阅读说明：本技术 一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽及其应用 (Polypeptide with nNOS-Capon uncoupling activity and application thereof ) 是由 秦亚娟 厉廷有 冯玲玲 徐剑 郑礼平 于 2020-04-15 设计创作，主要内容包括：一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽及其应用,其特征在于氨基酸序列结构通式为Che-Xaa<Sup>1</Sup>-Xaa<Sup>2</Sup>-Xaa<Sup>3</Sup>-Val,其中Che=N-Cyclohexylethyl,Xaa<Sup>1</Sup>=Ala或Gly,Xaa<Sup>2</Sup>=Glu、Glu(OMe)、Asp或Asp(OMe),Xaa<Sup>3</Sup>=修饰的或天然氨基酸。这类多肽具有nNOS-Capon解耦连活性,可作为神经保护剂用于缺血性脑卒中的治疗。提供了一种体外快速筛选nNOS-Capon解偶联活性的荧光偏振法(FP)。通过FP法筛选的多肽在大鼠脑缺血再灌注模型(MACO)有明显神经保护作用。(The polypeptide with nNOS-Capon uncoupling activity and the application thereof are characterized in that the general structural formula of the amino acid sequence is Che-Xaa 1 ‑Xaa 2 ‑Xaa 3 -Val, wherein Che = N-Cyclohexylethyl, Xaa 1 = Ala or Gly, Xaa 2 = Glu, Glu (OMe), Asp or Asp (OMe), Xaa 3 = modified or natural amino acids. This is achieved byThe polypeptide-like has nNOS-Capon decoupling activity, and can be used as a neuroprotective agent for treating ischemic stroke. Provides a fluorescence polarization method (FP) for rapidly screening the uncoupling activity of nNOS-Capon in vitro. The polypeptide screened by the FP method has obvious neuroprotective effect on a rat cerebral ischemia-reperfusion Model (MACO).)

一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽及其应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽及其应用。

背景技术

缺血性脑卒中是世界上最主要的致残、致死疾病之一，严重危害人类健康，其治疗药物的研制是药物化学最重要的课题之一。目前，脑卒中药物的研究主要有：钙通道拮抗剂、谷氨酸释放抑制剂、GABA受体激动剂、nNOS抑制剂、自由基清除剂、MMP-9抑制剂、NMDAR拮抗剂等，但治疗效果均不理想。许多在脑卒中动物模型中有效的神经保护剂在人体临床试验中未能取得预期的疗效或者因副作用太大而不得不终止临床试验。

缺血性脑卒中发生时，兴奋性氨基酸(EAA)的毒性作用在缺血脑卒中的发病机制中起重要作用。研究表明NMDAR-PSD95-nNOS信号通路介导脑卒中兴奋性谷氨酸的毒性作用。但由于NMDAR和nNOS介导很多重要的生理功能，抑制其活性会产生较多的毒副作用。例如临床研究表明，NMDAR拮抗剂因其副作用不能开发成治疗药物。兴奋毒性刺激时，刺激信号通过NMDAR-PSD95-nNOS传给nNOS，nNOS和Capon偶联，Capon还可以和MKK3偶联，形成nNOS-Capon-MKK3三元复合物。nNOS可以激活MKK3，从而激活p38MAPK信号通路，导致神经细胞死亡。研究表明，抑制nNOS-Capon的偶联具有神经保护作用。

nNOS PDZ结构域含有127个氨基酸残基，Capon是nNOS的天然配体。Capon通过其羧基末端四肽EIAV结合到nNOS PDZ结构域的αB螺旋和βB折叠之间，该结合位点是一条浅而长的沟槽，含保守序列GLGF(Gly21、Leu 22、Gly23、Phe24)组成的结合口袋。根据Capon的羧基末端EIAV设计的多肽Che-A/G-D/E-X-V和Che-A/G-D/E(OMe)-X-V通过竞争性地与GLGF区域口袋结合，起到nNOS-Capon解偶联作用。用荧光偏振法筛选和测试本发明中多肽的nNOS-Capon解偶联活性，筛选出活性好的化合物再通过酯化优化其结构，提高其成药性，进而用MACO动物模型测试化合物的神经保护活性。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽及其应用，可作为神经保护剂用于缺血性脑卒中的治疗。

