阅读说明：本技术 6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用 (Application of 6 alpha-ethyl-23 (S) -methyl cholic acid in preparation of medicine for treating peripheral nerve demyelinating diseases ) 是由 刘晓宇 孙诚 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。本发明提供了激动剂6α-乙基-23(S)-甲基胆酸的新用途,且效果好；研究机理的方法简便,准确。(The invention discloses application of 6 alpha-ethyl-23 (S) -methyl cholic acid in preparing a medicament for treating peripheral nerve demyelinating diseases. The invention provides a new application of an agonist 6 alpha-ethyl-23 (S) -methyl cholic acid, and the effect is good; the method for researching the mechanism is simple, convenient and accurate.)

6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病 的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种6α-乙基-23(S)-甲基胆酸的新用途。

背景技术

目前治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物，在治疗效果等方面存在一定缺陷，需要进一步寻找开发新的药物。6α-乙基-23(S)-甲基胆酸的作用尚未有可以制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种效果好的6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：

一种6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。

其机理的研究方法包括下列步骤：

(1)细胞处理

实验对象为原代雪旺细胞；取出生一天的SD大鼠坐骨神经组织，然后通过胰酶、胶原酶消化的方法获得原代细胞，并且采用阿糖胞苷及HRG因子得到纯度大于90％的雪旺细胞；纯化好的细胞种植在六孔板中，分别设置不同的处理组别：对照组，cAMP阳性对照组，处理浓度为1mM；6α-乙基-23(S)-甲基胆酸处理组，处理浓度分别为5、10、25、125μM；及cAMP及6α-乙基-23(S)-甲基胆酸双处理组；处理24小时后收样，实验重复三次；

(2)雪旺细胞总RNA提取及基因表达检测

使用Invitrogen公司Trizol试剂提取雪旺细胞的总RNA，再用Roche公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；采用Roche公司的SYBR Green Supermix来做基因表达分析，仪器为Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System；分析结果采用2^-△△Ct法计算mRNA水平；以18S看家基因来校准mRNA的水平；所使用的引物序列如下：

18S rRNA正向引物：AGCTCCAATAGCGTATATTAAAG

18S rRNA负向引物：CGGTCCTATTCCATTATTCCTA

Krox20正向引物：TGGGTTTAAGTATGGCTGTATA

Krox20负向引物：AGTTAGTGGTTCTGTGTTAGA

MPZ正向引物：GGATAAGAAATAGCGGTTAGC

MPZ负向引物：TTGAGGCTGGTTCTACTG

OCT6正向引物：TTCCTAATTTCTGACCCATCT

OCT6负向引物：GCAATAAAGATACAAAGAGAATGG

(3)雪旺细胞蛋白提取及蛋白表达检测

将培养雪旺细胞的六孔板中每孔都放入加有预冷细胞蛋白裂解液：25mM Tris-HCl，pH 7.4；100mM NaF；50mM Na₄P₂O₇；10mM Na₃VO₄；10mM EGTA；10mM EDTA；1％NP-40；10μg/ml Leupeptin；10μg/ml Aprotinin；2mM PMSF；20nM Okadaic acid；将细胞全部转移到预冷的1.5ml EP管中，并在冰上充***解20分钟，随后冷冻离心13000rpm，4℃，20min；离心后将上清转至新的1.5ml离心管中；样品蛋白含量用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒来测定，根据所得结果将所有样品的蛋白质浓度调至同一水平，加入上样缓冲液并混匀，于100℃煮沸5min，冷却至室温用于Western blot分析；

将提取的总蛋白质样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上；用含5％牛血清白蛋白的TBST缓冲液封闭转印结束的PVDF膜1小时；封闭后的PVDF膜与特异性一抗孵育4℃过夜；随后用TBST清洗PVDF膜三次，再与相应的二抗室温作用1小时，之后再用TBST清洗PVDF膜三次；最后PVDF膜用化学发光反应体系反应，并曝光至X光胶片；各蛋白表达水平的定量用软件Quantity-One(Bio-Rad)分析；

(4)体内动物模型的建立

动物模型采用出生一天的红皮鼠；取注射过6α-乙基-23(S)-甲基胆酸的红皮鼠的坐骨神经组织用于后续的研究；对照组采用注射PBS的红皮鼠；每组实验有6个生物学重复；

(5)透射电镜形态学分析

取上述不同组别的坐骨神经，并横切组织1-2mm后浸泡在含4％多聚甲醛、2.5％戊二醛混合液中24小时；将组织样品放置在1％的四氧化锇中固定1小时，并包埋在Epon812环氧树脂中；切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并在80KV的透射电子显微镜下观察；g比率是轴突平均内径与纤维平均直径的比值，用Image J软件进行分析计算；

(6)行为学分析

转棒实验采用加速旋转棒装置；在试验前，让小鼠在试验室中习惯30分钟；通过摆动小鼠，将小鼠放在旋转木马上，并在旋转木马上以3分钟和5分钟的间隔以加速模式训练3天；以恒定速度重复训练，直到小鼠能够在杆上停留至少300秒；对于正式试验，将小鼠置于旋转鼓上，并将旋转木马设置为加速模式，即在5分钟内以4至40转/分的速度加速；在测量下落之前，记录在杆上移动的时间；

