阅读说明：本技术 有机磷农残的快速检测试剂盒、其制备方法和检测方法 (Rapid detection kit for organophosphorus pesticide residues, preparation method and detection method thereof ) 是由 叶升锋 王文珺 桑华春 傅晓春 严可以 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种有机磷农药残留的快速检测试剂盒、其制备方法和检测方法。本发明的方法基于N-溴代丁二酰亚胺增强的酶抑制法,具体采用马血清提取的丁酰胆碱酯酶作为催化酶、抗坏血酸作为还原剂、无水乙醇作为提取剂。使用的N-溴代丁二酰亚胺作为增强剂,可提高检测灵敏度1-3个数量级。本发明的酶抑制法,极大的提高了有机磷农药的检出率,具有灵敏、快速、准确、高通量等优点,用于粮谷大量样本的农残筛查分析,适用于粮站、企业等基层农药残留检测实验室。(The invention relates to a rapid detection kit for organophosphorus pesticide residues, a preparation method and a detection method thereof. The method is based on an N-bromosuccinimide enhanced enzyme inhibition method, and specifically adopts butyrylcholinesterase extracted from horse serum as catalytic enzyme, ascorbic acid as a reducing agent and absolute ethyl alcohol as an extracting agent. The N-bromosuccinimide is used as a reinforcing agent, and the detection sensitivity can be improved by 1 to 3 orders of magnitude. The enzyme inhibition method greatly improves the detection rate of the organophosphorus pesticide, has the advantages of sensitivity, rapidness, accuracy, high flux and the like, is used for screening and analyzing pesticide residues of a large number of grain samples, and is suitable for basal pesticide residue detection laboratories of grain stations, enterprises and the like.)

有机磷农残的快速检测试剂盒、其制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于生物医药及化学领域，涉及一种高灵敏度的增强酶抑制法，检测粮谷中有机磷农药的残留。

背景技术

粮食在种植和储存阶段都需要使用农药来控制病虫害。有机磷类农药是目前粮食生产中广泛使用的杀虫剂，其残留严重危害人、畜及环境安全。有机磷类农药具有种类多、毒性差异大、化学性质不稳定、检测难度大等特点。目前有机磷类农药残留检测主要有气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等大型仪器分析方法和酶抑制法(分光光度法)。仪器分析方法检测结果准确、灵敏，但检测成本高、费时、对技术人员的专业要求高、适合实验室分析；而酶抑制法具有操作简便、快速、适合现场检测等优点，所以《GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测》等一系列国家标准、农业行业标准都推荐酶抑制法[1]。目前酶抑制法的研究和应用主要侧重于蔬菜、水果中农药残留的检测，在粮食中的应用较少。常规酶抑制法因准确性及灵敏度等问题，多年来一直存在争议。对于有机磷类农药来说，酶抑制法的检出限常常无法达到我国粮谷中有机磷农药的国家安全限量，而主要技术原因是硫代型磷酸酯类农药对胆碱酯酶的不敏感[2]。事实上，有机磷农药包括相当一部分属于硫代型有机磷酸酯类农药，这类有机磷农药对乙酰胆碱酯酶不敏感性，常导致漏检，极大的影响了酶抑制法的检出率和适用性。

胆碱酯酶是酶抑制法应用的基础，其灵敏度、特异性及稳定性直接影响了检测结果的准确程度，因此选择合适的酶一直是酶抑制法研究的热点。人们常采用乙酰胆碱酯酶(AChE)作为催化酶，但硫代型有机磷酸酯类农药对AChE催化水解功能的抑制效果较差，因此常出现漏检的情况。因此提高检测灵敏度是酶抑制法的关键。

对于酶抑制法，曾经采用氯化物作为增强剂提高灵敏度，但由于其毒性，现在已经不再使用。目前有人采用溴水为增强剂，但增强效果有限。

本发明经过深入研究，选择能够较好受有机磷农药抑制的丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BChE)，采用特定的提取溶剂，并特别以N-溴代丁二酰亚胺作为增强剂，显著地提高了酶抑制法中对有机磷农药的检测灵敏度，实现了对粮谷中有机磷农药的有效检测，可为我国粮食质量***提供有力的技术支撑。