技术方案：一种具有nNOS-Capon解偶联活性的多肽，氨基酸序列结构通式为Che-Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Val，其中Che＝N-Cyclohexylethyl，Xaa¹＝Ala或Gly，Xaa²＝Glu、Glu(OMe)、Asp或Asp(OMe)，Xaa³＝修饰的或天然氨基酸。

结构式为以下任意一种化合物：

Che-Ala-Glu-Ala-Val(Che-AEAV)、Che-Ala-Glu(OMe)-Ala-Val(Che-AE(OMe)AV)、

Che-Ala-Glu-Trp-Val(Che-AEWV)、Che-Ala-Glu(OMe)-Trp-Val(Che-AE(OMe)WV)、

Che-Ala-Asp-Trp-Val(Che-ADWV)、Che-Ala-Asp(OMe)-Trp-Val(Che-AD(OMe)WV)、

Che-Ala-Glu-Phe-Val(Che-AEFV)、Che-Ala-Glu(OMe)-Phe-Val(Che-AE(OMe)FV)、

Che-Ala-Asp-Ala-Val(Che-ADAV)、Che-Ala-Asp(OMe)-Ala-Val(Che-AD(OMe)AV)、

Che-Ala-Glu-Ile-Val(Che-AEIV)、Che-Ala-Glu(OMe)-Ile-Val(Che-AE(OMe)IV)、

Che-Ala-Asp-Ile-Val(Che-ADIV)、Che-Ala-Asp(OMe)-Ile-Val(Che-AD(OMe)IV)、

Che-Gly-Asp-Ala-Val(Che-GDAV)、Che-Gly-Asp(OMe)-Ala-Val(Che-GD(OMe)AV)、

Che-Gly-Asp-Pro-Val(Che-GDPV)、Che-Gly-Asp(OMe)-Pro-Val(Che-GD(OMe)PV)、

Che-Gly-Asp-Leu-Val(Che-GDLV)、Che-Gly-Asp(OMe)-Leu-Val(Che-GD(OMe)LV)、

Che-Gly-Asp-Phe-Val(Che-GDFV)、Che-Gly-Asp(OMe)-Phe-Val(Che-GD(OMe)FV)、

Che-Gly-Asp-Trp-Val(Che-GDWV)或Che-Gly-Asp(OMe)-Trp-Val(Che-GD(OMe)WV)。

优选的nNOS-Capon解偶联多肽结构如下：

本发明所述氨基酸采用氨基酸片段修饰法结合传统固相合成法，合成路线如图1、2所示。

上述多肽或其药学上可以接受的盐在制备神经保护药物中的应用。

上述多肽或其药学上可以接受的盐在制备卒中、焦虑或抑郁药物中的应用。

一种神经保护药物，有效成分为上述多肽或其药学上可以接受的盐。

有益效果：本发明提供的多肽在大鼠脑缺血再灌注模型(MACO)有明显神经保护作用，MACO模型脑切片TTC染色模型组脑梗面积24.6％，Che-AD(OMe)AV脑梗面积4.5％，阳性对照组依达拉奉脑梗面积13.5％。

附图说明

图1烷基化氨基酸的合成图；

图2烷基化四肽的合成图；

图3：GST-nNOS_1-133 western blot鉴定图。表达纯化浓缩的蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后考马斯亮蓝染色液染色鉴定GST-nNOS_1-133。

图4：5-FAM-KV-14与GST-nNOS_1-133结合的ITC示意图。利用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)拟合荧光分子探针5-FAM-KV-14与GST-nNOS_1-133蛋白的结合过程，验证其结合为典型的单位点结合模型，符合荧光偏振方法的筛选要求。

图5：最适荧光分子探针浓度示意图。随着5-FAM-KV-14浓度的增加，FP值呈降低趋势。5-FAM-KV-14为50nM时，此时检测到的FP值为57.25mP，且随探针浓度增加，FP值趋于稳定，故最终选用的5-FAM-KV-14浓度为50nM。

图6：最适GST-nNOS_1-133蛋白浓度的确定示意图。随着GST-nNOS_1-133蛋白浓度的增加，FP值呈增强趋势。最大FP值的0.8倍所对应的浓度即为蛋白最适浓度。从图中可以看出在蛋白浓度为1μM时，FP值变化的区间最为显著，此时蛋白用量也较为节约。故最终选用的GST-nNOS_1-133蛋白浓度为1μM。

