呈现效果的新型丝氨酸衍生化合物。
因此，本发明提供以下化学式(Ⅰ)的化合物、上述化合物的药剂学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或异构体：
上述化学式(I)的化合物能够以碱-加成盐或酸-加成盐的形态存在。上述加成盐包含在本发明的一部分。上述盐有利地利用药学上可接受的酸制备，但是例如，对纯化或分离化学式(I)的化合物有用的其他酸的盐也包含在本发明的一部分。上述酸例如可以为苦味酸、草酸或光学活性酸、例如，酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸或樟脑磺酸及形成生理学上可接受的盐，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸二氢盐、苹果酸盐、富马酸盐、2-萘磺酸盐或对甲苯磺酸盐的酸。有关生理学上可接受的盐，可参照文献[Handbookof Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use by Stahl and Wermuth(Wiley-VCH,2002)]。
上述溶剂化物或水合物可在合成过程之后直接获取，化合物(I)能够以水合物，例如，一水合物或半水合物的形态分离，或以反应或纯化溶剂的溶剂化物的形态分离。
并且，上述化学式(I)的化合物能够以异构体例如对映异构体、非对映异构体及旋转异构体的形态存在。上述化学式(I)的化合物的对映异构体、非对映异构体及旋转异构体包含在本发明的一部分。
本发明的上述化学式(I)的化合物可通过如下所述的制备方法以高的收率和纯度合成。
因此，本发明提供上述化学式(Ⅰ)的化合物的制备方法，包括连续3次向2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin)导入H-Ser(Trt)-OH，并导入H-Lys(Boc)-OH之后切割树脂的步骤。
参照合成方案(scheme)，对化学式(Ⅰ)的丝氨酸衍生化合物的具体制备方法进行如下说明：
[Scheme]
(1)CLTR Swelling及H-Ser(Trt)-OH导入
1)向4L反应器中加入2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin)(0.1mmol)和MC(0.4L)，膨胀(swelling)2小时。
2)向膨胀(Swelling)的树脂(resin)中加入含Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)和二异丙基乙胺(DIPEA)(3eq)的二甲基甲酰胺(DMF)(0.2L)，并在室温下反应6小时。
3)反应结束后，用DMF(0.2L)进行洗涤。
4)加入MC/MeOH/DIPEA(255:30:15)混合液，并在室温下进行封盖摇动(Cappingshaking)反应2小时。
5)封盖(Capping)结束后，用DMF(0.2L)进行洗涤。
6)加入解封(De-blocking)(DMF 0.3L中的20％哌啶(piperidine))溶液并在室温下反应2小时。
7)解封(De-Blocikng)结束后，用DMF(0.2L)洗涤3次，并用MC(0.2L)洗涤2次。
(2)H-Ser(Trt)-OH导入
1)结束上述(1)工序后，在该反应器内溶解Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中，在室温下反应6小时以上。
2)反应结束时，用DMF(0.2L)进行洗涤。
3)加入解封(De-blocking)(DMF 0.3L中的20％哌啶(piperi-dine)溶液并在室温下反应2小时。
4)用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。
(3)H-Ser(Trt)-OH导入
1)完成上述(2)工序后，在该反应器内溶解Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中反应6小时以上。
2)反应结束时，用DMF(0.2L)进行洗涤。
3)加入解封(De-blocking)(DMF 0.3L中的20％哌啶(piperidine)溶液并在常温下反应2小时。
4)用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。
(4)H-Lys(Boc)-OH导入
1)结束上述(3)工序后，在该反应器内溶解Fmoc-Lys(Boc)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中反应6小时以上。
2)反应结束时，用DMF(0.2L)进行洗涤。
3)加入解封(De-blocking)(DMF 0.3L中的20％哌啶(piperidine))溶液并在常温下反应2小时。
4)用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。
(5)切割的(Cleavage)粗制(Crude)H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH的合成
