阅读说明：本技术 一种rbp4作为肌少症治疗靶点的检测方法 (Detection method of RBP4 as sarcopenia treatment target ) 是由 高伟 鲁翔 王丽 赵璨 张康振 王玥 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法,检测包括RBP4在肌少症患者的腓肠肌组织中表达变化,腺病毒沉默小鼠骨骼肌RBP4表达后小鼠运动耐量的改变,和RBP4在小鼠C2C12成肌细胞分化过程的表达变化。本发明检测方法通过肌少症患者腓肠肌组织中提取蛋白样品检测RBP4的表达水平；利用腺病毒沉默小鼠腓肠肌RBP4基因表达,测量小鼠运动耐量；以及从分化不同程度的C2C12成肌细胞中提取RNA检测RBP4的表达。操作简单、快速、稳定性好；为肌少症患者的临床诊治提供强有力的理论支持,具有临床意义和推广价值。(The invention discloses a detection method of RBP4 as a sarcopenia treatment target, which comprises the steps of detecting expression change of RBP4 in gastrocnemius tissues of sarcopenia patients, change of exercise tolerance of mice after adenovirus silences RBP4 expression of skeletal muscles of the mice, and expression change of RBP4 in the differentiation process of myoblasts of C2C12 of the mice. The detection method of the invention detects the expression level of RBP4 by extracting protein samples from gastrocnemius tissues of patients with sarcopenia; using adenovirus to silence the expression of mouse gastrocnemius RBP4 gene, measuring the exercise tolerance of mouse; and extracting RNA from the C2C12 myoblasts differentiated to different degrees to detect the expression of RBP 4. The operation is simple and rapid, and the stability is good; provides powerful theoretical support for clinical diagnosis and treatment of sarcopenia patients, and has clinical significance and popularization value.)

一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体是一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法。

背景技术

骨骼肌是人体最有活力和可塑性的组织之一，约占总体重的40％，并包含所有身体蛋白质的50-75％。骨骼肌萎缩发生于多种情况下，比如疾病状态(心力衰竭、癌症、糖尿病、败血症等)、去神经性损害、禁食、老年化和药物治疗等。骨骼肌萎缩主要是由于肌肉蛋白质过度分解所致，而蛋白质分解通常伴随蛋白质合成减少，表现为骨骼肌质量下降和功能障碍，从而导致患者生活质量下降，引起发病率和死亡率增加。因此，寻找新的有效的肌肉因子作为肌肉萎缩治疗的干预靶点具有重要意义。

视黄醇结合蛋白4(RBP4)，是循环血液中视黄醇(维生素A醇)的转运蛋白，它主要在肝脏中合成释放到外循环，小部分来自于脂肪细胞。近年来研究表明RBP4通过炎症途径诱导胰岛素抵抗和心血管疾病，参与体内多器官的代谢调节。最近我们发现，RBP4在肌少症患者的腓肠肌组织中表达下降；腺病毒沉默小鼠肌肉组织中RBP4表达后，小鼠的运动耐量降低；进一步研究发现RBP4表达水平随小鼠C2C12成肌细胞分化而逐渐升高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法，通过肌少症患者腓肠肌组织中提取蛋白样品检测RBP4的表达水平；利用腺病毒沉默小鼠腓肠肌RBP4基因表达，测量小鼠运动耐量；以及从分化不同程度的C2C12成肌细胞中提取RNA检测RBP4的表达。操作简单、快速、稳定性好；为肌少症患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法，检测包括RBP4在肌少症患者的腓肠肌组织中表达变化，腺病毒沉默小鼠骨骼肌RBP4表达后小鼠运动耐量的改变，和RBP4在小鼠C2C12成肌细胞分化过程的表达变化。

