阅读说明：本技术 一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器及其制备方法和应用 (AChE and CHO double-enzyme mediated magnetic relaxation switch sensor and preparation method and application thereof ) 是由 吴龙 周敏 陈翊平 吴正奇 陈小强 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器及其制备方法和应用,用于神经毒性农药残留的快速灵敏检测。氯化乙酰胆碱(ACh)可被乙酰胆碱酯酶(AChE)催化生成胆碱,再被胆碱氧化酶(CHO)水解成甜菜碱和过氧化氢(H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>)；啶虫脒会使AChE失活,从而导致产生的H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>减少；其中ACh、AChE和CHO为反应底物,引入顺磁离子Fe<Sup>2+</Sup>；H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>会引起Fe<Sup>2+</Sup>/Fe<Sup>3+</Sup>的转化,从而影响周围水分子中氢质子的横向弛豫时间(T<Sub>2</Sub>),并作为啶虫脒检测的信号读出。检出限为2.66ng·mL<Sup>-1</Sup>(S/N＝3,n＝3)。该方法无需洗涤可一步检测啶虫脒,是复杂样品中农药残留检测的有效分析工具。(The invention discloses an AChE and CHO double-enzyme mediated magnetic relaxation switch sensor, a preparation method and application thereof, which are used for quickly and sensitively detecting neurotoxicity pesticide residues. Acetylcholine chloride (ACh) is catalyzed by acetylcholinesterase (AChE) to produce choline, which is then hydrolyzed by choline oxidase (CHO) to betaine and hydrogen peroxide (H) 2 O 2 ) (ii) a Acetamiprid inactivates AChE, resulting in the production of H 2 O 2 Reduction; wherein ACh, AChE and CHO are used as reaction substrates, and paramagnetic ion Fe is introduced 2+ ；H 2 O 2 Will cause Fe 2+ /Fe 3+ Thereby influencing the transverse relaxation time (T) of hydrogen protons in the surrounding water molecules 2 ) And read out as the signal for acetamiprid detection. The detection limit is 2.66 ng/mL ‑1 (S/N＝3，n3). The method can detect the acetamiprid in one step without washing, and is an effective analysis tool for detecting pesticide residues in complex samples.)

一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器及其制备方法和应用。

背景技术

自农药发明以来，有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等农药，迅速应用于各个领域。随着新烟碱类化合物的出现，农药的开发进入了一个新的阶段。由于其独特的作用机制，与传统农药没有交叉抗药性，新烟碱类农药得到了广泛使用。然而，人们发现新烟碱类农药对生物体构成了巨大的威胁，具有诱变性、致癌性和致畸性等潜在风险。因此，需要对这些农药进行特异和灵敏的检测，以启动快速措施。目前，用于检测农药残留的分析方法主要有三种，包括液相色谱、气相色谱和质谱/液相色谱，酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧向流动免疫分析(LFIA)等免疫分析方法和分光光度法。现有的农药残留检测方法要么复杂、耗时，要么灵敏度不高，不能满足快速应用中低水平检测的要求，尤其是农药残留的现场分析。因此，建立快速、灵敏的农药残留检测方法具有重要意义。

由于磁弛豫传感具有一步检测、无需多次洗涤和抗干扰能力强等优点，因此在食品样品分析科学中有着广阔的应用前景。磁性传感器的信号读出主要来自磁性纳米颗粒(MNPs)和顺磁离子。前一种信号取决于MNPs的状态变化(分散/聚集)，后一种信号来自未配对的电子。考虑到MNPs的不稳定性，顺磁离子在水溶液中表现稳定且呈均一状态，可以提供Fe³⁺和Fe²⁺等顺磁离子的横向弛豫时间(T₂)作为开发无MNPs的磁分析的替代方法。在电子结构上，Fe³⁺为半填充d轨道，电子自旋弛豫(ESR)约为Fe²⁺的30倍。结果表明，Fe³⁺/Fe²⁺的水中氢质子中的T₂值不同，在相同浓度下，Fe²⁺的T₂值大于Fe³⁺的T₂值，说明Fe³⁺对周围水质子的影响(ΔT₂)大于Fe²⁺对周围水质子的影响。因此，利用Fe²⁺/Fe³⁺相互转换来构建磁敏传感器是很有吸引力的。