1)向结束合成的树脂(resin)中加入三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、H2O，并进行切割(cleavage)。
2)将切割(cleavage)的树脂(resin)通过玻璃过滤器(Glass filter)来过滤树脂(Resin)，将过滤的滤液在乙醚(Ether)中分散之后，离心分离来获得粗制(Crude)产品。
(6)最终化合物(H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH)的纯化
1)将干燥的粗制(Crude)产品溶解在水中，并利用Prep LC来获得纯度90％以上的H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH。
2)冷冻干燥纯化的产品来获得最终H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH。
本发明的上述化学式(Ⅰ)或其药学上可接受的盐，改善L-丝氨酸的低血脑屏障透过力，可对先天性神经疾病及退行性神经疾病等中枢神经系统相关疾病呈现效果，因此可应用为以预防或治疗上述疾病的医药用途。
因此，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的中枢神经系统疾病的预防或治疗用药学组合物。
本发明的有效成分能够以医药用途应用于中枢神经系统相关疾病，优选地，上述中枢神经系统疾病选自由认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症组成的组中。
优选地，上述有效成分诱导神经细胞增殖激活。上述术语“神经细胞增殖激活”可理解为均包括促进神经细胞的细胞分裂的作用、可抑制神经细胞的凋亡或坏死的作用。
优选地，上述有效成分具有神经细胞保护活性。上述术语“神经细胞保护”意味着可抑制神经细胞因外部因素或细胞内部因素而发生细胞凋亡或坏死的作用。
优选地，上述神经细胞保护从氧化应激中保护。上述术语“氧化应激”意味着细胞因活性氧簇而处于异常状态。
优选地，通过抑制线粒体膜电位受损引起的细胞凋亡，从上述氧化应激中保护。
优选地，通过抑制内质网应激引起的细胞凋亡，从上述氧化应激中保护。
优选地，上述有效成分具有对血脑屏障的透过力。本发明的有效成分显著改善L-丝氨酸所具有的低的血脑屏障透过度，具有给药到患有L-丝氨酸生物合成缺陷的患者时，可有效传递到脑部的效果。
本发明的药学组合物可按各个使用目的根据常规方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳液、糖浆、气溶胶等口服剂型、灭菌注射溶液的注射剂等多种形态剂型化来使用，可口服给药，或可通过包括静脉内、腹腔内、皮下、直肠、局部给药等的多种途径给药。
这种药学组合物还可包含载体、赋形剂或稀释剂等，作为可包含的适当的载体、赋形剂或稀释剂的例，可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、非晶质纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。
并且，本发明的药学组合物还可包含填充剂、抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
本发明的药学组合物以药剂学上有效的量给药。在本发明中，“药剂学上有效的量”是指以可应用于医学治疗的合理受益/危险比率治疗疾病的充分量，有效容量水平可根据包括患者的疾病的种类、重症度、药物的活性、对于药物的敏感度、给药时间、给药途径及排出比率、治疗期间、同时使用的药物的因素及其他医学领域中知悉的因素而确定。
本发明的药学组合物能够以个别治疗剂给药或与其他治疗剂并用给药，可与以往的治疗剂依次或同时给药，可单次或多次给药。重要的是，将均考虑上述因素而可在无副作用的情况下以最小限度的量获得最大效果的量给药，这可由本发明所属技术领域的普通技术人员容易确定。
作为优选的具体例，本发明药学组合物的有效成分的有效量可根据患者的年龄、性别、体重而不同，通常，每体重可给药1至5000mg，优选地，可每天或隔天给药100至3000mg或一天分1至3次给药。但是，可根据给药途径、疾病的重症度、性别、体重、年龄等而增减，因而上述给药量以任何方法也不限制本发明的范围。
本发明的药学组合物可通过多种途径给药到对象。给药的所有方式可预测，例如，可通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内(intracerebroventricular)注射给药。
在本发明中，“给药”意味着以任意适当的方法向患者提供规定的物质，本发明的药学组合物的给药途径只要可达到目的组织，就可通过常规的所有途径口服或非口服给药。并且，本发明的组合物还可利用可向靶细胞传递有效成分的任意装置给药。
在本发明中，“对象”不受特别限制，但例如，包括人、猴、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、老鼠、兔或豚鼠，优选地，意味着哺乳类，更优选地，意味着人。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的中枢神经系统疾病的预防或改善用保健食品。