进一步的，所述RBP4在肌少症患者的腓肠肌组织中表达变化包括WesternBlot检测试剂。

进一步的，所述WesternBlot检测试剂包括RBP4特异性抗体和内参照GAPDH特异性抗体。

进一步的，所述RBP4特异性抗体为：ab10919。

进一步的，其特征在于，所述内参照GAPDH特异性抗体为60004-1-Ig。

进一步的，所述腺病毒沉默小鼠骨骼肌RBP4表达后小鼠运动耐量的改变包括小鼠运动距离和运动时间测量。

进一步的，所述腺病毒沉默小鼠骨骼肌RBP4表达包括RBP4腺病毒序列。

进一步的，所述RBP4在小鼠C2C12成肌细胞分化过程的表达变化包括实时荧光定量PCR检测试剂。

进一步的，所述实时荧光定量PCR检测试剂包括RBP4的特异性引物和内参照GAPDH的特异性引物。

所述RBP4的特异性引物包括RBP4的特异性引物正向引物和RBP4的特异性引物反向引物。

进一步的，所述内参照GAPDH的特异性引物包括GADH特异性引物正向引物和GAPDH特异性引物反向引物。

本发明的有益效果：

1、本发明检测方法通过肌少症患者腓肠肌组织中提取蛋白样品检测RBP4的表达水平；利用腺病毒沉默小鼠腓肠肌RBP4基因表达，测量小鼠运动耐量；以及从分化不同程度的C2C12成肌细胞中提取RNA检测RBP4的表达。操作简单、快速、稳定性好；

2、本发明检测方法为肌少症患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明RBP4在肌少症患者与正常人肌肉组织中蛋白表达示意图；

图2是本发明RBP4在肌少症患者与正常人肌肉组织中蛋白表达示意图；

图3是本发明小鼠腓肠肌注射RBP4腺病毒、无关对照和生理盐水后，小鼠运动距离的检测示意图；

图4是本发明小鼠腓肠肌注射RBP4腺病毒、无关对照和生理盐水后，小鼠运动时间的检测示意图；

图5是本发明C2C12细胞分化时间的变化RBP4在mRNA水平表达变化示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种RBP4作为肌少症治疗靶点的检测方法,采用WesternBlot(蛋白质印迹法)进行检测,检测方法包括以下步骤：

