紫杉二烯合酶TcTS2、编码核苷酸序列及其应用
阅读说明：本技术 紫杉二烯合酶TcTS2、编码核苷酸序列及其应用 (Taxadiene synthase TcTS2, coding nucleotide sequence and application thereof ) 是由 闫建斌 苟君波 廖庆刚 梁海菲 李冲 杜然 熊兴耀 黄三文 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种紫杉二烯合酶TcTS2,编码核苷酸序列及其应用,涉及植物基因工程技术领域。TcTS2的氨基酸序列包含或由如下序列组成：a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或,b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％序列相似性的功能性同源序列；或c)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个氨基酸且具有TcTS2活性的氨基酸序列。TcTS2和编码TcTS2的核苷酸序列,为提高紫杉醇的产量提供了新的基因资源,可用于植物基因工程和代谢工程策略改造底盘宿主,生产紫杉醇及其中间体等,具有显著经济和社会价值。(The invention provides a taxadiene synthase TcTS2, a coding nucleotide sequence and application thereof, relating to the technical field of plant genetic engineering. The amino acid sequence of TcTS2 comprises or consists of the sequence: a) an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 1; or, b) a functional homologous sequence having at least 80% sequence similarity to the amino acid sequence depicted in SEQ ID No. 1; or c) an amino acid sequence with TcTS2 activity, wherein one or more amino acids are added, deleted or replaced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. The nucleotide sequences of TcTS2 and TcTS2 provide new gene resources for increasing the yield of paclitaxel, can be used for plant genetic engineering and metabolic engineering strategy to modify chassis hosts and produce paclitaxel and intermediates thereof, and has obvious economic and social values.)
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫杉二烯合酶TcTS2，编码核苷酸序列及在合成巴卡亭III或紫杉醇中的应用。
背景技术
紫杉醇是一种二萜类生物碱，最早分离于短叶红豆杉Taxus brevifolia树皮中，是明星抗癌药物，广泛用于多种癌症的临床治疗。癌症是人类十大死亡原因之一，目前，世界上癌症年发病人数仍在1000万以上(WHO)，紫杉醇及其制剂是重要的一线抗癌药物。当前，紫杉醇的主要生产方式为半合成法，即首先通过提取天然前体巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ,10-DAB)，然后化学合成紫杉醇(Li etal.,2015；Liu et al.,2016)，但该方法所用的前体物质仍依赖于植物提取，受制于植物或细胞资源，无法完全解决供应问题。
紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase,TS)最早在短叶红豆杉中被克隆出来，紫杉二烯合酶(TS)催化牛儿基二磷酸(Geranylgeranyl Diphosphate,GGPP)环化反应生成紫杉二烯，紫杉二烯经过一系列的官能团反应生成巴卡亭Ⅲ，TS对紫杉醇的合成具有不可或缺的作用(Wildung et al.,1996)。
紫杉二烯合酶是催化紫杉醇母体紫杉烷骨架形成的第一步酶，其催化GGPP环化的效率和其他裸子植物的环化酶效率相比很低，此步骤是紫杉醇合成途径的限速步骤，TS被证实为慢速酶。因此，发掘具有更高酶活性的紫杉醇生物合成基因及其编码的酶具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明致力于提供一种紫杉二烯合酶TcTS2，提高催化GGPP环化的效率，使合成紫杉醇过程的中间体紫杉二烯、巴卡亭Ⅲ以及产物紫杉醇产量得到大幅度提高，显著降低紫杉醇药物的生产成本，有效解决市场上紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。
本发明第一方面提供了一种紫杉二烯合酶TcTS2，所述紫杉二烯合酶TcTS2的氨基酸序列包含或由如下序列组成：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％序列相似性的功能性同源序列；或
c)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个氨基酸且具有TcTS2活性的氨基酸序列。
本申请的发明人在南方红豆杉Taxus chinensis var.maire中发现了一种新型紫杉二烯合酶基因，命名为TcTS2，并成功获得该基因的编码蛋白(即紫杉二烯合酶TcTS2，本发明中也命名为TcTS2)。功能分析发现TcTS2催化底物GGPP的效率显著高于另一类型的紫杉二烯合酶基因TcTS1，且在植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫下表现为诱导型表达模式。
在本发明的一种实施方式中，所述紫杉二烯合酶TcTS2的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述紫杉二烯合酶TcTS2的氨基酸序列为与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有至少80％序列相似性的功能性同源序列。所述的同一性的功能性同源序列包括但不限于SEQ ID NO.1所示的氨基酸具有约80％或以上、82％或以上、84％或以上、85％或以上、88％或以上、90％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.5％或以上、99.9％或以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述紫杉二烯合酶TcTS2的氨基酸序列为在SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸且具有TcTS2活性的氨基酸序列。