鉴于Fe²⁺和Fe³⁺之间的转换可以在氧化还原反应中很容易实现，而H₂O₂与所有酶相关，是一种流行的生化标记。另一方面，新烟碱类杀虫剂，如啶虫脒，可通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性来损害昆虫的神经系统，这也称为酶抑制。在酶反应中，在氯化乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(CHO)的存在下，可产生H₂O₂，可引起Fe²⁺到Fe³⁺的转化，呈现T₂信号的变化。

发明内容

为了克服磁性纳米颗粒(MNPs)读出的信号不稳定的问题，本发明提供一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，用顺磁离子Fe³⁺和Fe²⁺的横向弛豫时间(T₂)作为开发无MNPs的磁分析的替代方法，更加稳定可靠。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，

①预处理：AChE用Tris-HCl缓冲液溶解稀释，CHO用PBS缓冲液溶解稀释，ACh和神经毒性农药溶液用水配制，在测试之前，AChE和CHO应先活化；

②标准曲线的绘制：将一系列不同浓度的神经毒性农药溶液，先与适量的预处理过的AChE孵育一段时间，然后依次加入过量的预处理过的ACh和CHO，继续孵育一段时间，再与Fe²⁺混合一段时间，利用低场核磁共振波谱仪收集T₂值，以样品浓度的对数为横坐标，以横向弛豫时间为纵坐标，建立标准曲线，计算得到标准曲线的线性回归方程；

③待测样品的测定：将待测样品先与适量的预处理过的AChE孵育一段时间，然后依次加入过量的预处理过的ACh和CHO，继续孵育一段时间，再与Fe²⁺混合一段时间，利用低场核磁共振波谱仪收集T₂值，并将其代入线性回归方程中，计算得到待测样品的神经毒性农药浓度。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，步骤②和步骤③中神经毒性农药溶液先与适量的预处理过的AChE在37℃孵育30-60min，然后依次加入过量的预处理过的ACh和CHO，继续孵育20-40min，再与Fe²⁺混合0-20min。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，所述Fe²⁺、ACh、AChE和CHO的最佳浓度分别为5mM、5mM、500U·L^-1和2000U·L^-1。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM、pH＝7.2-8.5，PBS缓冲液浓度为10mM、PH＝7-8，ACh和啶虫脒溶液用超纯水配制。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，在测试之前，AChE和CHO应在室温下活化10分钟，并在7天内使用。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，所述Fe²⁺来自于FeSO₄。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，所述线性回归方程为：Y＝63.49X+139.17，R²＝0.98，X＝Lg[啶虫脒浓度(μg·mL^-1)，Y＝ΔT₂，LOD＝2.66ngmL^-1，S/N＝3,n＝3,RSD＝3.8％。

上述任一项所述的方法制备的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器用于检测神经毒性农药的残留。

上述的一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器用于检测吡虫啉、啶虫脒或氯噻啉的残留。

在本专利中，我们将神经毒性农药的酶抑制特性与酶反应体系相结合，构建了一种新型的磁性传感器。其中，采用乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(CHO)两种酶，ACh作为底物，与AChE和CHO一起同时引入到含有Fe²⁺的样品中。乙酰胆碱酯酶(AChE)催化底物ACh生成胆碱，然后胆碱被CHO氧化生成H₂O₂，实现Fe³⁺和Fe²⁺之间的转化。在神经毒性农药存在下，可使乙酰胆碱酯酶(AChE)失活，切断ACh的反应，从而减少胆碱和H₂O₂的产生。H₂O₂在氧化还原反应中可将Fe²⁺转化为Fe³⁺，导致ΔT₂增加，这与神经毒性农药的浓度有关。该“一步混合法”(乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱酯酶(CHO)和氯化乙酰胆碱(ACh))已成功应用于啶虫脒的检测。双酶介导的级联反应的引入有望提高检测的灵敏度，而Fe²⁺/Fe³⁺转换系统使磁性传感器能够保持稳定。