S1：总蛋白提取

(1)取6例肌少症患者和6例正常人腓肠肌组织30mg，放入2mlEP管，低温保存。

(2)冰上配置蛋白提取裂解液(RIPA强、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)。

(3)每个样品中加入200ul蛋白裂解液，充***解肌肉组织，冰上静置30min。

(4)样品离心15min(12000rpm，4℃)，吸取上清转移到新的EP管。

(5)BCA法测蛋白浓度。

(6)根据所测蛋白浓度，等量调齐蛋白浓度，不足补水。

(7)加入5XLoadingBuffer，置于金属浴95℃，5min。

S2：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)选择电泳槽和预制胶，配置电泳液和转膜液。

(2)取适量体积的样品上样，同时取3μlMaker作对照。

(3)通电，110v电压下进行恒压电泳，70min。

S3：转膜

(1)准备好相应大小的PVDF膜，甲醛激活数秒。

(2)将电泳凝胶边缘部分剪切，转移到转膜夹上，注意正负极。

(3)转膜槽置于冰浴中通电，电流为300mA，通电时间为90min。

S4：封闭

(1)提前配置含0.5％的脱脂牛奶封闭液。

(2)将转膜后的PVDF膜转移到封闭液中，将封闭液放置在摇床内，摇床转速为20r/min，室温封闭120min。

S5：孵育一抗

(1)RBP4特异性抗体，如AntibodyNO.1。

(2)内参照GAPDH特异性抗体，如AntibodyNO.2。

(3)根据抗体说明稀释后，放置在摇床内，摇床转速为20r/min，4℃过夜

S6：孵育二抗

(1)洗膜，摇床转速为70r/min，洗膜3次，每次10min。

(2)根据二抗(AntibodyNO.3和AntibodyNO.4)说明书稀释，置于转速为20r/min的摇床内，室温孵育90min。

S7：显影

(1)洗膜，摇床转速为70r/min，洗膜3次，每次10min。

(2)ECL显影液按照1:1配置，显影。

(3)采集图像。

S8：结果分析

根据内参照GAPDH表达，计算RBP4的灰度值，结果如图1所示，肌少症患者腓肠肌组织中RBP4表达水平明显低于正常人腓肠肌中RBP4表达水平。

实施例2

小鼠运动耐量测量发现腺病毒沉默小鼠腓肠肌RBP4表达后，小鼠跑步距离和跑步时间均缩短。

材料与方法：小鼠腓肠肌原位注射RBP4腺病毒，无关对照腺病毒和生理盐水，小鼠品种均为C57B/6J，每组6只。

S1：根据腺病毒说明书，RBP4腺病毒原位注射小鼠腓肠肌，10μl/点，每侧腓肠肌注射3-5点。注射后3-5天腺病毒作用达到峰值，小鼠进行运动耐量检测。RBP4腺病毒序列如SEQNO.1所示。

S2：使用小鼠跑步机测量小鼠运动耐量，包括运动距离和运动时间。小鼠跑步机运行速度从8m/min开始，每4min增加2m/min。履带的倾斜角度从0°开始，每4min增加1°，由于跑步机的限制而保持在14°。在运动耐量评估之前，对小鼠进行适应性训练，跑步机运行速度为8m/min，履带的倾斜角度0°，运动时间为2min。采用统一标准，当小鼠力竭时记录小鼠跑步距离和时间。

S3：统计分析所得数据，结果如图2所示，RBP4腺病毒沉默组小鼠的跑步距离和跑步时间明显小于对照组小鼠。

实施例3

实时荧光定量PCR检测法发现RBP4随C2C12成肌细胞分化而逐渐升高。

材料与方法：分别从分化0天，2天，4天的C2C12细胞中抽提总RNA，1μgRNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测。RBP4正向引物序列如SEQNO.1所示，反向引物序列如SEQNO.2所示。内参照GAPDH正向引物序列如SEQNO.3所示，反向引物序列如SEQNO.4所示。

S1：实时荧光定量PCR反应体系为(PCR检测方法是两个独立反应分别检测RBP4和内参照GAPDHmRNA的表达，因而下面的正向引物和反向引物分别为各自反应中所使用的特异性引物)：

SYBR Green PCR Master Mix(2X)	5μl
		特异性正向引物(10μM)	0.5μl
特异性反向引物(10μM)	0.5μl
		无酶水	2μl
cDNA产物	2μl
		总计	10μl

S2：实时荧光定量PCR反应程序

S3：反应结束后，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线后，根据CT值用内参基因GAPDH标准化计算RBP4的相对定量值，计算C2C12细胞分化2天，4天与C2C12细胞分化0天的的RBP4表达量差异。结果如图3所示，RBP4随着C2C12细胞分化程度逐渐升高。

本发明通过WesternBlot检测检测发现RBP4在肌少症患者肌肉组织中表达量低(图1)，提示RBP4可能在肌少症的发生发展中有意义。进一步研究发现，沉默小鼠骨骼肌RBP4表达后，小鼠的运动耐量下降。更深入研究显示，RBP4随着C2C12成肌细胞分化而逐渐增加，表明RBP4对骨骼肌细胞的分化或成熟起到积极作用。本发明操作简单，快速而稳定。本发明提出RBP4可作为肌少症的新治疗靶标，为临床肌少症患者的预测和诊断提供有力的依据，以及提供治疗参考价值。

序列表

Sequence 1(SEQ NO.1)

RBP4腺病毒序列：

ATTCGGAAGTGTGTGCAGACATGGTGGGTTCAAGAGACCCACCATGTCTGCACACACTTCCTTTTTTG

Sequence 2(SEQ NO.2)

RBP4正向引物：AGTCAAGGAGAACTTCGACAAGG

Sequence 3(SEQ NO.3)

RBP4反向引物：CAGAAAACTCAGCGATGATGTTG

Sequence 4(SEQ NO.4)

内参照GAPDH正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

Sequence 5(SEQ NO.5)

内参照GAPDH反向引物：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

抗体表

Antibody NO.1

Anti-RBP4抗体：Abcam，ab10919

Antibody NO.2

Anti-GAPDH抗体：Proteintech,60004-1-Ig

Antibody NO.3

Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody:Cell Signaling Technology,#7074

Antibody NO.4

Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody:Cell Signaling Technology,#7076

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。