紫杉二烯合酶TcTS2催化GGPP环化的效率明显提高，减轻了限速的影响，进而使合成紫杉醇过程的中间体紫杉二烯、巴卡亭Ⅲ以及产物紫杉醇产量得到大幅度提高，显著降低了紫杉醇药物的生产成本，有效解决市场上紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。
此外，紫杉二烯合酶TcTS2在植物细胞内的表达受MeJA的显著诱导调控，有利于合成生物学技术应用，结合小分子MeJA诱导及其他合成生物学技术手段能够更好地调控紫杉二烯合酶TcTS2的表达情况，可以实现在未来可用于植物基因工程和代谢工程改造生产紫杉醇及其中间体等多个方面。
本发明第二方面提供了编码所述的紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列包含或由如下序列组成：
a)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，
b)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列(优选同源性70％以上)；或，
c)在严格条件下与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交，且能够编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列；或，
d)所述序列a)-c)中任一核苷酸序列的cDNA序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列按照碱基互补配对原则形成的互补序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列的简并序列。简并序列是指改变SEQ ID NO.2核苷酸某个或多个核苷酸序列后，改变的核苷酸序列位置对应编码的氨基酸种类不变，不会影响紫杉二烯合酶TcTS2基因的功能和紫杉二烯合酶TcTS2的表达水平。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列的同源序列。
所述同源核苷酸序列包括在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成的可编码具有紫杉二烯合酶活性的突变基因、等位基因或衍生物。
进一步优选同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列。
示例性地，所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
在本发明的一种实施方式中，所述编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列的cDNA序列。
进一步，所述cDNA的序列包含或由如下序列组成：
a)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
b)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的简并序列或同源序列；优选地，所述同源序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列约80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.5％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。
本发明第三方面提供了所述紫杉二烯合酶TcTS2，或，所述的编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列在合成巴卡亭III或紫杉醇中的应用。
其中，所述紫杉二烯合酶TcTS2在合成巴卡亭III或紫杉醇中的应用包括以下几个方面：(1)本发明所提供的TcTS2氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质；(2)涉及紫杉二烯的生物合成；(3)涉及紫杉醇及其中间体(如巴卡亭III)的生物合成。
所述的编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列在合成巴卡亭III或紫杉醇中的应用包括以下几个方面：(1)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列被修饰或突变，修饰或突变的途径包括***、缺失，聚合酶链式反应(PCR)，易错PCR，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过化学试剂诱变等。(2)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。(3)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过***、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
本发明第四方面提供了用于检测所述的核苷酸序列的引物。
此处对扩增编码紫杉二烯合酶TcTS2核苷酸序列的PCR产物的核苷酸序列不做具体的限定，能够满足特异性扩增出或特异性检测出所述的编码紫杉二烯合酶TcTS2核苷酸序列的引物即可。
在本发明的一种优选地实施方式中，所述引物包括上游引物和/或下游引物；其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-CGAGGCTTGCAAGTTACACA-3’；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-CAGGGCATTTGAAACCTCAT-3’。
本发明第五方面提供了一载体，其导入了所述的核苷酸序列。
对于载体的种类不作具体限定，例如载体包括但不限于pET28b、pIJ702、pUCP19、pYMB03或pHT43，优选pET28b。
本发明第六方面提供了一种宿主细胞，其导入了所述的核苷酸序列，或导入了所述的载体。
进一步，所述的宿主细胞包括植物细胞和/或微生物细胞；
进一步，所述植物细胞包括但不限于红豆杉细胞、烟草细胞、白豆杉细胞、青蒿细胞；
进一步，所述微生物细胞包括但不限于链霉菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母细胞、大肠杆菌。
进一步，在体内和体外将编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列，或所述的重组质粒，或所述的表达载体引入宿主细胞的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导和显微注射。
本发明第七方面提供了一种在植物中表达紫杉二烯合酶TcTS2的方法，将所述核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的宿主细胞转入植物体中，获得紫杉二烯合酶TcTS2。
进一步，所述植物包括但不限于：红豆杉、白豆杉、烟草、青蒿。
进一步，所述植物体也包括如外植体的植物部分，包括但不限于：插条、组织培养物、细胞悬浮液和愈伤组织。
进一步，所述植物更优选为红豆杉和/或烟草。
本发明第八方面提供了一种生产紫杉醇及其中间体的方法，包括使植物体表达所述的紫杉二烯合酶TcTS2。