优选地，上述中枢神经系统疾病选自由认知障碍、智力障碍、小脑症、癫痫、神经发育障碍、痴呆、自闭症谱系障碍、唐氏综合征、雷特综合征、脆性X综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症组成的组中。
本发明的保健食品可多样地利用于有效预防和改善中枢神经系统相关疾病的食品及饮料等。
作为包含本发明的有效成分的食品，例如有各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、保健品类等，能够以粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形态使用。
通常，本发明的有效成分能够以食品总重量的0.01至15重量百分比添加，以100ml为基准，保健饮料组合物能够以0.02至10g添加，优选地以0.3至1g的比率添加。
本发明的保健食品除了以指示的比率包含上述化合物作为必要成分之外，可包含食品学上可接受的食品辅助添加剂，例如，天然碳水化合物及多种调味剂等作为追加成分。
上述天然碳水化合物的例有葡萄糖、果糖等单糖类、麦芽糖、蔗糖等二糖类、糊精、环糊精等多糖类之类的常规的糖及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。
上述调味剂可使用索马甜、莱鲍迪甙A、甘草甜素、糖精、阿斯巴甜等。在每100ml的本发明的保健食品中，上述调味剂的比率通常使用约1至20g，优选地，使用约5至12g。
除了上述之外，本发明的保健食品可包含多种营养剂、维生素、矿物、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、使用于碳酸饮料的碳酸化剂等。
此外，本发明的保健食品还可包含用于制备天然果汁及果汁饮料及蔬菜饮料等的果肉。这种成分可独立或组合使用。在每100重量份的本发明的上述活性分馏物中，这种添加剂的比率通常在0.01至约20重量份的范围内选择。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的饲料添加用组合物。
上述饲料添加用组合物可以为动物用。上述“动物”作为与植物相对应的生物群，主要将有机物作为营养成分摄取，其消化或排泄及呼吸器官分化，具体地，可以为棘皮动物、甲壳类、软体动物、鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类、哺乳类，优选地，可以为海胆类或海参类之类的棘皮动物、包括螃蟹、虾、大虾等甲壳类的节肢动物、头足类、腹足类或双壳类等软体动物、真鲷、鲷鱼、鳕鱼、鲽鱼、偏口鱼等鱼类、包括野鸡或鸡等家禽类的鸟类或猪、牛、羊、马、山羊、狗、猫等哺乳类。
上述饲料添加用组合物在本发明的有效成分中还可包含谷物、植物性蛋白质饲料、动物性蛋白质饲料、糖分或乳制品。上述谷物具体地可以为粉碎或破碎的小麦、燕麦、大麦、玉米及大米，上述植物性蛋白质饲料具体地能够以油菜、大豆及向日葵为主要成分，上述动物性蛋白质饲料具体地可以为血粉、肉粉、骨粉及海鲜粉，上述糖分或乳制品具体地可以为由各种奶粉及乳浆粉末形成的干燥成分。
上述饲料添加用组合物还可一同使用营养补充剂、消化及吸收提高剂、生长促进剂或疾病预防剂之类的成分。
本发明的饲料添加用组合物可根据饲料的使用目的及使用条件而不同，作为一例，以1kg的最终生产的饲料为基准，可包含0.1至100g的上述饲料添加用组合物。
并且，上述饲料添加用组合物可根据成分的粉碎程度而制备成硬粘性的粗粒或颗粒物质，上述组合物能够以网孔供给，或为了追加加工及包装而以所需的分离的形状形成，为了储存，可经过颗粒化、膨胀化或挤压工序，为了容易储存，优选地，过多的水被干燥去除。
并且，本发明提供包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的研究用试剂组合物，优选地提供神经细胞凋亡抑制用试剂组合物。
上述神经细胞可以为原发神经细胞、转化神经细胞或神经细胞株。
上述试剂能够以神经细胞增殖激活、根据线粒体的耗氧率增加的神经细胞增殖激活、神经细胞保护、抑制氧化应激引起的神经细胞受损、抑制氧化应激引起的线粒体膜电位受损导致的神经细胞凋亡、抑制氧化应激引起的内质网应激导致的神经细胞凋亡的用途应用。
并且，本发明提供神经细胞的细胞凋亡抑制方法，该方法包括将包含上述化学式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的本发明的试剂处理于神经细胞的步骤。
可通过上述方法获得神经细胞的增殖、根据线粒体的耗氧率增加的神经细胞增殖激活、神经细胞保护、抑制氧化应激引起的神经细胞受损、抑制氧化应激引起的线粒体膜电位受损导致的神经细胞凋亡、抑制氧化应激引起的内质网应激导致的神经细胞凋亡的效果。
在上述方法中，细胞培养法、试剂处理法等对本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的，尤其，试剂的处理浓度等可在不改变本说明书中记载的事项的范围内或其效果的范围内适当地变形。
优选地，上述方法在体外(in vitro)进行。