图7：最适孵育时间的确定示意图。GST-nNOS_1-133蛋白在孵育1h、2h、4h、8h、24h后，FP值变化基本稳定，故最终选用的GST-nNOS_1-133蛋白孵育时间为1h。

图8：DMSO对FP值的影响示意图。DMSO的含量最高达到6％，对FP值基本没有影响。

图9：FP法活性初筛示意图。

图10：FP法筛选Che-ADWV,Che-ADAV,Che-ADIV,Che-GDLV,Che-GDWV 5个多肽的nNOS-Capon解耦连活性示意图。

图11：Che-AD(OMe)AV给药大鼠MACO模型后脑切片TTC染色图。

图12：Che-AD(OMe)AV给药大鼠MACO模型后脑切片梗死面积柱状图。

具体实施方式

N-Ns-Ala-OMe的合成

向250mL的烧瓶中加入100mL二氯甲烷，再依次加入丙氨酸甲酯(6g,58.2mmol)，三乙胺(16mL,116.4mmol)，室温下搅拌20min，冰浴条件下，加入邻硝基苯磺酰氯(12.9g,58.2mmol)，搅拌15min，撤去冰浴，室温搅拌2h。反应结束后，旋除溶剂，加入乙酸乙酯溶解，5％Na₂CO₃洗2次，饱和食盐水洗2次，收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得黄色油状液，硅胶柱层析(PE:EA＝3:1)得黄棕色固体N-Ns-Ala-OMe 15g，产率89％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：8.73(s,1H),8.04–7.92(m,2H),7.89–7.82(m,2H),4.06(q,J＝7.1Hz,1H),3.46(s,3H),1.28(d,J＝7.2Hz,3H).MS(ESI)calcd for C₁₀H₁₂N₂O₆S[M+Na]⁺:311.0；found:m/z 311.0.

N-Che-N-Ns-Ala-OMe的合成

向500mL双颈瓶中加入200mL重蒸四氢呋喃，再依次加入N-Ns-Ala-OMe(15g,52mmol)，三苯基膦(20.46g,78mmol)，环己基乙醇(7.25mL,52mmol)，Ar保护，冰浴条件下搅拌，边搅边滴加偶氮二甲酸二异丙酯，滴加完毕后，升至室温，搅拌过夜。反应结束后，将反应液浓缩，加乙酸乙酯溶解，水洗3次，收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得黄色油状液，硅胶柱层析(PE:EA＝4:1)得淡黄色固体N-Che-N-Ns-Ala-OMe 15.1g，产率73％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.16–7.97(m,1H),7.72(m,2H),7.65–7.55(m,1H),4.75(q,J＝7.3Hz,1H),3.59(s,3H),3.53–3.04(m,2H),1.68–0.82(m,16H).

N-Che-N-Ns-Ala-OH的合成

取N-Che-N-Ns-Ala-OMe(15g,37.6mmol)于250mL烧瓶中，加入50mL甲醇溶解，再加入1N氢氧化钠溶液(45mL,45mmol)，室温条件下，搅拌过夜。反应结束后，加入水溶解，2N盐酸调节至1-2，乙酸乙酯萃取3次，收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩后得黄色油状液。硅胶柱层析(CH₂Cl₂:MeOH＝20:1)得橙黄色油状液Ac-Ala-(CSNH)-Val-OH 13.5g，两步产率93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.75(s,1H),8.18–7.98(m,1H),7.71(m,2H),7.64(m,1H),4.78(q,J＝7.3Hz,1H),3.58–3.00(m,2H),1.99–0.79(m,16H).MS(ESI)calcd forC₁₇H₂₄N₂O₆S[M+Na]⁺:407.1；found:m/z 407.1.

N-Che-N-Boc-Ala-OH的合成

向干燥的250mL烧瓶中依次加入50mL重蒸N,N-二甲基甲酰胺，N-Che-N-Ns-Ala-OH(13g，34mmol),苯硫酚钠(9g，68mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，用油泵将反应液浓缩至小体积，加水溶解，用2N盐酸调节PH至4，乙醚萃取2次，收集水层，用1N氢氧化钠溶液调节至5-6，冻干得淡黄色固体N-Che-Ala-OH粗品。MS(ESI)calcd for C₁₁H₂₁NO₂[M+Na]⁺:222.1；found:m/z 222.1.