进一步，所述方法包括：将所述核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的宿主细胞转入植物体中，使紫杉二烯合酶TcTS2表达，获得紫杉醇及其中间体。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种紫杉二烯合酶TcTS2，显著提高了催化GGPP环化的效率，使合成紫杉醇过程的中间体紫杉二烯、巴卡亭III以及产物紫杉醇产量得到大幅度提高，显著降低了紫杉醇药物的生产成本，有效解决市场上紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。
(2)本发明提供的紫杉二烯合酶TcTS2在植物细胞内的表达受MeJA的显著诱导调控，结合小分子MeJA诱导及其他合成生物学技术手段，可以实现在未来可用于植物基因工程和代谢工程改造生产紫杉醇及其中间体等多个方面。
(3)本发明提供的编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列，为提高紫杉醇的产量提供了新的基因资源，该核苷酸序列和TcTS2可用于植物基因工程和代谢工程策略改造底盘宿主，生产紫杉醇及其中间体等，具有显著经济和社会价值。
附图说明
图1所示为TcTSs体外生化活性分析图。其中，A为GC-MS检测TcTSs酶促反应产物，提取紫杉二烯特征离子m/z 122色谱图；B为TcTSs催化GGPP生成紫杉二烯反应示意图；C为TcTSs酶促反应产物的质谱图。
图2所示为MeJA胁迫下代谢产物含量变化及TcTSs基因的表达模式图。其中，A为MeJA胁迫下巴卡亭III和紫杉醇产量相对变化图；B为MeJA胁迫下TcTS1基因的表达模式图；C为MeJA胁迫下TcTS2基因的表达模式图；MeJA+表示100μM MeJA处理组；MeJA-表示溶剂对照组。
具体实施方式
本发明中，术语“TcTS2”可以表示紫杉二烯合酶，或紫杉二烯合酶基因，或编码紫杉二烯合酶的核苷酸序列，具体所指的含义可以结合上下文判断。
本发明中，术语“基因”被定义为在染色体中占据特定位置并包含对植株潜在的表型特征或性状作出贡献的遗传指令的遗传单位(通常用DNA序列表示)。”
本发明中，术语“核苷酸”以本领域技术人员理解的一般含义。
本发明中，术语“氨基酸”是指任何氨基酸(标准和非标准氨基酸二者)，包括但不限于α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸和δ-氨基酸。适合的氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1紫杉二烯合酶TcTSs基因的克隆及表达纯化
1.紫杉二烯合酶TcTSs基因的克隆和序列分析
以功能已知的短叶红豆杉紫杉二烯合酶TbTS(GeneBank NO.U48796)为靶序列，在南方红豆杉T.chinensis var.mairei基因组中搜索，找到两条紫杉二烯合酶基因，分别命名为TcTS1和TcTS2。其中，经过序列比对分析发现：TcTS1读码框氨基酸序列与TbTS同源性为98％，而TcTS2为新发现的紫杉二烯合酶基因，TcTS2的基因组DNA序列为SEQ ID NO.2所示，与TbTS核苷酸相似性为42％；TcTS2读码框核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.1所示，与TbTS的核苷酸相似性和氨基酸同源性均为79％。
以TcTS1和TcTS2基因的核苷酸序列为依据，设计分别扩增TcTS1和TcTS2基因的引物P1和P2，P3和P4，引物包含部分原核表达载体pET28b序列。以南方红豆杉细胞系104的cDNA为模板，采用PCR方法扩增TcTS1和TcTS2基因，PCR目的产物经切胶回收后，与经Sal I和Not I双酶切的线性pET28b载体重组连接，采用Hieff CloneTM一步克隆试剂盒(YEASEN,China)克隆并测序，阳性重组质粒分别命名为pET28b-TcTS1和pET28b-TcTS2。
所用引物中，P1和P2用于扩增TcTS1，P3和P4用于扩增TcTS2，其中引物序列如下：
P1:5’-CCGAATTCGAGCTCCGTCGACATGAGCAGCAGCACTGGCACTAGC-3’(下划线为Sal I酶切位点)(SEQ ID NO.6)
P2:5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCATACTTGAATTGGATCAATATA-3’(下划线为Not I酶切位点)(SEQ ID NO.7)
P3:5’-CCGAATTCGAGCTCCGTCGACATGAGCGGTAGCCCGACCAAGTTGGC-3’(下划线为SalI酶切位点)(SEQ ID NO.8)
P4:5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCATACTTGAATCGGTTCAATGTAAACT-3’(下划线为Not I酶切位点)(SEQ ID NO.9)
2.紫杉二烯合酶TcTSs的异源表达及纯化
TcTSs-His6融合蛋白诱导表达：将构建好的融合表达载体pET28b-TcTS1和pET28b-TcTS2分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得BL21(DE3)/pET28b-TcTS1和BL21(DE3)/pET28b-TcTS2转基因菌株；挑取阳性单克隆分别接种于LB培养基中(含50μg·mL-1的Kanamycin)，37℃过夜培养；取过夜培养物按1:100的比例于300mL新鲜LB培养基中(含50μgmL-1的Kanamycin)，37℃扩大培养至OD600值为0.4-0.6；加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol·L-1，16℃160rpm诱导表达12h；12,000rpm，离心收集菌体，用于纯化。
TcTSs-His6融合蛋白纯化参照美国Thermo Scientific公司HisPur NiNTA Resin及脱盐超滤管法：将收集的菌体分别重悬于20mL裂解缓冲液中(50mM磷酸钠，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)，使用超声波降解法破壁，4,000g，4℃条件下离心20分钟，将上清加载到1.5mL HisPur Ni-NTA树脂填料柱中(Thermo Scientific,USA)，经除杂后使用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，300mM NaCl，50mM咪唑)洗脱。
纯化后的重组TcTSs-His6使用30kDa超滤管脱盐，保存于酶反应缓冲液(25mMHEPES，pH8.5，10％甘油，5mM DTT，5mM抗坏血酸钠，5mM偏亚硫酸钠和1mM MgCl2)中，重组蛋白TcTSs-His6的含量和纯度分别用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime,China)、牛血清白蛋白(BSA)标准品和SDS-PAGE凝胶电泳检查。
结果表明TcTS1-His6融合蛋白和TcTS2-His6融合蛋白均为可溶性表达，纯化蛋白纯度高达98％以上，浓度分别为3.4μg·μL-1和1.8μg·μL-1。
实施例2紫杉二烯合酶TcTSs生化功能分析
1.TcTSs-His6体外活性
体外酶促反应体系为500μL，包含100μg纯化蛋白，100μM GGPP(Sigma-Aldrich)和酶反应缓冲液(25mM，pH8.5，10％甘油，5mM DTT，5mM抗坏血酸盐，5mM焦亚硫酸钠和1mMMgCl2)，反应混合物覆盖500μL戊烷(Macklin，GC-MS级)32℃水浴锅中反应2小时，漩涡2分钟，5000rpm离心10分钟，戊烷层取出放入2mL进样品，使用氮吹仪低温浓缩，产物用气相色谱质谱(GC-MS)仪器进行分析。