本发明制备的磁弛豫时间传感器的优势在于：

1.将农药残留快速检测方法-酶抑制法与低场核磁共振波谱仪结合，克服了传统光学信号易受样品基质干扰，灵敏度不够等缺点，可满足农药残留低浓度范围目标物的分析。

2.该磁传感器背景信号低，设备小巧，安装要求不高，检测成本低廉，抗外界干扰能力强，易于实现就地即时检测。

附图说明

图1是本发明检测具神经毒性农药的原理图。

图2是本传感器的表征图。

图3是实验条件的优化图。

图4是发明制备的传感器测定啶虫脒的定量检测拟合曲线以及和传统方法的对比。

图5是本传感器的实际样品测定图。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，神经毒性农药可为吡虫啉、啶虫脒、氯噻啉等，目前主要使用啶虫脒，此处以啶虫脒为例进行说明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

所用的试剂仪器设备来源：

1、0.5T低场核磁共振波谱仪：上海Numag公司；

2、氯化乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶：上海麦克林生化科技有限公司；

3、胆碱氧化酶、啶虫脒：上海源叶生物科技有限公司；

4、番茄、葡萄样品：当地超市。

5、预处理：AChE用pH＝8.0，浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液溶解稀释，CHO用PH＝7.4，浓度为10mM的PBS缓冲液溶解稀释。ACh和啶虫脒溶液用超纯水配制。在测试之前，AChE和CHO应在室温下活化10分钟，并在7天内使用。储藏时，所有溶液均储存在-4℃中以供进一步使用。

实施例1

磁免疫传感器的建立：

将50μL系列浓度为1000U·L^-1、500U·L^-1、450U·L^-1、300U·L^-1、200U·L^-1、150U·L^-1、100U·L^-1、50UL^-1和10UL^-1的AChE和50μL浓度为5mM的ACh、50μL浓度为2U/mL的CHO混合，并在37℃下孵育30分钟。上述反应液与50μL浓度为5mM的FeSO4混合，室温下反应30分钟，各取200μL混合溶液于1.5ml玻璃小瓶中测定T₂。研究磁信号强度并确定变化趋势。

如图3中C所示，随着AChE浓度的增大，ΔT₂值迅速增加。

为了进一步验证实验原理，我们使用过氧化氢试纸条测试了a：空白，b：0.25mMH₂O₂，c：ACh+AChE+CHO，d：ACh+AChE+CHO+啶虫脒这四组反应体系，如图2中B所示，使用试纸条，水溶液a没有颜色变化，而b的H₂O₂溶液表现出明显的蓝色变化。ACh、AchE和CHO孵育15min后，c的溶液也呈蓝色，证明反应体系能产生H₂O₂。此外，当将啶虫脒引入反应体系时，如图2中C所示，d的蓝色变得不那么明显，这表明啶虫脒抑制了酶的活性，并限制了H₂O₂的产生。此外，为了探讨双酶介导的Fe²⁺/Fe³⁺转化，用UV-Vis分光光度计对酶反应体系进行了表征。很明显，Fe²⁺溶液和反应体系(ACh+AChE+CHO)在340nm处无吸收峰，而Fe³⁺溶液在340nm处有明显的吸收峰。在上述反应体系中引入Fe²⁺后，(ACh+AChE+CHO+Fe²⁺)在340nm附近出现相似的吸收峰，表明反应体系能够介导Fe²⁺向Fe³⁺的转化。

实施例2

分别考察了ACh、AChE和Fe²⁺浓度对磁信号变化的影响，如图3所示。

1.Fe²⁺浓度的优化

将系列浓度为2mM、5mM和10mM的Fe²⁺与系列梯度为0.03mM、0.07mM、0.15mM、0.22mM、0.29mM、0.37mM、0.44mM、0.59mM和0.74mM的H₂O₂室温反应10min后测T₂。如图3中A所示，当Fe²⁺浓度较低(2mM)时，ΔT₂值随H₂O₂浓度的增加而迅速增加，H₂O₂为0.3mM时ΔT₂信号趋于稳定。Fe²⁺浓度为5mM时，随着H₂O₂浓度的升高，ΔT₂信号值基本呈线性增长，同时ΔT₂值也相对较高。Fe²⁺浓度提高到10mM时，ΔT₂虽然也基本呈线性增长，但是数值较小。由于反应体系中产生的H₂O₂可达1mM，因此我们选择最佳Fe²⁺为5mM。