向上述固体中加入三乙胺(19mL,136mmol)，(Boc)₂O(22.3g，102mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，旋干溶剂，加水溶解，用10％柠檬酸调节至3-4，乙酸乙酯萃取三次，收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得黄色油状液，硅胶柱层析(CH₂Cl₂:MeOH＝20:1)得透明油状液N-Che-N-Boc-Ala-OH 5.1g，两步产率50％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:11.31(s,1H),4.42-3.99(m,1H),3.36-3.06(m,2H),1.81–0.84(m,26H).MS(ESI)calcd forC₁₂H₂₉NO₄[M+Na]⁺:322.2；found:m/z 322.2.

接下来按照图2的流程图采用常规固相合成法合成本发明中叙述的四肽。

实施例1 N-Cyclohexylethyl-Ala-Glu-Ala-Val(Che-AEAV)

将干燥的2-氯三甲基氯树脂(负载率1.056mmol)活化之后，以Fmoc-Val-OH为起始原料，多次重复Fmoc脱除以及氨基酸缩合反应，具体合成路线如图2所示，得到Che-AEAV155.5mg，产率为15.61％。HPLC:t_R＝13.45min.MS(ESI)calcd for C₂₄H₄₂N₄O₇[M-H]^-:497.3；found:m/z 497.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.30(s,2H),8.64(d,J＝8.3Hz,1H),8.07(d,J＝7.1Hz,1H),7.90(d,J＝8.6Hz,1H),4.34(t,J＝7.0Hz,2H),4.10(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),3.89(s,1H),2.78(s,3H),2.24(t,J＝8.0Hz,2H),2.01–1.89(m,1H),1.87(d,J＝5.2Hz,1H),1.83–1.68(m,1H),1.61–1.47(m,5H),1.42(t,J＝7.6Hz,2H),1.33(d,J＝6.8Hz,3H),1.18(d,J＝7.0Hz,6H),0.84(d,J＝6.8Hz,9H).

实施例2 N-Cyclohexylethyl-Ala-Glu-Trp-Val(Che-AEWV)

按照例1中的合成方法得到Che-AEWV 76.3mg，产率为12.45％。HPLC:t_R＝14.15min.MS(ESI)calcd for C₃₂H₄₇N₅O₇[M-H]^-:612.3；found:m/z 612.4.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ13.04–11.60(m,2H),10.75(s,1H),8.58(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(t,J＝8.5Hz,2H),7.82–6.38(m,5H),4.65(d,J＝4.9Hz,1H),4.33(d,J＝5.4Hz,1H),4.21–4.06(m,1H),3.81(d,J＝7.0Hz,1H),3.09(d,J＝10.0Hz,2H),2.97–2.63(m,3H),2.15–2.05(m,3H),2.06(s,1H),1.87(s,1H),1.73(d,J＝7.9Hz,1H),1.60(d,J＝9.5Hz,5H),1.55–1.32(m,3H),1.23–1.12(m,4H),1.13(s,3H),0.87–0.71(m,6H).

实施例3 N-Cyclohexylethyl-Ala-Asp-Trp-Val(Che-ADWV)

按照例1中的合成方法得到Che-ADWV 38.4mg，产率为6.41％。HPLC:t_R＝14.35min.MS(ESI)calcd for C₃₁H₄₅N₅O₇[M-H]^-:598.3；found:m/z 598.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.75(s,2H),8.66(s,1H),7.96(s,2H),7.55(d,J＝7.8Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,1H),7.13–6.77(m,4H),4.58(s,2H),4.12(s,1H),3.68(s,1H),3.08(s,2H),2.93(s,2H),2.67–2.35(m,3H),2.01(s,1H),1.58(s,5H),1.38(d,J＝7.5Hz,3H),1.23(d,J＝6.8Hz,5H),1.12–0.99(m,3H),0.84(d,J＝4.1Hz,6H).