对照组为纯化后的重组蛋白TcTSs-His6经100℃煮沸10min后反应产物。GC-MS仪器为安捷伦7890B/7000C(美国Waldbronn安捷伦科技)，质谱检测器参数：70eV，氦气流速1.2mL min-1，色谱柱安捷伦HP-5MS(5％苯基甲基氧化硅，30m×250μm内径，0.25μm膜厚度)，进样体积1-5μL；柱温箱温度程序如下：45℃持续1分钟，然后10℃min-1梯度上升到250℃，250℃保持5分钟。进样口温度为250℃；扫描质荷比(m/z)为40-350，以紫杉二烯标准品为参照，进行酶促产物定性分析。
体外生化功能分析结果如图1所示，结果表明TcTS1和TcTS2均能催化底物GGPP生成主产物taxa-4(5)，11(12)-diene(紫杉烯4(5),11(12)-二烯，占94％)和次产物taxa-4(20),11(12)-diene(紫杉烯4(20),11(12)-二烯，占4％)，展示相同的紫杉二烯合成酶活性。其中图1C展示了TcTSs酶促反应产物的质谱图，对酶促产物定性。
2.TcTSs-His6动力学常数比较
动力学参数测定：标准酶促反应总体积100μL，包含酶反应缓冲液(25mM，pH8.5，10％甘油，5mM DTT，5mM抗坏血酸盐，5mM焦亚硫酸钠和1mM MgCl2)，34μg(TcTS1-His6)或18μg(TcTS2-His6)重组蛋白和7个不同浓度GGPP(0.2μM，0.5μM，1μM，2.5μM，5μM，10μM，25μM，50μM)混有[1-3H]-GGPP底物(American Radiolabeled Chemicals,Inc,30 Ci mM-1)。
标记的[1-3H]-GGPP用未标记的GGPP(Sigma,1mg mL-1)稀释400倍。反应混合物在32℃反应30分钟，然后使用100μL终止缓冲液(包含1M EDTA和4M NaOH)淬火10分钟；反应混合物用800μL正己烷提取(涡旋2分钟，12,000rpm离心10分钟)，400μL正己烷提取液加入2mL液体闪烁液中混匀。采用液体闪烁计数器(Tri-Carb 2910TR,Perkin Elmer)测定反应产物的总放射性。利用Origin 8.6软件对Michaelis-Menten方程进行非线性回归拟合计算动力学常数。
动力学常数结果显示：TcTS1-His6和TcTS2-His6的Km分别为5.5±1.6和8.6±1.5(pM·μg-1·min-1)，而TcTS1-His6和TcTS2-His6的Kcat值则分别为0.00292(1·s-1)和0.00901(1·s-1)。从它们的Km和Kcat值来看，尽管TcTS1-His6结合GGPP的强度是TcTS2-His6的1.6倍，但TcTS2-His6的催化效率是TcTS1-His6的3倍(Kcat值)。动力学常数结果表明TcTS2酶催化效率显著优于TcTS1，合成生物学应用前景也显著优于TcTS1。
实施例3茉莉酸甲酯胁迫下紫杉二烯合酶TcTSs基因表达与紫杉醇相关性分析
1.茉莉酸甲酯处理南方红豆杉细胞系211试验
将南方红豆杉211细胞系分为两组：实验组(MeJA+)用100μM茉莉酸甲酯浸泡处理；对照组(MeJA-)用0.05％乙醇溶液浸泡处理。两组同时进行，分别在0h、2h、3h和4h后收集样品，用于TcTSs基因的表达模式和巴卡亭Ⅲ以及紫杉醇含量变化分析，三次生物重复。
2.MeJA不同处理时间巴卡亭III和紫杉醇含量变化分析
代谢物提取采用改良的沃尔夫恩德Wolfender法，简言之，称取100mg冻干细胞粉放置于2ml离心管中，加入1.5mL提取缓冲液(甲醇:水＝80:20,v/v)涡旋悬浮，包含500ng/mL***为内标，超声提取30min后，14,000g离心15min，上清液于真空浓缩器(LABCONCO)中离心干燥，最后样品重悬于200ul甲醇溶剂(80:20,v/v)中用于LCMS分析。样品使用ACQUITY UPLC I-Class/AB SCIEX(Waters)仪器进行LC-MS分析。分离柱为Waters(2.1×50mm；ACQUITY UPLCTM Waters Xselect HSS T3)；进样量10μL，流速为0.2mL·min-1。流动相组成为：A是0.1％甲酸甲醇；B为0.1％甲酸水。LC分离程序为：40％A平衡2min，随后梯度洗脱10min至100％B，维持2min，再回到40％A平衡1min。ESI离子源，正离子模式。数据采集和处理在AB SCIEX Analyst 1.6.3软件(Applied Biosystems)上进行。
图2A的代谢物定量分析结果显示，100μM MeJA处理明显促进了紫杉醇和巴卡亭III的积累，当MeJA处理2h时，相对于对照组紫杉醇和巴卡亭III的增加倍数分别为9.53和1.48倍；当MeJA处理4h时，紫杉醇和巴卡亭III的增加倍数分别为12.91和7.01倍。
3.MeJA不同处理时间TcTS2基因表达模式分析
使用EASYspin植物总RNA提取试剂盒(Aidlab，北京)提取收集上述不同处理时间的样品总RNA，分别取1μg总RNA用于第一链cDNA的合成，作为实时荧光定量PCR的模板，第一链cDNA合成使用试剂盒
qPCR基因特异引物如下：
P5:5’-GCACGGAATTGTTTCCAACT-3’(TcACTIN1)(SEQ ID NO.10)
P6:5’-GGCAACATACATTGCAGGTG-3’(TcACTIN1)(SEQ ID NO.11)
P7:5’-AGCACTGGCACTAGCAAGGT-3’(TcTS1)(SEQ ID NO.12)
P8:5’-TTCACAACCAGCTCATCTGC-3’(TcTS1)(SEQ ID NO.13)
P9:5’-CGAGGCTTGCAAGTTACACA-3’(TcTS2)(SEQ ID No：4)
P10:5’-CAGGGCATTTGAAACCTCAT-3’(TcTS2)(SEQ ID No：5)。
图2B，C的qPCR结果显示，MeJA胁迫下，TcTS1和TcTS2的表达均有所上调，但表现出不同表达模式。不同MeJA处理时间，TcTS1的上调趋于平稳，表现为组成型表达模式，相反，TcTS2的上调显著，最显著诱导时间节点为4小时，相对于0小时诱导倍数为7，展现为诱导型表达模式。
结合代谢物定量分析结果和基因表达模式分析，MeJA胁迫下，TcTS2表达显著上调，紫杉醇和巴卡亭III产量显著增加。上述结果表明，TcTS2在植物细胞内的表达受植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)的显著诱导调控，促进了巴卡亭III和紫杉醇的合成。诱导型表达的TcTS2基因更有利于合成生物学技术应用，合成应用前景显著优于TcTS1。
综上所述，本发明提供的新型紫杉二烯合酶基因TcTS2与另一类型紫杉二烯合成酶基因TcTS1显著不同，表达的蛋白也有显著差异，TcTS2酶催化效率显著高，在MeJA胁迫下呈现诱导型表达，显著促进了巴卡亭III和紫杉醇的合成。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 紫杉二烯合酶TcTS2、编码核苷酸序列及其应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 815
<212> PRT
<213> 紫杉二烯合酶TcTS2的氨基酸序列
<400> 1