2.ACh浓度的优化

将50μL系列浓度梯度为0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM的ACh分别与50μL浓度为1000U·L^-1的AChE和50μL浓度为2000U·L^-1的CHO混合，37℃孵育30min。然后，按体积比1：1加入最佳的Fe²⁺，室温孵育30min后测T₂。如图3中B所示，ΔT₂值随ACh浓度增大迅速增加，然后在ACh浓度为5mM时趋于平衡。

3.AChE浓度的优化及磁传感器测定乙酰胆碱酯酶

当加入浓度为5mM的ACh时，AChE系列浓度为1000U·L^-1、500U·L^-1、450U·L^-1、300U·L^-1、200U·L^-1、150U·L^-1、100U·L^-1、50U·L^-1和10U·L^-1，其他操作同上。如图3中C所示，ΔT₂值表现出相同的趋势，当AChE为500U·L^-1时，趋于平衡，说明500U·L^-1以上的AChE足以催化ACh。

如图3中D所示，乙酰胆碱酯酶(AChE)的浓度被转换成对数标度，可以看出ΔT₂信号对AChE浓度的响应呈线性关系。ΔT₂与AChE浓度在10～500U·L^-1范围内呈线性关系，满足回归方程Y＝104.29X-93.06，R²＝0.99，其中X为Lg[AChE(U·L^-1)]，Y为ΔT₂值。结果表明，磁化法在乙酰胆碱酯酶的测定中具有很大的潜力。

由于CHO参与了第二次反应，取决于第一次反应的产物，我们直接使其用量是AChE的4倍，即2000U·L^-1。

综上所述，Fe²⁺、ACh、AChE和CHO的最佳浓度分别为5mM、5mM、500U·L^-1和2000U·L^-1。

实施例3

一种AChE和CHO双酶介导的磁弛豫开关传感器的制备方法，包括如下步骤：

1、预处理

AChE用pH＝8.0，浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液溶解稀释，CHO用PH＝7.4，浓度为10mM的PBS缓冲液溶解稀释。ACh和啶虫脒溶液用超纯水配制。在测试之前，AChE和CHO应在室温下活化10分钟，并在7天内使用。储藏条件：所有溶液均储存在-4℃中以供进一步使用。

2、绘制乙酰胆碱酯酶AChE的标准曲线

将50μL系列浓度为1000U·L^-1、500U·L^-1、450U·L^-1、300U·L^-1、200U·L^-1、150U·L^-1、100U·L^-1、50U·L^-1和10U·L^-1的AChE分别和50μL浓度为5mM的ACh、50μL浓度为2U/mL的CHO混合，并在37℃下孵育30分钟。上述反应液与50μL浓度为5mM的FeSO₄混合，室温下反应30分钟，各取200μL混合溶液于1.5ml玻璃小瓶中利用低场核磁共振波谱仪测定T₂。以样品浓度的对数为横坐标，以横向弛豫时间为纵坐标，建立标准曲线。如图3中D所示，ΔT₂与AChE浓度的线性关系在10～500U·L^-1之间，满足Y＝104.29X-93.06，R²＝0.99，的回归方程，其中X＝Lg[AChE浓度(U·L^-1)]，Y＝ΔT₂值。结果表明，磁传感法测定AChE的潜力很大。我们在这里报告这一现象，但不会在这项工作中详细讨论。

3、待测样品的测定方法：

先将50μL待测的啶虫脒溶液与50μL浓度为500U·L^-1的AChE混合，37℃反应30分钟，然后加入50μL浓度为5mM的ACh、50μL浓度为2U/mL的CHO，继续37℃反应20分钟，引入50μL浓度为5mM的FeSO₄后室温反应20分钟，以0.5T低场强核磁共振波谱仪(LF-NMR)检测横向弛豫时间T₂，并代入线性回归方程中，计算得到待测样品的啶虫脒浓度。