实施例4 N-Cyclohexylethyl-Ala-Glu-Phe-Val(Che-AEFV)

按照例1中的合成方法得到Che-AEFV 97.8mg，产率为17.03％。HPLC:t_R＝10.17min.MS(ESI)calcd for C₃₀H₄₆N₄O₇[M-H]^-:573.3；found:m/z 573.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.56(d,J＝8.0Hz,1H),8.12–8.00(m,2H),7.26–7.07(m,5H),4.62(s,1H),4.29(d,J＝5.2Hz,1H),4.12(d,J＝8.4Hz,1H),3.80(d,J＝7.2Hz,1H),2.99–2.90(m,2H),2.85–2.65(m,3H),2.16(t,J＝8.0Hz,2H),2.03–1.89(m,2H),1.83(s,1H),1.77–1.44(m,7H),1.42–1.17(m,6H),1.13(s,3H),0.89–0.80(m,6H).

实施例5 N-Cyclohexylethyl-Ala-Asp-Ala-Val(Che-ADAV)

按照例1中的合成方法得到Che-ADAV 33.2mg，产率为6.86％。HPLC:t_R＝11.18min.MS(ESI)calcd for C₂₃H₄₀N₄O₇[M-H]^-:483.3；found:m/z 483.2.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.47(s,2H),9.09–8.73(m,1H),7.99(d,J＝6.9Hz,1H),7.90(s,1H),4.63(s,1H),4.44–4.27(m,1H),4.22–4.03(m,1H),3.81(s,1H),2.80(s,2H),2.73–2.50(m,2H),2.52(d,J＝9.6Hz,1H),2.10–1.94(m,1H),1.63–1.42(m,5H),1.44(d,J＝6.7Hz,2H),1.36(d,J＝6.8Hz,3H),1.19(d,J＝7.0Hz,6H),0.87(s,3H),0.85(s,6H).

实施例6 N-Cyclohexylethyl-Ala-Glu-Ile-Val(Che-AEIV)

按照例1中的合成方法得到Che-AEIV 23.5mg，产率为4.35％。HPLC:t_R＝12.95min.MS(ESI)calcd for C₂₇H₄₈N₄O₇[M-H]^-:539.3；found:m/z 539.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.54(s,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.85(s,1H),4.40(s,1H),4.33–4.21(m,1H),4.14–4.05(m,1H),3.73(s,1H),2.75–2.27(m,3H),2.20(d,J＝7.5Hz,3H),2.13–1.96(m,2H),1.88(s,1H),1.74(s,2H),1.63–1.51(m,5H),1.50–1.36(m,4H),1.35–1.10(m,7H),0.87(d,J＝2.7Hz,3H),0.83(d,J＝7.3Hz,6H),0.78(d,J＝7.4Hz,3H).

实施例7 N-Cyclohexylethyl-Ala-Asp-Ile-Val(Che-ADIV)

按照例1中的合成方法得到Che-ADIV 67.5mg，产率为12.82％。HPLC:t_R＝10.90min.MS(ESI)calcd for C₂₆H₄₆N₄O₇[M+H]⁺:527.3；found:m/z 527.4.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,1H),7.71(d,J＝9.3Hz,1H),4.65(d,J＝4.8Hz,1H),4.33–4.21(m,1H),4.14–4.02(m,1H),3.71(d,J＝6.7Hz,1H),2.73–2.61(m,3H),2.66(d,J＝4.5Hz,1H),2.52–2.37(m,2H),2.03–1.87(m,1H),1.63-1.50(m,6H),1.48–1.35(m,3H),1.31(d,J＝6.7Hz,4H),1.17–0.98(m,3H),0.91(s,2H),0.87(d,J＝2.5Hz,3H),0.84(d,J＝4.9Hz,6H),0.77(d,J＝7.4Hz,3H).

实施例8 N-Cyclohexylethyl-Gly-Asp-Ala-Val(Che-GDAV)

按照例1中的合成方法得到Che-GDAV 248.6mg，产率为26.42％。HPLC:t_R＝16.50min.MS(ESI)calcd for C₂₂H₃₈N₄O₇[M-H]^-:469.3；found:m/z 469.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.59(s,2H),8.73–8.61(m,1H),8.10(d,J＝7.0Hz,1H),7.88–7.72(m,1H),4.69–4.53(m,1H),4.43–4.26(m,1H),4.15–4.04(m,1H),3.70(s,2H),2.98–2.81(m,2H),2.69–2.67(m,1H),2.61–2.50(m,2H),2.04–1.89(m,1H),1.63–1.41(m,5H),1.45–1.23(m,2H),1.19(t,J＝6.3Hz,4H),1.00–0.93(m,3H),0.95(s,2H),0.85(s,6H).