参考文献：

[1]GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测[S]。

[2]李颖畅，李作伟，吕艳芳，等.驴血清胆碱酯酶抑制法快速检测蔬菜中农药残留[J].食品工业科技，2013,34(13):293-301。

发明内容

要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种快速、高灵敏的检测有机磷农药残留的增强酶抑制法试剂盒和检测方法，用于农产品、特别是粮谷中有机磷农药残留的高通量筛查。

技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种检测有机磷农药残留的酶抑制法试剂盒，所述试剂盒包含：以下试剂A、B、C和D，

试剂A：N-溴代丁二酰亚胺；

试剂B：抗坏血酸；

试剂C：EC 3.1.1.8的丁酰胆碱酯酶；

试剂D：提取溶剂。

在本发明试剂盒的实施方式中，N-溴代丁二酰亚胺的工作浓度为0.1体积％-1.5体积％；和/或抗坏血酸溶液的工作浓度为0.5体积％-5体积％；和/或丁酰胆碱酯酶溶液提取自马血清，和/或所述提取溶剂为乙醇。

本发明还提供了一种检测有机磷农药残留的增强酶抑制方法，其特征在于，使用本发明以上实施方式所述的试剂盒通过以下步骤进行检测：

步骤1：待测样品置于试管中，加入试剂D，振摇，离心；

步骤2：取步骤1中离心后的上清液至于新试管中，60℃下氮气吹干，加入试剂A，静置；

步骤3：加入试剂B，振摇，离心；

步骤4：在步骤3中离心后的上清溶液中加入试剂C，再加入显色剂，混匀，静置，加入底物；

步骤5：检测吸光度。

在本发明方法的实施方式中，所述待测样品为粮谷。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1待测样品取1-5g。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1和3的振摇时间为1-5分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1和3的离心条件是4000rpm离心3-8分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤2和4的静置时间是3-8分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述底物为碘化硫代丁酰胆碱。

在本发明方法的实施方式中，所述显色剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。

在本发明方法的实施方式中，所检测的吸光度是410nm波长的吸光度。

本发明还提供了一种制备本发明以上实施方式所述的试剂盒的方法，所述方法包括将试剂A、B、C和D分别封装在不同溶剂中。

本发明的有益效果

本发明人经过深入研究，选取了N-溴代丁二酰亚胺、抗坏血酸、EC 3.1.1.8的丁酰胆碱酯酶的特定组合，配合提取溶剂，制备成本发明的试剂盒，能够以极高的灵敏度检测农产品、特别是粮食中的有机磷农药残留。

在此基础上，选取乙醇为特定的提取溶剂能够进一步改善本发明对有机磷农药残留的检测效果。

对传统酶抑制法进行了改良，提供了对有机磷农药抑制效果较好的丁酰胆碱酯酶，同时提供了N-溴代丁二酰亚胺作为增强剂，极大的提高了检测灵敏度，克服了传统酶抑制法对硫代型有机磷酸酯类农药检出率低的瓶颈；并提供了适合的样本前处理方法，可有效应用于粮谷中有机磷农药的检测。本发明对解决大批量粮谷样品的有机磷农药残留现场监测具有重要的现实意义。

附图说明

图1为部分有机磷农药的标准抑制曲线。

具体实施方式

通过以下实施方式详细描述本发明，但它们不用来限制本发明所要保护的范围。

本发明的检测有机磷农药残留的酶抑制法试剂盒，所述试剂盒包含：试剂A：N-溴代丁二酰亚胺；试剂B：抗坏血酸；试剂C：EC 3.1.1.8的丁酰胆碱酯酶；试剂D：提取溶剂。

试剂A作为增强剂，采用N-溴代丁二酰亚胺(N-Bromosuccinimide)，化学式：C₄H₄BrNO₂，CAS登录号：128-08-5，

结构式：

所述试剂A的工作浓度可以为0.1-1.5％。如果浓度低于下限，则增强效果不明显；如果浓度高于上限，则失去增强效果。

试剂B作为还原剂，采用抗坏血酸(Ascorbic Acid)，化学式：C₆H₈O₆，CAS登录号：50-81-7，结构式：

所述试剂B的工作浓度可以为0.1-1.5％。如果浓度低于下限，则增强效果不明显；如果浓度高于上限，则失去增强效果。

试剂C为水解催化酶，优选丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BChE)，优选从马血清提取的丁酰胆碱酯酶，CAS登录号：9001-08-5，EC 3.1.1.8。