实施例4

标准曲线的制作及磁传感器与其他传统方法的对比：

根据果蔬中农药残留水平设定一系列啶虫脒标准样品浓度0.01μg·mL^-1、0.1μg·mL^-1、1μg·mL^-1、10μg·mL^-1、100μg·mL^-1、250μg·mL^-1、500μg·mL^-1、750μg·mL^-1、1000μg·mL^-1，取50μL啶虫脒水溶液先与50μL浓度为500U·L^-1的AChE，在37℃孵育30min，然后依次加入50μL浓度为10mM(因为检测啶虫脒，会使乙酰胆碱酯酶失活，要真实反映酶的量，就是要真实反映还有效的酶的量，则AChE适量，ACh和CHO都过量)的ACh和50μL浓度为2000U·L^-1的CHO，然后再孵育20min。将上述溶液与等量5mMFe²⁺混合20min，收集T₂值。以样品浓度(μg·mL^-1)的对数为横坐标，以横向弛豫时间差值(ΔT₂)为纵坐标作图，建立标准曲线，计算得到标准曲线的线性回归方程。计算得到标准曲线的线性回归方程Y＝63.49X+139.17(R²＝0.98)，X＝Lg[啶虫脒浓度(μg·mL^-1)，Y＝ΔT₂，LOD＝2.66ng·mL^-1，S/N＝3，n＝3，RSD＝3.8％,说明此传感器灵敏度高，检测范围广。

同时用分光光度法和过氧化氢试纸测定啶虫脒的含量。配制溶液的步骤与磁传感器相同。用过氧化氢试纸测定加入Fe²⁺后，在340nm处用紫外-可见分光光度计测定吸光度。对每个样本重复测量三次。结果如图4中C所示，吸光度在1～1000μg·mL^-1范围内增加，符合线性方程Y＝6.52×10-5X+0.0175，检出限为0.48μg·mL^-1(X＝[啶虫脒(ng/mL)]，R²＝0.96，RSD＝5.6％)。在TEIA方法中，如图4中D所示，试纸条对反应体系中产生的H₂O₂进行了目视检测，这可以由抑制率来表示。啶虫脒对抑制率的线性响应范围为1～1000μg·mL^-1，可表示为Y＝0.0054X+1.6090，R²＝0.97，RSD＝5.2％，LOD值为0.89μg·mL^-1，其中X为抑制率(％)，Y为ΔT₂值。

显然，Fe²⁺-T₂传感器法比分光光度法和传统的酶抑制法具有更高的灵敏度和准确度。Fe²⁺-T₂传感器的优点归因于两个因素：(1)水溶液中的Fe²⁺均匀、稳定，无背景干扰，可获得稳定、灵敏的信号输出；(2)双酶介导的Fe²⁺/Fe³⁺转化的级联反应只需“一步混合”，提高了检测效率和灵敏度。

实施例5

1.样品检测及加标回收试验

为了验证Fe²⁺-T₂传感器的可靠性，我们对当地的番茄、葡萄等食品进行了检测。在加标过程中，在样品表面喷洒不同浓度的啶虫脒溶液，溶液在室温下完全干燥，以模拟自然环境。将果蔬样品用PBS缓冲液浸泡提取，所得提取液采用上述乙酰胆碱酯酶介导磁传感器方法进行测定，结果如图5。提取时间较长的样品(番茄2号、葡萄2号)的啶虫脒残留量比提取时间较短的样品(番茄1号、葡萄1号)高，说明该磁敏传感器可以应用于实际样品的检测。

2.样品加标回收

为了进一步评估该方法的准确性，我们选择了标准的添加方法，分别在样品中加入1、10、100和1000μg·mL^-1的啶虫脒标液自然孵育后提取并使用上述磁传感器检测，计算加标回收率。如表1所示，在番茄和葡萄中测定的啶虫脒与添加浓度符合良好，回收率为81.27％～142.07％，变异系数(CV)为5.7％～9.2％。结果表明，该磁敏传感器对食品样品中啶虫脒残留量的检测具有良好的准确性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

表1本传感器样品检测的加标回收试验结果