Mln4924在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用
阅读说明：本技术 Mln4924在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用 (Application of MLN4924 in preparation of choroidal neovascularization therapeutic drug ) 是由 刘晓娟 朱曼辉 孙晓雷 李爱红 郭爱松 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体是MLN4924在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供了MLN4924在脉络膜新生血管治疗中的应用,解决了现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射及部分患者无应答的问题。并且MLN4924为腹腔注射给药的方式,避免了眼内多次注射及其可能带来的副作用如眼内炎。经动物实验,MLN4924在降低CNV的渗出、面积及体积方面的效果优于目前临床使用的抗VEGF药物雷珠单抗。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to application of MLN4924 in preparation of a choroidal neovascularization therapeutic drug. The invention has the advantages that: the invention provides application of MLN4924 in choroidal neovascularization treatment, and solves the problems that in the prior art, anti-VEGF medicines are repeatedly injected into eyes and partial patients do not respond. And MLN4924 is an intraperitoneal injection administration mode, so that multiple intraocular injections and possible side effects such as endophthalmitis are avoided. Animal experiments show that the effect of MLN4924 on reducing CNV exudation, area and volume is superior to that of ranibizumab serving as an anti-VEGF medicament clinically used at present.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种类泛素化修饰抑制剂—MLN4924在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种发生于50岁以上老人的进展性和退行性眼病。根据病理变化，AMD分为干性和湿性两大类。干性AMD以视网膜色素上皮和其上的光感受器细胞地图样萎缩为特征，湿性AMD则主要导致病理性的脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)，以视网膜中心区域，也就是黄斑下异常血管生长为特征，这些异常血管会突破Bruch’s膜(Bruch’s membrane)，深入视网膜下的色素上皮区域，导致渗出、出血、视网膜水肿、色素上皮脱落和纤维化疤痕形成，从而引起视力缺损。AMD是发达国家造成老人失明的首要原因，降低了AMD患者的生活质量。
研究者在2016年发表的相关文献中选取25篇，进行Meta分析，结果显示1999年-2015年45-49岁年龄段的中国人群中AMD的发病率为2.44％(95％可信区间＝1.85-3.22)，85-89岁年龄段中AMD的发病率为18.98％(95％可信区间＝15.05-23.66)，提示AMD的发生与年龄增长呈正相关。随着我国人口老龄化及预期寿命增加的趋势，我国AMD的发生率也将增长。虽然湿性AMD患者只占所有AMD患者的10％，但湿性AMD引起的失明占AMD患者失明的90％，因此湿性AMD更加引起研究者的关注。
目前治疗湿性AMD的方法主要是抗血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)药物，如阿柏西普(aflibercept，AFL)和雷珠单抗(ranibizumab，RAN)，但这些药物不是对所有AMD患者均有效，一部分患者治疗无反应(约10％)，且治疗一段时间(约两年)之后，患者开始产生耐药性，此外，抗VEGF药物需要多次反复进行玻璃体腔内注射，增加了患者的经济负担，且会引起多种眼内及系统性副反应，如眼内炎、眼内出血和中风。因此研究CNV更好的治疗方法迫在眉睫。