(7)结果

结果表明6α-乙基-23(S)-甲基胆酸处理可显著促进早期生长因子20和八聚体结合转录因子6基因的蛋白表达；检测了p-AMPK，p-S6K的表达，结果表明6α-乙基-23(S)-甲基胆酸处理可显著增加p-S6K活性且降低p-AMPK的活性，即6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)促进坐骨神经髓鞘的发育形成；行为学实验结果显示，6α-乙基-23(S)-甲基胆酸处理小鼠转棒平衡能力优于野生型小鼠；透射电镜结果显示，与野生型小鼠相比，皮下注射INT777后引起小鼠坐骨神经髓鞘厚度增加，促进髓鞘的发育。

本发明提供了激动剂6α-乙基-23(S)-甲基胆酸的新用途，且效果好；研究机理的方法简便，准确。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)核酸水平上激活雪旺细胞髓鞘MPZ基因的表达示意图。

图2是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)核酸水平上激活雪旺细胞髓鞘Oct6基因的表达示意图。

图3是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)核酸水平上激活雪旺细胞髓鞘Krox20基因的表达示意图。

图4是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)在蛋白水平激活雪旺细胞髓鞘相关基因的表达示意图。

图5是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)激活p-AMPK/p-s6k信号通路示意图。

图6是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)增强小鼠的运动平衡能力(转棒测试)示意图。

图7是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)促进小鼠坐骨神经髓鞘的发生发育(电镜)示意图。

图8是6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)对小鼠坐骨神经髓鞘发育的影响(g比率)示意图。

具体实施方式

一种6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。

其机理的研究方法包括下列步骤：

一、实验步骤

1、细胞处理

实验对象为原代雪旺细胞。我们将出生一天的SD大鼠坐骨神经组织快速取出，然后通过胰酶、胶原酶消化的方法获得原代细胞，并且采用阿糖胞苷及HRG因子得到纯度大于90％的雪旺细胞。纯化好的细胞种植在六孔板中，分别设置不同的处理组别：对照组，cAMP阳性对照组(处理浓度为1mM)，6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)处理组(处理浓度分别为5、10、25、125μM)及cAMP及6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)双处理组。处理24小时后收样，实验重复三次。

2、雪旺细胞总RNA提取及基因表达检测

使用Invitrogen公司Trizol试剂提取雪旺细胞的总RNA，再用Roche公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。采用Roche公司的SYBR Green Supermix来做基因表达分析，仪器为Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System。分析结果采用2^-△△Ct法计算mRNA水平。以18S看家基因来校准mRNA的水平。所使用的引物序列如下：

18S rRNA正向引物：AGCTCCAATAGCGTATATTAAAG

18S rRNA负向引物：CGGTCCTATTCCATTATTCCTA

Krox20正向引物：TGGGTTTAAGTATGGCTGTATA

Krox20负向引物：AGTTAGTGGTTCTGTGTTAGA

MPZ正向引物：GGATAAGAAATAGCGGTTAGC

MPZ负向引物：TTGAGGCTGGTTCTACTG

OCT6正向引物：TTCCTAATTTCTGACCCATCT

OCT6负向引物：GCAATAAAGATACAAAGAGAATGG

3、雪旺细胞蛋白提取及蛋白表达检测

将培养雪旺细胞的六孔板中每孔都放入加有预冷细胞蛋白裂解液(25mM Tris-HCl，pH 7.4；100mM NaF；50mM Na₄P₂O₇；10mM Na₃VO₄；10mM EGTA；10mM EDTA；1％NP-40；10μg/ml Leupeptin；10μg/ml Aprotinin；2mM PMSF；20nM Okadaic acid)，将细胞全部转移到预冷的1.5ml EP管中，并在冰上充***解20分钟(其间在振荡器上震荡几次，益于裂解)，随后冷冻离心(13000rpm，4℃)20min，离心后将上清转至新的1.5ml离心管中。样品蛋白含量用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒来测定，根据所得结果将所有样品的蛋白质浓度调至同一水平，加入上样缓冲液并混匀，于100℃煮沸5min，冷却至室温用于Western blot分析。

将提取的总蛋白质样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上。用含5％牛血清白蛋白的TBST(Tris-buffered saline solution/Tween)缓冲液封闭转印结束的PVDF膜1小时。封闭后的PVDF膜与特异性一抗孵育过夜(4℃)。随后用TBST清洗PVDF膜三次，再与相应的二抗室温作用1小时，之后再用TBST清洗PVDF膜三次。最后PVDF膜用化学发光反应体系(chemiluminescence assay system，Pierce)反应，并曝光至X光胶片(Kodak)。各蛋白表达水平的定量用软件Quantity-One(Bio-Rad)分析。所有的抗体均购自于Cell Signaling Technology公司。