以下，通过具体的实施例更详细说明本发明。以下实施例记载本发明的优选的一具体例，要明确的是，本发明的权利范围并不限定于以下实施例中记载的内容而被解释。
实施例
1.材料及方法
1.1.培养基及试剂
达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES，4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid)和链霉素-青霉素(streptomycin-penicillin)等细胞培养用试剂购买于Gibco BRL公司(Grand Island，USA)。
1.2.新型丝氨酸衍生化合物(AST-009)的制备
向4L反应器中加入2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin)(0.1mmol)和MC(0.4L)，膨胀(swelling)2小时。向膨胀(swelling)的树脂(resin)中加入DMF(0.2L)中的Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)和DIPEA(3eq)，并在室温(RT)下反应6小时，反应结束后，用DMF(0.2L)进行洗涤。加入MC/MeOH/DIPEA(255:30:15)混合液，在室温下进行封盖摇动(Capping shaking)反应2小时之后，用DMF(0.2L)进行洗涤。加入解封(De-blocking)(DMF 0.3L中的20％哌啶(20％piperidine in DMF＝0.3L))溶液，并在室温(RT)下反应2小时，解封(De-blocking)结束之后，用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。接着，在上述反应器中溶解Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中，并在常温下反应6小时以上。反应结束时，用DMF(0.2L)进行洗涤，加入解封(De-blocking)(20％piperidine in DMF＝0.3L)溶液，并在室温(RT)下反应2小时之后，用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。接着，在该反应器中溶解Fmoc-Ser(trt)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中，反应6小时以上之后，用DMF(0.2L)进行洗涤。加入解封(De-blocking)(20％piperidine in DMF＝0.3L)溶液，并在室温(RT)下反应2小时之后，用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。接着，在该反应器中溶解Fmoc-Lys(Boc)-OH(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、DMF(0.3L)之后，将DIPEA(2eq)加入溶解有HBTU(1.5eq)的DMF(0.2L)溶液中，快速放入反应器中，反应6小时以上之后，用DMF(0.2L)进行洗涤。加入解封(De-blocking)(20％piperidine in DMF＝0.3L)溶液，并在室温(RT)下反应2小时之后，再次用DMF(0.2L)洗涤3次，用MC(0.2L)洗涤2次。接着，向结束合成的树脂(resin)中加入TFA、TIS、H2O并进行切割(cleavage)之后，将切割(cleavage)的树脂(resin)通过玻璃过滤器(Glass filter)来过滤树脂(Resin)，将过滤的滤液在乙醚(Ether)中分散之后，离心分离，从而获得了粗制(Crude)产品。最后，将干燥的粗制(Crude)产品溶解在水中，并利用Prep LC来获得纯度90％以上的H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH之后，冷冻干燥纯化的产品来获得最终H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH。
1.3.细胞培养
在DMEM内添加10％FBS和100μg/ml的正泰霉素(gentamycin)的培养基中，在37℃、5％CO2大气(atmosphere)环境下培养小鼠海马神经元细胞系(Murine hippocampalneuronal cell line)HT-22。在本实施例中，使用细胞继代回收15次以下的细胞。
1.4.细胞活力分析(Cell viability assay)
通过测定细胞活力的MTT assay调查细胞增殖活性。首先，在96-孔板(wellplates)中，将海马神经元细胞(hippocampal neuronal cell)HT-22(1×104cells)与按步骤稀释的试样溶液一同培养(incubation)16小时之后，与50μl的3-(4，5-二甲基噻唑基)2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl thiazolyl)2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT)溶液(1.1mg/ml)混合之后，进一步培养4小时。利用150μl的MTT溶液使形成的甲臜晶体(formazan crystal)溶解，利用酶标仪(plate reader)在540nm下测定光密度(OD)。