神经前体细胞表达的发育下调蛋白8(neural precursor cell-expresseddevelopmentally downregulated protein 8，Nedd8)是一种类泛素化修饰相关的分子，与Cullin-RING连接酶(Culling-RING ligases，CRLs)相互作用，介导蛋白质分子的蛋白酶体降解。MLN4924是一种E1NEDD8活化酶(E1NEDD8-activating enzyme，NAE)的抑制剂，阻碍Nedd8和Nedd8活化酶之间的结合，抑制CRLs的活性，从而调节下游蛋白质分子的蛋白酶体降解。之前的研究表明MLN4924能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，如三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)和多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，并在脊髓缺血-再灌注损伤中显示出了神经保护作用(Misra S,Zhang X,Wani NA,Sizemore S,Ray A.BothBRCA1-wild type and-mutant triple-negative breast cancers show sensitivity tothe NAE inhibitor MLN4924which is enhanced upon MLN4924and cisplatincombination treatment.Oncotarget 2020；11(8):784-800.El-Mesery M,Rosenthal T,Rauert-Wunderlich H,Schreder M,Stuhmer T,Leich E,Schlosser A,EhrenschwenderM,Wajant H,Siegmund D.The NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924sensitizesa TNFR1(+)subgroup of multiple myeloma cells for TNF-induced cell death.CellDeath Dis 2019；10(8):611.Yu S,Xie L,Liu Z,Li C,Liang Y.MLN4924Exerts aNeuroprotective Effect against Oxidative Stress via Sirt1in Spinal CordIschemia-Reperfusion Injury.Oxid Med Cell Longev 2019；2019:7283639.)。然而MLN4924对于CNV的作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类泛素化修饰抑制剂—MLN4924在脉络膜新生血管治疗中的应用，以解决现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射及无应答的问题。
本发明的第一方面，提供MLN4924在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。
进一步的，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管(CNV)的渗出的药物中的应用。
进一步的，所述的应用为在制备降低脉络膜新生血管(CNV)的损伤面积的药物中的应用。
进一步的，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管(CNV)的体积的药物中的应用。
进一步的，所述的应用为在制备抑制脉络膜新生血管(CNV)诱导的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的药物中的应用。
本发明的第二方面，提供MLN4924在制备抑制/减少脉络膜新生血管病变部位VEGF表达的药物中的应用。
进一步的，所述的病变部位为脉络膜组织。
本发明的第三方面，提供一种脉络膜新生血管治疗药物，所述的药物以MLN4924作为活性成分。
本发明的第四方面，提供MLN4924在制备脉络膜新生血管抑制剂中的应用。
本发明的第五方面，提供MLN4924在制备脉络膜新生血管诱导的VEGF蛋白水平上调抑制剂中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明提供了MLN4924在脉络膜新生血管治疗中的应用，解决了现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射及部分患者无应答的问题。
2、MLN4924为腹腔注射给药的方式，避免了眼内多次注射及其可能带来的副作用如眼内炎。
3、MLN4924在降低CNV的渗出、面积及体积方面的效果优于目前临床使用的抗VEGF药物雷珠单抗。
附图说明
图1.眼底荧光造影显示MLN4924组CNV渗出面积的变化。A图显示实验设计；B图为眼底荧光造影(fundus fluorescein angiography，FFA)的代表图；C图为使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。
图2.吲哚菁绿血管造影显示MLN4924组CNV损伤区域的变化。A图为吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)的代表图；B图为CNV区域的统计。
图3.脉络膜铺片及荧光染色显示MLN4924组CNV体积的变化。A图为脉络膜铺片后，运用鬼笔环肽(phalloidin)及同工凝集素-B4(isolectin-B4)抗体荧光双标；B图为CNV体积的统计。