4、体内动物模型的建立

动物模型采用出生一天的SD大鼠(也称做红皮鼠)，本实验通过在红皮鼠皮下注射6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)(浓度为10ug/g/d)隔天注射，六天后取坐骨神经组织用于后续的研究。对照组在红皮鼠皮下注射PBS，处理时间和浓度和处理组保持一致，每组实验有6个生物学重复。

5、透射电镜形态学分析

上述不同组别的坐骨神经快速取出，并横切组织1-2mm后浸泡在含4％多聚甲醛、2.5％戊二醛混合液中24小时。将组织样品放置在1％的四氧化锇中固定1小时，并包埋在Epon812环氧树脂中。切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并在80KV的透射电子显微镜(日本，JEO有限公司)下观察。g比率(g-ratio)是轴突平均内径与纤维平均直径(含髓鞘)的比值，用Image J软件进行分析计算。

6、行为学分析

为了进一步明确6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)对坐骨神经髓鞘再生及运动恢复的影响，我们进行了转棒行为学实验检测。

转棒实验采用的是加速旋转棒装置(LE8500型，Pan实验室)，在试验前，让小鼠在试验室中习惯30分钟。通过轻轻摆动小鼠，将小鼠轻轻放在旋转木马上，并在旋转木马上以3分钟和5分钟的间隔以加速模式(4-40转/分)训练3天。以恒定速度(16转/分)重复训练，直到小鼠能够在杆上停留至少300秒。对于正式试验，将小鼠置于旋转鼓上，并将旋转木马设置为加速模式，即在5分钟内以4至40转/分的速度加速。在测量下落之前，记录在杆上移动的时间。

二、实验结果

TGR5(G protein-couple bile acid receptor 1)是G蛋白偶联受体，主要表达于褐色脂肪、肝脏和肌肉。在肥胖小鼠中TGR5能够激发能量消耗，降低饮食诱导的肥胖发生概率。已有研究指出，在肥胖小鼠中TGR5可诱导肠胰高血糖素类肽(GLP-1)表达的升高，改善肝脏及胰腺功能，增加葡萄糖耐受性，同时引起细胞内ATP/ADP比值升高。有报道指出，GLP-1通过激活MAPK/ERK能量代谢途径促进周围神经髓鞘的形成。因此，TGR5能够维持真核细胞的ATP平衡，激发能量代谢，使细胞代谢趋于生理平衡。

6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)是TGR5的激活剂，特异性增加TGR5的活性。已有研究报道指出激动剂INT-777可以减轻小鼠急性胰腺炎胰腺腺泡细胞坏死，还能够对Aβ1-42诱导的小鼠认知障碍、神经炎症、细胞凋亡和突触功能障碍起到保护作用。也有报道指出6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)能够诱发生物体内cAMP的表达，而cAMP能够促进髓鞘的发生发育。因此，我们探讨了6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)与坐骨神经髓鞘的形成之间的关系。

周围神经系统在机体内分布广泛且起到靶器官与中枢神经系统进行信号传递的作用。神经轴突的髓鞘化是神经系统执行功能的基础保障，髓鞘化过程异常会导致多种疾病的发生。周围神经损伤是临床常见病征，尤其是交通事故、战争、地震等意外创伤导致的损伤处神经元轴突脱髓鞘，神经冲动无法传递而引起的疾病。其中，坐骨神经是研究周围神经发育与再生最主要的也是最直观的材料。因此，我们都采用坐骨神经来进行后续实验。

为了研究6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777，CAS：1199796-29-6)是否可以促进体内周围神经髓鞘的形成，我们利用体外cAMP诱导雪旺细胞成髓鞘模型，用TGR5的激动剂6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)处理原代细胞(处理时间和方法详见上文)。早期生长因子20(krox20)、八聚体结合转录因子6(oct6)和髓磷脂蛋白(MPZ)是髓鞘发育形成过程中的关键基因，我们结果表明浓度为25、125μM的6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)处理后可以有效激活这三个基因的表达(图1，2，3)。因此，我们后续实验都采用的是25μM浓度处理。随后，我们也检测了这几个基因的蛋白表达水平。结果表明6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)处理可显著促进早期生长因子20(krox20)和八聚体结合转录因子6(oct6)基因的蛋白表达(图4)。众所周知MAPKs途径是一条经典的调控髓鞘形成的信号通路，影响外周神经髓鞘的发育进程。因此我们检测了p-AMPK，p-S6K的表达。我们的结果表明6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)处理可显著增加p-S6K活性且降低p-AMPK的活性(图5)，即6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)促进坐骨神经髓鞘的发育形成。为了进一步证实6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)对坐骨神经髓鞘发育的影响，我们在动物体内进行了相关实验。行为学实验结果显示，6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)处理小鼠转棒平衡能力优于野生型小鼠(图6)。透射电镜结果显示，与野生型小鼠相比，皮下注射INT777后引起小鼠坐骨神经髓鞘厚度增加，促进髓鞘的发育(图7，8)。

以上结果说明TGR5的激动剂6α-乙基-23(S)-甲基胆酸(INT777)可促进坐骨神经髓鞘的发育，促进运动平衡能力，对周围神经脱髓鞘类疾病有积极的治疗作用。