1.5.流式细胞技术(Flow cytometry)分析
首先，利用包含2％FBS的PBS溶液将1×106细胞水洗3次之后，将水洗的细胞悬浊于70％乙醇中，在4℃下固定1小时。重新利用相同的溶液将固定的细胞洗涤2次之后，悬浊于浓度为50μg/ml的RNase A溶液250μl中，在37℃下处理30分钟去除细胞内核糖核酸(RNA)，添加50μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide)/1.12％柠檬酸钠缓冲液(sodiumcitrate buffer)(pH8.45)溶液250μl，在室温下将细胞内DNA染色20分钟。利用流式细胞仪(flow cytometer)(FACS Calibur)对其进行分析，以各个细胞内染色的DNA的含量为基准调查细胞周期的分布。
1.6.血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)透过力检验
以500mg/kg将L-丝氨酸、AST-009给药到7周龄的ICR小鼠(n＝3)之后，采集脑组织和血液，利用LC/Ms对分布于血液和脑部的L-丝氨酸的浓度进行定量，求出脑/血中比率，比较药物之间的BBB透过力。
2.结果
2.1.新型L-丝氨酸衍生物的开发
虽然L-丝氨酸是在生物体内生物合成的非必需氨基酸，但因血-脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)透过力低而在脑中无法供给充足的L-丝氨酸时，则成为严重的神经发育障碍的原因。血中的L-丝氨酸通过中性氨基酸转运蛋白(neutral amino acidtransporter)ASC-1(丙氨酸，丝氨酸，半胱氨酸转运蛋白)(alanine，serine，cysteinetransporters)选择性地被输送，因此在用于改善及治疗神经发育障碍相关疾病的L-丝氨酸供给方面受到很多限制。因此，开发了15余种L-丝氨酸衍生物，以开发如L-丝氨酸一样细胞保护活性突出的同时血-脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)透过能力也得到改善的丝氨酸衍生物。开发的15种当中，通过药代动力学评价及细胞毒性评价来筛选了本发明的丝氨酸衍生化合物(AST-009)。
2.2.神经细胞增殖活性评价
为了评价筛选的本发明的丝氨酸衍生化合物(AST-009)的神经细胞增殖活性，将L-丝氨酸与AST-009一起作为对照组，以不同浓度(25～10000μg)添加来比较细胞增殖活性。其结果，如图1所示，在完全培养基中，L-丝氨酸和AST-009之间对细胞增殖的影响无太大差异(图1的B)，但在L-丝氨酸和甘氨酸缺乏培养基中，L-丝氨酸和AST-009与无添加组相比，均激活了HT-22细胞增殖(图1的A)。此时，L-丝氨酸的处理浓度500Fg/ml也激活细胞增殖最高至125％，但在1mg/ml浓度以上反而稍微抑制了细胞增殖。与此相比，确认了AST-009的处理浓度10000μg/ml(＝10mg/ml)在无细胞毒性的情况下也激活HT-22细胞的增殖至139％。
2.3.神经细胞保护活性评价
通过DiOC6染色法比较对由筛选的药物(AST-009)的DMNQ诱导的氧化应激(oxidative stress)的细胞保护活性，其结果，确认到如图2所示，当单独处理DMNQ(10μM)时，细胞受损率为77.8％，相反，当以0.5、1、5mg/ml的浓度处理L-丝氨酸时，膜电位损失(membrane potential loss)比率浓度依赖性地得到保护，恢复为59.9％、58.7％和54.5％。与此相反，就AST-009而言，在相同的处理浓度下，线粒体膜电位损失(membranepotential loss)为64.3％、45.5％及20.0％，相比于L-丝氨酸处理组更低，由此可知细胞保护活性更强。即，可确认到AST-009相比于L-丝氨酸，不仅可使细胞增殖激活，而且从氧化应激中保护神经细胞的活性也比起L-丝氨酸更优秀。
2.4.新型L-丝氨酸衍生物的Blood-Brain Barrier(BBB)透过力检验
与L-丝氨酸比较是否过渡到筛选的丝氨酸衍生物AST-009的脑部，将其结果示于图3及表1中。如图3和表1所示，AST-009药物的Cbrain/Cplasm数值呈现6.66±1.03，其高于L-丝氨酸的4.16±2.03，这被确认为BBB透过力相比于L-丝氨酸显著改善的药物。
表1
*p<0.05vs对照组
【支援本发明的韩国研究开发事业】
【课题固有号】S2611222
【部门名】中小风险企业部
【研究管理专门机构】中小企业技术信息振兴院
【研究事业名】创业成长-技术开发事业
【研究课题名】自闭症谱系障碍改善功能性食品开发
【贡献率】1/1
【主管机构】阿斯特罗森株式会社
【研究期间】2018.06.29～2019.06.28
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