图4.ELISA及WB显示MLN4924组VEGF蛋白水平的变化。A图为ELISA检测小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平。***P<0.005，与正常组相比较。###P<0.005，与CNV 7天组相比较。B图WB检测小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平。C图为VEGF条带与GAPDH条带灰度比值的统计。***P<0.005，与正常组相比较。###P<0.005，与CNV 7天组相比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
(1)小鼠CNV模型的建立
氪激光诱导CNV小鼠，用0.5％戊巴比妥腹腔注射麻醉，复方托吡卡胺散瞳，手持式灯光照射，保持小鼠体温。将小鼠实验眼固定于裂隙灯前，在1％甲基纤维素的辅助下，将5.4mm手持式接触镜置于角膜前，用氪离子激光机，激光波长647.1nm，功率300mw，光斑直径50μm，曝光时间0.05秒。围绕视盘并在距视盘2个***直径位置等距离光凝，共计4个点，分别位于3、6、9、12点处，以见到有气泡产生提示Bruch膜被击破，无玻璃体出血为光凝成功标准。
(2)小鼠腹腔注射
CNV组小鼠随机分为五组：CNV 7天组(不做任何注射)、生理盐水(normal saline，NS)注射组、MLN4924低剂量组(50mg/kg/d)、MLN4924中剂量组(100mg/kg/d)和MLN4924高剂量组(200mg/kg/d)，其中MLN4924组均为每天腹腔注射一次，从激光造模之后开始持续7天。CNV组C57BL/6小鼠称重后，右手持1ml的注射器配合4号针头，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。NS组注射同等体积的无菌NS。
(3)小鼠玻璃体腔注射雷珠单抗(ranibizumab，RAN)
取CNV组C57BL/6小鼠称重后，4.3％水合氯醛(0.01ml/kg，腹腔注射)麻醉后使用复方托吡卡胺散大两侧瞳孔，生理盐水湿润眼表，左氧氟沙星滴眼，使小鼠侧卧在手术台，在解剖显微镜下拨开眼睑，暴露角巩膜缘。使用10-0针在角巩膜缘后1mm做切口，33G注射器刺入玻璃体腔，注射0.5μl RAN(Lucentis，Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland)。术后红霉素眼膏涂眼预防感染。
(4)小鼠眼底血管造影
C57BL/6小鼠随机分为七组：正常对照组、CNV 7天组、CNV 7天+NS组、CNV 7天+MLN4924低剂量组、CNV 7天+MLN4924中剂量组、CNV7天+MLN4924高剂量组和CNV 7天+RAN组。小鼠用0.5％戊巴比妥腹腔注射处死，复方托吡卡胺散瞳。将10％荧光素钠用注射用水稀释成2％荧光素钠或者吲哚菁绿试剂，经腹腔注射0.3ml，分别进行眼底荧光造影(fundusfluorescein angiography，FFA)或者吲哚菁绿血管造影(indocyanine greenangiography，ICGA)。注射后100-140秒开始用共焦激光视网膜断层扫描仪记录造影过程。记录时间为30min。CNV分级：0级为无渗出，1级为轻度渗出，2a级为中度渗出，2b级为重度渗出。使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。研究人员通过徒手绘制工具在ICGA渗出的区域画出边缘，应用ImageJ软件的感兴趣区域(region of interest，ROI)管理器计算出像素区域。之后根据像素与微米之间的比例(我们所使用的比例为0.5249)将像素区域转化为微米的平方(microns2，mm2)，得到最终的CNV面积。
(5)脉络膜铺片及免疫荧光染色
C57BL/6小鼠随机分为五组：正常对照组、CNV 7天组、CNV 7天+NS组、CNV 7天+200mg/kg/d MLN4924腹腔注射组和CNV 7天+RAN玻璃体腔注射组。将小鼠用过量0.5％戊巴比妥腹腔注射处死，立即摘出眼球，放入4％多聚甲醛中快速固定1小时。在解剖显微镜下，沿赤道部环行剪开巩膜，去除眼前节，小心分离视网膜神经上皮层，获得视网膜-视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)-脉络膜复合体眼杯，用冷ICC缓冲液反复冲洗眼杯。在暗光下，将1μg/μl鬼笔环肽(phalloidin)和同工凝集素-B4(isolectin-B4)抗体以1:150的稀释度加入ICC缓冲液中。充分混匀后，分别移入装有眼杯的EP管中进行染色，避光置于4℃冰箱过夜。常温下复温2小时，再用ICC缓冲液充分冲洗眼杯。将视网膜-RPE-脉络膜复合体平铺于载玻片上，沿视盘方向做4个放射状切口，封片用荧光显微镜观察。CNV的三维图像用ZEN软件(Zeiss，德国)生成，CNV的体积用Imaris软件(瑞士)进行测量。
(6)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
运用ELISA检测小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平。解剖每个小鼠的视网膜-RPE-脉络膜组织，并在补充有蛋白酶抑制剂的100μl裂解缓冲液中匀浆。将样品在4℃下以12,000rpm的速度离心10分钟，并收集上清液。在使用Bio-Rad方法检测蛋白质浓度后，将样品置于相应的ELISA试剂盒中，根据制造商的说明测定VEGF的水平。在自动酶标仪上读取450nm处的吸光度。所有测量均一式三份进行，并根据标准曲线计算组织样品浓度并校正蛋白质浓度。
(7)蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)