所述试剂C的工作浓度可以为1-3％。如果浓度低于下限，则酶活性不足；如果浓度高于上限，则吸光度过大影响检测。

试剂D，为提取溶剂，优选乙醇(ethanol)，化学式：C₂H₆O，CAS登录号：64-17-5，结构式：

所述试剂D的工作浓度100％。如果浓度低于100％，则没有增强效果或增强效果不明显。

本发明还提供了一种检测有机磷农药残留的增强酶抑制方法，其特征在于，使用本发明以上实施方式所述的试剂盒通过以下步骤进行检测：

步骤1：待测样品置于试管中，加入试剂D，振摇，离心；

步骤2：取步骤1中离心后的上清液至于新试管中，60℃下氮气吹干，加入试剂A，静置；

步骤3：加入试剂B，振摇，离心；

步骤4：在步骤3中离心后的上清溶液中加入试剂C，再加入显色剂，混匀，静置，加入底物；

步骤5：检测吸光度。

在本发明方法的实施方式中，所述待测样本为粮谷，包括但不限于：小麦、玉米、稻谷、糙米、杂粮。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1待测样品取1-5g，更优选为2g。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1和3的振摇时间为1-5分钟，更优选为2分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤1和3的离心条件是4000rpm离心3-8分钟，更优选是5分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述步骤2和4的静置时间是3-8分钟，更优选是是5分钟。

在本发明方法的实施方式中，所述底物为碘化硫代丁酰胆碱。优选，底物液的配制方法为：称取137mg碘化硫代丁酰胆碱，用15mL去离子水充分溶解后，置4℃冰箱保存备用。

在本发明方法的实施方式中，所述显色剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。优选，显色剂配置方法为：分别称取160mg 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和15.6mg碳酸氢钠，于20mL PBS缓冲溶液中充分溶解，4℃保存。

在本发明方法的实施方式中，所检测的吸光度是410nm波长的吸光度。

实施例

通过以下实施例对本发明的技术方案进一步解释和说明。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均属于分析纯，常规生化试剂公司购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1一种基于增强剂的酶抑制法检测方法

一种基于增强剂的酶抑制法，所述方法可以快速检测粮谷中有机磷农药残留，所述方法采用的试剂包括：

试剂A：N-溴代丁二酰亚胺，各实验组中工作浓度体积百分数分别为0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、1.3％和1.5％，

试剂B：抗坏血酸，各实验组中工作浓度体积百分数分别为0.5％、1.0％、2.0％、3.0％和5％，

试剂C：马血清提取的丁酰胆碱酯酶，各实验组中工作浓度体积百分数分别为1.0％、2.0％和3.0％，

试剂D：无水乙醇。

所述方法的具体步骤为：

步骤1：待测样品3g小麦、1g玉米、4g稻谷或5g糙米分别置于不同离心管中，加入试剂D，振摇2分钟，4000rpm离心5分钟。

步骤2：取上清液置离心管中，60℃下氮气吹干，加入试剂A的溶液，静置5分钟。

步骤3：加入试剂B所述的溶液，振摇2分钟，4000rpm离心5分钟。

步骤4：上清溶液加入试剂C所述酶，再加入显色剂，混匀，静置5分钟，加入底物液。

步骤5：转移到比色皿，放入仪器检测。

实施例2提取溶剂的选择。

通过对PBS、无水乙醇和乙酸乙酯提取谷物样本有机磷农药的效果进行比对，得到的方法检测限如表1所示。

表1不同提取溶剂的比较

根据检测限值，可以确定无水乙醇提取效果优于PBS和乙酸乙酯。

实施例3胆碱酯酶的选择

表2对不同胆碱酯酶受有机磷农药抑制的效果进行分析，包括商业来源的由苍蝇头部提取的乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，AChE)和马血清提取的丁酰胆碱酯酶(BChE)，BChE在结构上与AChE类似，但BChE对底物的特异性和抑制的敏感性与AChE不同。根据粮食生产存储中使用农药的种类，在GC(气相色谱)确定的阴性粮食样本中添加不同浓度的常用有机磷农药，每个浓度设置三个重复平行样品。由表2可知，有机磷农药对BChE的抑制和稳定性都明显优于其对AChE的抑制和稳定性。