Met Ala Gln Leu Ser Phe Asn Ser Ala Val Lys Met Asn Ala Asn Ala
1 5 10 15
Asn Ala Trp Cys Gly Asn Lys Ala Ile His Gly Pro Thr Asn His Arg
20 25 30
Val Lys Ser Glu Gly Arg Arg Lys Met Trp Phe Cys Ser Lys Ala Ala
35 40 45
Gly Thr Arg Tyr Cys Pro Val Leu Met Met Ser Ser Ser Pro Thr Lys
50 55 60
Leu Ala Thr Glu Asn Ala Asn Ala Val Ala Glu Ser Asn Leu Ile Pro
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ala Asn Tyr His Gly Asp Leu Trp His His Gly Val Ile
85 90 95
Gln Thr Leu Gln Thr Pro Tyr Gln Glu Ser Ser Ser Tyr Gln Glu Arg
100 105 110
Ala Glu Glu Leu Ile Val Lys Ile Lys Asp Met Phe Lys Ala Val Glu
115 120 125
Glu Gly Ala Ile Ser Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg
130 135 140
Val Pro Asp Gly Ser Glu Lys Pro Arg Phe Pro Gln Ala Leu Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu His Asn Gln Leu Gln Asp Gly Ser Trp Gly Leu Glu Ser His
165 170 175
Phe Met Leu Ser Asp Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asn Ser Val Ile Ser
180 185 190
Leu Leu Val Trp Lys Thr Gly Gln Gln Gln Val Glu Gln Gly Thr Leu
195 200 205
Phe Ile Thr Glu Asn Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Asp Glu Leu Pro
210 215 220
Pro Asp Phe Glu Ile Ile Phe Pro Ala Leu Leu Gln Lys Ala Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Met Ser Leu Pro Asp His Asp Leu Pro Phe Ile Lys Ser Leu
245 250 255
Ser Val Ala Arg Glu Ala Arg Leu Ala Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Ile
260 265 270
Pro Ala Ser Met Leu Asn Ala Leu Glu Gly Leu Glu Glu Val Ile Asp
275 280 285
Trp Asp Lys Ile Met Arg Phe Gln Met Pro Cys Leu Tyr Ser Ile Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Arg Leu Ser Leu Val Asp Asn Ile Glu His Leu Gly Ile
305 310 315 320
Gly Arg His Phe Lys Gln Glu Ile Lys Val Ala Leu Asp Tyr Val Tyr
325 330 335
Arg Tyr Trp Ser Glu Arg Gly Ile Gly Leu Gly Arg Asp Ser Leu Ile
340 345 350
Pro Asp Leu Asn Thr Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Ala His
355 360 365
Gly Tyr Asn Val Ser Ser Glu Val Leu Asn Asn Phe Lys Asp Glu Asn
370 375 380
Gly Arg Phe Phe Ser Ser Leu Gly Gln Thr His Val Glu Leu Arg Ser
385 390 395 400
Met Val Asn Leu Leu Arg Ala Ser Asp Leu Ala Phe Pro Asp Glu Pro
405 410 415
Leu Met Asp Asp Ala Lys Ile Phe Ala Glu Ala Tyr Leu Arg Asp Ala
420 425 430
Leu Ala Thr Arg Ile Ser Thr Asn Thr Lys Leu Phe Lys Glu Ile Asp
435 440 445
Tyr Ala Val Glu Tyr Pro Trp His Met Ser Ile Pro Arg Leu Glu Ala
450 455 460
Arg Ser Tyr Ile Asp Val Tyr Asp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln Asn Lys
465 470 475 480
Thr Leu Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ser Asn Ala Tyr Cys Leu Glu Leu
485 490 495
Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Val Gln Ser Leu His Gln Glu Glu Leu
500 505 510
Lys Leu Leu Thr Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Met Ala Asp Ile Asn
515 520 525
Phe Thr Arg His Arg Val Ala Glu Val Tyr Phe Ser Ser Ala Thr Phe
530 535 540
Glu Pro Glu Tyr Ser Ser Thr Arg Ile Ala Phe Thr Lys Ile Gly Cys
545 550 555 560
Leu Gln Val Leu Phe Asp Asp Met Ala Asp Ile Phe Ala Thr Leu Asp
565 570 575
Glu Leu Arg Asp Phe Thr Glu Gly Val Lys Arg Trp Asp Thr Ser Leu
580 585 590
Ile His Lys Leu Pro Asp Cys Met Gln Thr Cys Phe Arg Val Trp Phe
595 600 605
Asn Leu Met Glu Glu Val Asn Asn Asp Val Ser Asn Val Gln Gly Arg
610 615 620
Asp Met Leu Asn His Ile Arg Lys Pro Trp Glu Leu Tyr Phe Asn Cys