用组织裂解缓冲液(含10mM EDTA，1％Triton-X100的PBS)收集小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织蛋白提取物。使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒确定X-100和蛋白酶抑制剂混合物的浓度。蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用含0.1％Tween 20(TBST)的5％脱脂牛奶封闭1小时。一抗在以下稀释度下于4℃孵育过夜：抗VEGF抗体(1:500)和抗GAPDH抗体(1:1000)，然后与辣根过氧化物酶二抗偶联的抗体(1:1000)在37℃下孵育1小时。免疫复合物通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)方法显影。随后，使用ImageJ软件进行半定量分析。相对于GAPDH的水平，定量VEGF的相对蛋白水平。
(8)统计学分析
各数据表示为至少三个独立实验的均值±均值的标准误(standard error ofthe mean，SEM)。两组数据之间的比较运用双侧Student-t检验，而多组数据之间的比较用单因素方差分析及Bonferroni事后检测。P<0.05为具有统计学差异。
实验结果：
为了检测MLN4924在脉络膜新生血管中的治疗作用，我们建立了激光诱导的小鼠CNV模型，MLN4924腹腔注射，并用目前使用最为广泛的抗VEGF药物雷珠单抗玻璃体腔注射作为阳性对照。
眼底荧光造影显示MLN4924组CNV渗出面积的变化(图1)。A图显示实验设计，实验首日，小鼠CNV模型建立，并随即进行MLN4924腹腔注射，第七天处死小鼠，进行后续实验。小鼠随机分为正常组、CNV 7天组、CNV7天+NS腹腔注射组(vehicle组)、CNV7天+50mg/kg/dMLN4924腹腔注射组、CNV7天+100mg/kg/d MLN4924腹腔注射组、CNV7天+200mg/kg/dMLN4924腹腔注射组和CNV7天+RAN玻璃体腔注射组。B图为眼底荧光造影(fundusfluorescein angiography，FFA)的代表图。图像显示MLN4924及RAN组CNV损伤区域渗出减少。C图为使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。与CNV 7天组相比，200mg/kg/dMLN4924腹腔注射和RAN玻璃体腔注射组0级和1级渗出增加，而2a和2b级渗出减少。
小鼠眼底荧光造影FFA表明，200mg/kg/d MLN4924腹腔注射显著减少CNV区域的渗出，且效果优于雷珠单抗(图1B，1C)。
小鼠随机分为正常组、CNV 7天组、CNV7天+NS腹腔注射组(vehicle组)、CNV7天+50mg/kg/d MLN4924腹腔注射组、CNV7天+100mg/kg/d MLN4924腹腔注射组、CNV7天+200mg/kg/d MLN4924腹腔注射组和CNV7天+RAN玻璃体腔注射组(图2)。A图为吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)的代表图。B图为CNV区域的统计，显示相对于CNV7天组，MLN4924及RAN组CNV的区域减少，尤以200mg/kg/d MLN4924腹腔注射组减少幅度最为明显。**P<0.01，***P<0.005，与CNV 7天组相比较。
小鼠眼底荧光造影ICGA表明，200mg/kg/d MLN4924腹腔注射显著降低CNV区域的面积，且效果优于雷珠单抗(图2A，2B)。
小鼠随机分为5组：正常组、CNV 7天组、CNV7天+NS腹腔注射组(vehicle组)、CNV7天+200mg/kg/d MLN4924腹腔注射组和CNV7天+RAN玻璃体腔注射组(图3)。A图为脉络膜铺片后，运用鬼笔环肽(phalloidin)及同工凝集素-B4(isolectin-B4)抗体荧光双标。B图为CNV体积的统计，显示200mg/kg/d MLN4924腹腔注射及RAN玻璃体腔注射组CNV的体积减少。***P<0.005，与CNV 7天组相比较。
鬼笔环肽(phalloidin；肌动蛋白标记)和同工凝集素(isolectin-4，血管内皮细胞标记)荧光双标显示200mg/kg/d MLN4924腹腔注射减少小鼠CNV的体积，且效果优于雷珠单抗。
小鼠随机分为5组：正常组、CNV 7天组、CNV7天+NS腹腔注射组(vehicle组)、CNV7天+200mg/kg/d MLN4924腹腔注射组和CNV7天+RAN玻璃体腔注射组(图4)。A图ELISA检测小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平。***P<0.005，与正常组相比较。###P<0.005，与CNV 7天组相比较。B图WB检测小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平。C图为VEGF条带与GAPDH条带灰度比值的统计。***P<0.005，与正常组相比较。###P<0.005，与CNV 7天组相比较。与正常组相比，CNV 7天组中VEGF蛋白水平上调，而200mg/kg/d MLN4924腹腔注射或者RAN玻璃体腔注射能够抑制CNV诱导上调的VEGF蛋白水平。
200mg/kg/d MLN4924腹腔注射减少小鼠视网膜-RPE-脉络膜组织中VEGF的蛋白水平，其效果与雷珠单抗相似。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。