实施例9 N-Cyclohexylethyl-Gly-Asp-Pro-Val(Che-GDPV)

按照例1中的合成方法得到Che-GDPV 176.3mg，产率为17.78％。HPLC:t_R＝14.17min.MS(ESI)calcd for C₂₄H₄₀N₄O₇[M-H]^-:495.3；found:m/z 495.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.51(s,2H),8.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(d,J＝8.5Hz,1H),4.87(d,J＝5.4Hz,1H),4.40(d,J＝6.3Hz,1H),4.12–4.03(m,1H),3.69(s,2H),3.65–3.54(m,2H),2.90(s,2H),2.72–2.66(m,1H),2.50(s,2H),2.47–2.38(m,2H),2.04–1.97(m,1H),1.89(s,2H),1.54–1.31(m,7H),1.30–1.08(m,4H),0.92(d,J＝7.0Hz,2H),0.86(d,J＝6.8Hz,6H).

实施例10 N-Cyclohexylethyl-Gly-Asp-Leu-Val(Che-GDLV)

按照例1中的合成方法得到Che-GDLV 318mg，产率为31.06％。HPLC:t_R＝13.90min.MS(ESI)calcd for C₂₅H₄₄N₄O₇[M-H]^-:511.3；found:m/z 511.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.75(d,J＝7.9Hz,1H),8.09(d,J＝8.1Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),4.64–4.58(m,1H),4.34–4.27(m,1H),4.13–4.00(m,1H),3.77–3.56(m,2H),2.90(s,2H),2.75–2.58(m,1H),2.50(d,J＝9.5Hz,2H),2.02–1.87(m,1H),1.64(s,2H),1.61(s,4H),1.46–1.38(m,4H),1.28–1.04(m,4H),0.89(d,J＝9.2Hz,2H),0.87–0.78(m,12H).

实施例11 N-Cyclohexylethyl-Gly-Asp-Phe-Val(Che-GDFV)

按照例1中的合成方法得到Che-GDFV 151.5mg，产率为13.74％。HPLC:t_R＝14.15min.MS(ESI)calcd for C₂₈H₄₂N₄O₇[M+H]⁺:547.3；found:m/z 547.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.62(s,2H),8.69–8.43(m,1H),8.22–7.93(m,2H),7.22–6.89(m,5H),4.72–4.41(m,2H),4.13(dd,J＝8.2,6.0Hz,1H),3.62–3.54(m,2H),3.43(s,2H),3.08–2.95(m,1H),2.67–2.59(m,2H),2.50–2.36(m,2H),2.05–1.78(m,1H),1.53–1.44(m,7H),1.31–1.00(m,4H),0.94–0.74(m,8H).

实施例12 N-Cyclohexylethyl-Gly-Asp-Trp-Val(Che-GDWV)

按照例1中的合成方法得到Che-GDWV 189.1mg，产率为16.16％。HPLC:t_R＝14.10min.MS(ESI)calcd for C₂₅H₄₄N₄O₇[M+H]⁺:586.3；found:m/z 586.3.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.78(d,J＝8.8Hz,1H),8.67–8.57(m,1H),8.16–7.94(m,2H),7.57(d,J＝6.4Hz,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,1H),7.13–6.91(m,3H),4.69–4.52(m,2H),4.12(d,J＝8.8Hz,1H),3.70–3.53(m,2H),3.12–3.01(m,2H),2.98–2.80(m,3H),2.76–2.50(m,2H),2.04–1.66(m,1H),1.56–1.44(m,6H),1.42(s,1H),1.27–1.07(m,4H),0.87(d,J＝6.4Hz,8H).

实施例13 N-Cyclohexylethyl-Ala-Asp(OMe)-Ala-Val(Che-AD(OMe)AV)

按照例1中的合成方法得到Che-AD(OMe)AV 88mg，产率为16.7％。HPLC:t_R＝20min.¹HNMR(400MHz,)δ8.88(d,J＝8.0Hz,1H),8.10(d,J＝8.9Hz,1H),7.89(d,J＝9.6Hz,1H),4.67-4.62(m,1H),4.34-4.27(m,1H),4.10-4.06(m,1H),3.82-3.77(m,1H),3.55(s,3H),2.87–2.49(m,5H),2.08–1.92(m,1H),1.62-1.55(m,5H),1.44-1.38(m,2H),1.32(d,J＝6.9Hz,3H),1.25–1.04(m,9H),0.82(d,J＝6.7Hz,6H).MS(ESI,m/z):499.3[M+H]⁺