625 630 635 640
Tyr Val Gln Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Gly Tyr Ile Pro Thr Leu
645 650 655
Glu Glu Tyr Leu Lys Thr Tyr Ser Ile Ser Val Gly Leu Gly Pro Cys
660 665 670
Thr Leu Gln Pro Ile Leu Leu Met Gly Asp Ile Val Lys Asp Asp Val
675 680 685
Val Glu Lys Val His Tyr Pro Ser Asn Leu Phe Glu Leu Val Ser Leu
690 695 700
Ser Trp Arg Leu Thr Asn Asp Thr Lys Thr Tyr Gln Ala Glu Lys Ala
705 710 715 720
Arg Gly Gln Gln Ala Ser Gly Ile Ala Cys Tyr Met Lys Asp Asn Pro
725 730 735
Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Ile Lys Tyr Ile Cys Gly Val Val Asp
740 745 750
Arg Ala Leu Lys Glu Ala Cys Phe Glu Tyr Phe Lys Pro Ala Asp Asp
755 760 765
Val Pro Met Ser Cys Lys Ser Phe Ile Phe Asn Leu Arg Leu Cys Val
770 775 780
Gln Ile Phe Tyr Lys Phe Ile Asp Gly Tyr Gly Ile Ala Asn Glu Glu
785 790 795 800
Ile Lys Asp Tyr Ile Arg Lys Val Tyr Ile Glu Pro Ile Gln Val
805 810 815
<210> 2
<211> 5138
<212> DNA
<213> 编码紫杉二烯合酶TcTS2的核苷酸序列
<400> 2
attccatgtg gctttgatca tgataatgga ttggtgtcct acaaggcaca ttaattaggt 60
aagatccttt atatcaacgt ataacataat cccttcacaa ttagatgtac gttgatatca 120
tcgtataaca ttaataggtc gatgggtggg aatagagatt aacatggagt caacgaaaac 180
cttcacttgg tgatgttgaa aactacatta tccattacaa aaaggctttt tagattatat 240
aaatttaata gtcattgatt gtttgcatcg atgattacta tctatgtttg taaatgacaa 300
tcaaatatat atcaaattta atactgaaat tgcataacga gaatcagatg atgttaatgt 360
aactacacta atgcgtaaaa ttcgggaaaa aaaaatagtg agaaagaaaa agtgttaaac 420
tccattctat gacaaagata ctatgagagg aggaggcaaa aagtgtagaa gactaagcat 480
agaccaaaaa gaacaaaaac gaagactaag tagtacaaaa aacaaaagtg cctacttaaa 540
tgagaaaagc attgataaaa atagtaggta gattgtttgg gtttatacga ttaaaatatt 600
tatgggaaat tataatatgt aataaacaaa gcatattttg ttgcttacaa acatgatgtt 660
tttgacacat gcaatgcgga attttatttt agtaattttc cctgacagtt ttctctggct 720
tgagactttc tgacatgaga caagctttta gaaaatttag attaatatct atgtttgtaa 780
attgcaatca aatatatata tcaaatttaa tactgaaatt gtacaacgaa aatcagatga 840
ctacattaat gcggaaaaaa tatttagcga gaaagaaaga gtgttaaact ccattctatg 900
acgaagatac tatgaaagga ggaggaggag aaaaacaaaa agaagatact atgaaaggag 960
gaggagaaaa acaaaagcgc ctacttaaat gagataagca ttgataaaaa tttgggttta 1020
tacgattaaa atatctaagg gtgattataa tatgtaataa aaacaagcgt aggtattttg 1080
ttgcttacaa acgtgatgtt tcggaattga aagaaatgtg agcgggcaaa tgcaaatgga 1140
gttggagttg gaattggcgc ttgcaaatta aacatgtgat gagtgcctgc cgcctttgta 1200
tgctcatctc agtgaccccc tatttattta aactagctat tctgcaggac agtagacaag 1260
cattgaatct tagttttagt ttaaccaggt gatttggaat ctggaattcc cctgcagaaa 1320
atggctcagc tctcgtttaa ctcggcggtg aagatgaatg cgaatgcgaa tgcgaatgcg 1380
tggtgcggga acaaggcaat ccacggtcca acaaatcaca gagtaaaaag tgagggcagg 1440
agaaagatgt ggttttgctc caaggcagca gggacaaggt actgtcctgt cctaatgatg 1500
agcggtagcc cgaccaagtt ggctacggag aatgccaatg cagttgcaga atctaatttg 1560
atccctcgac tctccgccaa ttatcatggc gatctgtggc accatggcgt aatacaaaca 1620
ttacaaacac cttaccaaga ggtaagccaa acaaaatttg taggtacatg tagggacatt 1680
gatttgtttt cttggctcac atttctgtca actgcagagt tcttcctacc aagaacgggc 1740
agaggagctt attgtgaaaa ttaaagatat gttcaaggca gttgaagagg gagcaataag 1800
tccatccgca tacgacactg cctgggtcgc aagggtgcct gatggatctg agaagccacg 1860
gtttccccag gccctcaact ggcttctaca caaccagctc caagatggat catggggtct 1920
tgaatcgcac tttatgctga gcgatcgatt gcttagcaca ctcaattctg ttatctccct 1980