表2硫代型有机磷酸酯类农药对不同胆碱酯酶抑制率的影响

实施例4增强剂对硫代型有机磷酸酯类农药抑制效果。

增强剂在酶抑制法中起到了强氧化剂的作用，但有些溴化物作为增强剂带来灵敏度的改变效果有限。硫代型有机磷酸酯类农药经增强剂氧化后，其中的P＝S基团变成了对胆碱酯酶敏感的P＝O基团，提高了对酶的抑制效果。如表3所示，使用N-溴代丁二酰亚胺作为增强剂，能显著改善硫代型有机磷酸酯类农药对BChE的抑制，灵敏度普遍提高了1-3个数量级。而采用溴水为增强剂仅能提高灵敏度不到1个数量级。

表3硫代型有机磷酸酯类农药用增强剂处理前后抑制率变化的比较

*有机磷农药浓度达到500μg/L时，对胆碱酯酶没有抑制

未使用增强剂和使用不同的增强剂对灵敏度的影响不同。使用增强剂，可明显提高检测灵敏度。而且使用溴水和使用N-溴代丁二酰亚胺作为增强剂对检测结果的影响也完全不同：由表3可知，使用N-溴代丁二酰亚胺比溴水对检测灵敏度的增加效果更加明显。

实施例5标准抑制曲线的建立

根据GB/T 5009.199-2003，当被检样品的抑制率≥50％时，可判断为阳性。如图1和表4所示，在优化条件下，对硫磷、辛硫磷、毒死蜱和***磷对马血清BChE的抑制中浓度IC₅₀(50％抑制时，有机磷农药的浓度)分别为0.01、0.11、0.16和0.03μg/L，低于相关报道的检测限值，标准抑制曲线的相关系数(R²)＞0.98，满足了谷物中农药残留的国家安全限量。

使用了增强剂及选择了敏感的胆碱酯酶，IC₅₀作为检测限已基本满足了检测要求，而且使用IC₅₀作为检测限更稳定。以示例性农药制作的标准抑制曲线如图1所示，具体数据见下表1。

表4硫代型有机磷酸酯类农药的曲线方程和相关系数

实施例6实际样本检测：增强酶抑制法与GC的检测结果比较。

采用改良的酶抑制法检测北京地区不同来源的200个谷物样品，其中12个样本经气相色谱确证为阳性，186个样品两种检测方法都为阴性。

粮食的基质比较简单，基本不含对酶有抑制作用的活性物质，由此产生假阳性的几率比较低；但酶抑制法检测的是有机磷和氨基甲酸酯类的总量，得到的是多种农药残留的总量，如果种植和存储过程中使用了多种农药，则可能出现假阳性(如样本S₇₆)，因此，酶抑制法更适合受检样品只施用了某一种农药的情况。此外，对于少数农药来说，酶抑制法的检测限没有达到GB 2763-2019的限量要求，因此会导致假阴性的结果。

本研究中，水胺硫磷检测限是检测限0.1mg/kg，而国家安全限量0.05mg/kg，在0.05-0.1mg/kg范围内，检测结果容易出现假阴性(如样本S₂₃₄)。

由表5可见，酶抑制法检测的200份样品中，187份为阴性，13份为阳性；气相色谱法检测结果为187份为阴性，13份为阳性。两种检测方法的阴性符合率为99％，阳性符合率为85％。总体样本符合率98％，较以前的研究报道有了很大的进步；同时说明北京地区粮食农药残留污染情况远低于全国平均水平。

表5谷物中农药残留检测结果比较

*“+”表示检测结果为阳性；“—”表示检测结果为阴性