实施例14荧光偏振法测试nNOS-Capon方法的建立

1.GST-nNOS_1-133蛋白的诱导表达及纯化

将含有pGEX4T-1-GST-nNOS_1-133的E.Coli BL21(DE3)菌液接种到5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃，180r/min转速在摇床上培养过夜。次日，转移至300mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养2.5h，加入乳糖诱导，使之终浓度为2.5g/mL，继续培养6h。4℃，3000g，离心30min，收集沉淀，重悬于冷的(浓度:10mM，7.4)中，加入溶菌酶，振荡混匀，置于-20℃冰箱过夜。次日，将菌液置于摇床，于37℃，180r/min转速下复融，随后加入DNA酶消化基因组DNA。4℃，15000rpm离心15min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤。将收集后的上清液加至GST亲和层析柱，采用还原型谷胱甘肽(0.154g/50mL PBS)洗脱，纯化得到GST-nNOS_1-133蛋白，于30KDa超滤管中进行超滤浓缩，BCA试剂盒测定蛋白浓度。

2.考马斯亮蓝染色法鉴定GST-nNOS_1-133蛋白

将上述纯化浓缩的蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后加入考马斯亮蓝染色液染色过夜，次日采用脱色液洗脱，白光拍摄，结果如图3所示，表达的GST-nNOS_1-133正确无误，纯度高。

利用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)拟合荧光分子探针5-FAM-KV-14与GST-nNOS_1-133蛋白的结合过程，验证其结合为典型的单位点结合模型，符合荧光偏振方法的筛选要求。如图4所示，结合达到饱和状态时探针与蛋白的浓度比约为10:1，这为后续荧光分子探针和蛋白的浓度选择提供了参考。

3.最适荧光分子探针浓度的确定

测定不同浓度的荧光分子探针5-FAM-KV-14对FP值的影响。在96孔板中分别按照计算体积加入5-FAM-KV-14标准液(500μM)、1xHepes，使每孔中荧光分子探针5-FAM-KV-14的终浓度为以上描述浓度，每孔总体积控制在100μL，每个浓度均设立3个平行孔，在37℃条件下用多功能酶标仪测定FP值，通过统计软件Graphpad Prism 7作图。

如图5所示，在仅含游离的荧光分子探针孔中，随着5-FAM-KV-14浓度的增加，FP值呈降低趋势。5-FAM-KV-14为50nM时，此时检测到的FP值为57.25mP，且随探针浓度增加，FP值趋于稳定。因此，最终选用的5-FAM-KV-14浓度为50nM。

4.最适GST-nNOS_1-133蛋白浓度的确定

在已确定最适荧光分子探针浓度(50nM)的情况下，测定不同浓度的GST-nNOS_1-133蛋白对FP值的影响。在96孔板中分别按照计算体积加入5-FAM-KV-14标准液(500μM)、1xHepes，使5-FAM-KV-14在孔中的终浓度为50nM。随后加入计算体积的GST-nNOS_1-133蛋白原液(93.02μM)使其在每孔中的终浓度分别为以上描述浓度，每孔总体积控制在125μL，每个浓度均设立3个平行孔，在37℃条件下用多功能酶标仪测定FP值，通过统计软件GraphpadPrism 7作图。

如图6所示，随着GST-nNOS_1-133蛋白浓度的增加，FP值呈增强趋势。最大FP值的0.8倍所对应的浓度即为蛋白最适浓度。从图中可以看出在蛋白浓度为1μM时，FP值变化的区间最为显著，此时蛋白用量也较为节约。因此，最终选用的GST-nNOS_1-133蛋白浓度为1μM。

5.最适孵育时间的确定

选择5-FAM-KV-14与GST-nNOS_1-133蛋白的最适孵育时间，可以使检测的FP值更强也更为稳定，有助于降低环境因素导致的误差，提高筛选方法的精确性。

在96孔板中加入5-FAM-KV-14(终浓度:50nM)、不同浓度的GST-nNOS_1-133蛋白、1xHepes，每孔总体积控制在125μL，37℃下分别孵育1h、2h、4h、8h、24h，不同反应时间均设三个平行孔。37℃条件下在孵育不同时间后用多功能酶标仪分别测定FP值，通过统计软件Graphpad Prism 7作图。