ccttgtttgg aaaacagggc agcagcaagt agaacaaggt gagaaatttt agctgtcctc 2040
atacatactc tgtaagaata gcattgcatt tagctgtcct catacataca ctgtttgttc 2100
aatcatataa ttttcttctc tacaggtact ttgtttatta cagagaatct aaaattactg 2160
gagggggaag atgagttgcc cccggacttt gaaataatct ttcctgctct gttgcaaaag 2220
gcaaaagcgc tgggaatgag tcttcctgat catgatcttc cattcatcaa atctttgtcg 2280
gtagcacggg aagcgaggct tgcaagttac acagagtgag tgaaaacaga gctctataac 2340
tttggtgtgt gtttttggac attaatcaat cccaatgtac ttatggatta tgtgtttttg 2400
gcattgcagc aacaatattc cagccagcat gttgaatgcg ttggagggtc tggaggaagt 2460
tattgattgg gacaagatta tgaggtttca aagtaaggat ggatctttcc tgagctcccc 2520
tgcttccact gcatgtgtac tgatgcatac aggggacgaa agctgttttg cctttctcaa 2580
caatgtgctg gacaaattcg gcggctgcgg taataataat aataataata ataatgctac 2640
ttcttcccct ttaagtaatt aatttagtga agctgagaat gcattcaatg aaaactaact 2700
gtgtgaatta cagtgccctg tttgtattca atcgatctgc ttgaacgcct ttcgctggtt 2760
gacaacatcg agcatctcgg aatcggtcga catttcaaac aagaaatcaa ggtagctctt 2820
gattatgtct acaggtaacc taaccactcc attttgctat tcttttttcc cttaccctgc 2880
cttttctttt cttgcaactg caccagtagc atcctaatta tatatatata tggacagata 2940
ttggagtgaa agaggcatcg gtttgggtag agacagccta attcctgatc tgaacactac 3000
agccctcggc ctccgaaccc ttcgggccca tggatacaat gtttcctcgg gttagatact 3060
tacctgcctt taatcctatt attattattt caacataacg ttactgtcgc atttctttct 3120
ttatgctcat gatgtggaaa caaatactta tgaacgaacg cagaggtttt gaataatttc 3180
aaagatgaaa acgggcgctt cttctcctct cttggccaaa cacatgtaga attgagaagc 3240
atggtgaacc ttttgagagc ttccgacctc gcatttcccg acgaaccact tatggacgat 3300
gctaaaatct ttgcagaagc atatcttaga gacgcacttg caacacgcat ctcaaccaat 3360
acaaaattat tcaaagaggt tagtgctacc ttatttcccc ctttaaaatc cacatcacta 3420
atcctaccca aacccaaatt ttgttccttt ctctaatatc ataatcattt catttcagat 3480
cgactacgcg gtagagtacc cttggcacat gagtatccca cgtctcgagg cgagaagtta 3540
tattgatgta tacgacgatg attatacatg gcaaaataag actctataca ggtgggtcta 3600
aatatatgat cacatgagcc aagtaaattt tatacaaatt ccacgagcct tgttgcacta 3660
gttattatct ttctttaata ataaagttac aatctgtgca acagaatgtc aaacttgagt 3720
aacgcatatt gcttagaatt ggcgaaattg gacttcaata ttgtgcaatc tttgcatcaa 3780
gaggagttga agcttctaac aaggtgggtc ataaattact gtgcattctc aacttatctt 3840
ataatttatc caaagataac acatttgtac taataatcta ctaacattat gggtttttat 3900
gtcataagat ggtggaaaga atctggcatg gcagatataa acttcactcg acaccgagtg 3960
gcagaggtgt atttttcatc agctacgttt gaacccgaat attcttctac cagaatcgcc 4020
ttcaccaaaa ttggttgttt gcaagtcctg tttgacgaca tggccgacat ctttgcaaca 4080
ctagatgagt tgagagattt caccgaggga gtaaagaggt gattcatcaa aacttttaat 4140
ttgttttaat atttacaaat caaagccatg tcctaaaata catacataat ctgctagcgt 4200
aattgaacgt tttcgtaaat ttcagatggg acacctcttt gatacacaag ctaccagact 4260
gtatgcaaac ttgctttaga gtttggttta acttaatgga agaagtcaat aacgacgtgt 4320
caaacgtaca aggccgtgac atgctcaatc acataagaaa acccgtaagt aattcaaatt 4380
gtagatgcca ccaaatccaa aaaaaatcgt agtatagatg gatttctttt ctacatgcct 4440
cataaacatt ggtactcaca tttaaacatt gttgtgtgac tcgaaatata gtgggagttg 4500
tacttcaatt gttatgtaca agaaagagag tggctcgatg ctgggtatat accgactcta 4560
gaggagtacc taaagaccta ttctatatca gtaggccttg gaccatgtac tctacaacca 4620
atactactaa tgggcgatat cgtgaaagat gatgttgtcg agaaagtgca ctatccctca 4680
aatctatttg aacttgtatc cttgagctgg cgattaacaa atgacacaaa aacatatcag 4740
gtgcttcttg aatctcaaag tttcttctat atatacaaac ttgccactaa atgtgtacaa 4800