如图7所示，GST-nNOS_1-133蛋白在孵育1h、2h、4h、8h、24h后，FP值变化基本稳定，因此，最终选用的GST-nNOS_1-133蛋白孵育时间为1h。

6.DMSO对FP值的影响

由于某些化合物溶解性不好，需要加少量的DMSO，因此需要测定一下不同含量的DMSO对FP值得影响。

在96孔板中加入5-FAM-KV-14(终浓度:50nM)、GST-nNOS_1-133蛋白(终浓度:1μM)、1xHepes以及不同体积的DMSO，使DMSO含量分别占总体积的0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％,每孔总体积控制在125μL。37℃条件下在孵育不同时间后用多功能酶标仪分别测定FP值，通过统计软件Graphpad Prism 7作图。

如图8所示，DMSO的含量最高达到6％，对FP值基本没有影响，达到6％以上，会使FP值偏低。因此，选定DMSO的含量最高只能达到6％。

7.采用Z因子和信噪比评价方法的可靠性

在浓度、孵育时间等条件确定之后，在96孔板上设定3个平行孔，分别测定含有或不含GST-nNOS_1-133蛋白(1μM)与5-FAM-KV-14(50nM)反应1h的荧光偏振值(FP，mP)。根据如下公式计算该荧光偏振体系的Z’值和信噪比(S/N)，评价该体系的可靠性。

Z’＝1–(3σ_binding+3σ_free)/|μ_binding-μ_free|；S/N＝(μ_binding-μ_free)/σ_free(其中σ为标准差，μ为均值，binding：5-FAM-KV-14+GST-nNOS_1-133的FP值，free：游离5-FAM-KV-14的FP值)

最终得到本方法的Z因子平均值为0.96，信噪比平均值140.9。这提示本实验建立的荧光偏振筛选方法具有灵敏、可靠等优点，可较好的用于nNOS-CAPON通路小分子抑制剂的筛选。

8.化合物的筛选

在96孔板中加入计算体积的荧光探针分子5-FAM-KV-14溶液(终浓度:50nM)、GST-nNOS_1-133蛋白溶液(终浓度:1μM)和小分子抑制剂(终浓度:1mM)，每个浓度设置3个平行，总的竞争抑制体积控制在125μL，混匀后37℃下孵育1h后测定FP值，初筛结果如图9所示。

进一步精确测试结果如图10所示，通过竞争性荧光偏振实验对合成的目标化合物进行筛选，得到具有结合活性的化合物5个，可作为新型的四肽分子探针，用于进一步的蛋白结合研究。

实施例15短暂性脑缺血模型

实验方案经南京医科大学动物护理与使用委员会批准。我们尽一切努力减少使用的老鼠数量及其痛苦。在本研究中，我们使用购自南通大学动物中心的Sprague-Dawley大鼠(9-10周龄，250-270g)。维持室内温度22±2℃和光照(12小时明暗周期)，随意获取食物和水。通过计算机将动物随机分配到实验组。实验者根据分配前的随机化表标记所有动物。由不知道动物归属实验组的研究人员进行实验。

实验方案参照Zhou L等人的短暂性脑缺血模型。简而言之，水合氯醛(350mg/kg,ip)麻醉SD大鼠，通过颈外动脉残端将4/0外科尼龙单丝带圆形尖端引入左颈内动脉，在颈动脉分叉处前进20-21mm，直到感觉到轻微的阻力。此时，腔内细丝阻塞了大脑中动脉、颈内动脉、大脑前动脉和大脑后动脉的所有血源。在整个过程中，体温保持在37±0.5℃。将栓线留在原位120min，然后取出再灌注。取出栓线后，立即通过尾静脉给药。在假手术动物中，闭塞细丝仅插入颈动脉分叉处上方7mm处。

评估结果

在MACO后24小时进行梗塞体积测量。快速取出大脑并在-20℃下冷冻5min。制成1-2毫米冠状切片，切片浸入2％TTC，37℃4h。染色结果如图11、图12所示，梗塞体积表示为梗塞半球中冠状切面的百分比面积。模型组24.6％，Che-AD(OMe)AV 4.5％，依达拉奉组13.5％。