ccgcatgcta accttatttg tgtttcttcc ttggtgaagg ctgagaaggc tcgaggacaa 4860
caagcctcag gcatagcgtg ttatatgaag gataatccag gatcgacaga ggaagatgcc 4920
atcaagtaca tatgcggagt tgttgatcga gccttgaaag aggcatgctt tgaatatttc 4980
aagccagccg atgatgtccc aatgagttgc aagtccttta ttttcaacct cagactgtgt 5040
gtccaaatat tttacaagtt tatagatggg tatggaattg ccaacgagga gattaaggat 5100
tatataagaa aagtttacat tgaaccgatt caagtatg 5138
<210> 3
<211> 2568
<212> DNA
<213> 编码紫杉二烯合酶TcTS2的cDNA序列
<400> 3
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgggatc cgaattcgag ctccgtcgac 120
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cgactctccg ccaattatca tggcgatctg tggcaccatg gcgtaataca aacattacaa 420
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cttctacaca accagctcca agatggatca tggggtcttg aatcgcactt tatgctgagc 660
gatcgattgc ttagcacact caattctgtt atctccctcc ttgtttggaa aacagggcag 720
cagcaagtag aacaaggtac tttgtttatt acagagaatc taaaattact ggagggggaa 780
gatgagttgc ccccggactt tgaaataatc tttcctgctc tgttgcaaaa ggcaaaagcg 840
ctgggaatga gtcttcctga tcatgatctt ccattcatca aatctttgtc ggtagcacgg 900
gaagcgaggc ttgcaagtta cacagacaac aatattccag ccagcatgtt gaatgcgttg 960
gagggtctgg aggaagttat tgattgggac aagattatga ggtttcaaat gccctgtttg 1020
tattcaatcg atctgcttga acgcctttcg ctggttgaca acatcgagca tctcggaatc 1080
ggtcgacatt tcaaacaaga aatcaaggta gctcttgatt atgtctacag atattggagt 1140
gaaagaggca tcggtttggg tagagacagc ctaattcctg atctgaacac tacagccctc 1200
ggcctccgaa cccttcgggc ccatggatac aatgtttcct cggaggtttt gaataatttc 1260
aaagatgaaa acgggcgctt cttctcctct cttggccaaa cacatgtaga attgagaagc 1320
atggtgaacc ttttgagagc ttccgacctc gcatttcccg acgaaccact tatggacgat 1380
gccaaaatct ttgcagaagc atatcttaga gacgcacttg caacacgcat ctcaaccaat 1440
acaaaattat tcaaagagat cgactacgcg gtagagtacc cttggcacat gagtatccca 1500
cgtctcgagg cgagaagtta tattgatgta tacgacgatg attatacatg gcaaaataag 1560
actctataca gaatgtcaaa cttgagtaac gcatattgct tagaattggc gaaattggac 1620
ttcaatattg tgcaatcttt gcatcaagag gagttgaagc ttctaacaag atggtggaaa 1680
gaatctggca tggcagatat aaacttcact cgacaccgag tggcagaggt gtatttttca 1740
tcagctacgt ttgaacccga atattcttct accagaatcg ccttcaccaa aattggttgt 1800
ttgcaagtcc tgtttgacga catggccgac atctttgcaa cactagatga gttgagagat 1860
ttcaccgagg gagtaaagag atgggacacc tctttgatac acaagctacc agactgtatg 1920
caaacttgct ttagagtttg gtttaactta atggaagaag tcaataacga cgtgtcaaac 1980
gtacaaggcc gtgacatgct caatcacata agaaaaccct gggagttgta cttcaattgt 2040
tatgtacaag aaagagagtg gctcgatgct gggtatatac cgactctaga ggagtaccta 2100
aagacctatt ctatatcagt aggccttgga ccatgtactc tacaaccaat actactaatg 2160
ggcgatatcg tgaaagatga tgttgtcgag aaagtgcact atccctcaaa tctatttgaa 2220
cttgtatcct tgagctggcg attaacaaat gacacaaaaa catatcaggc tgagaaggct 2280
cgaggacaac aagcctcagg catagcgtgt tatatgaagg ataatccagg atcgacagag 2340
gaagatgcca tcaagtacat atgcggagtt gttgatcgag ccttgaaaga ggcatgcttt 2400
gaatatttca agccagccga tgatgtccca atgagttgca agtcctttat tttcaacctc 2460
agactgtgtg tccaaatatt ttacaagttt atagatgggt atggaattgc caacgaggag 2520
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgaggcttgc aagttacaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
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<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 13
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