Traf3通过抑制il-17信号防治关节炎
阅读说明：本技术 Traf3通过抑制il-17信号防治关节炎 (TRAF3 for preventing and treating arthritis by inhibiting IL-17 signal ) 是由 张晓玲 胡国立 张宁 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于：活性成分选自：(a).TNF受体相关因子3(TRAF3)；(b).前体,前体能在宿主内加工成(a)中的TRAF3；(c).多核苷酸,的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中的前体,并加工形成(a)中的TRAF3；(d).表达载体,表达载体含有(a)中的TRAF3、或(b).中的前体、或(c)中的多核苷酸；上述活性成分的用途：(a).活性成分用于抑制IL-17信号；(b).活性成分用于制备防治关节炎的药物。(The invention provides an application of an active ingredient, which is characterized in that: the active ingredients are selected from: (a) TNF receptor-related factor 3(TRAF 3); (b) a precursor capable of being processed in a host to TRAF3 in (a); (c) a polynucleotide capable of being transcribed by a host to form the precursor in (b) and processed to form TRAF3 in (a); (d) an expression vector comprising TRAF3 in (a), or the precursor in (b), or the polynucleotide in (c); the application of the active ingredients comprises the following steps: (a) the active ingredient is for inhibiting IL-17 signaling; (b) the active ingredient is used for preparing a medicament for preventing and treating arthritis.)
技术领域
本发明涉及活性因子，具体地，涉及TRAF3通过抑制IL-17信号防治关节 炎。
背景技术
关节炎是最常见的关节疾病，最为常见的有骨关节炎(OA)和类风湿关节 炎(RA)，其特征是软骨破坏、软骨下骨硬化和滑膜炎症。这些异常主要是由于 关节软骨的合成代谢和分解代谢之间的不平衡，特别是分解代谢的增加。促炎 细胞因子,关节炎的重要介质,如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF- α)和白细胞介素-6(IL-6)在关节软骨中广泛研究。IL-17是多种自身免疫 性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、胶原诱导关节炎(CIA)、炎症性肠 病(IBD)发病机制中重要的促炎因子。IL-17是一种主要的炎症驱动细胞因子， 通过诱导和维持炎症细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的产生发挥其功能。IL-17也可以协同作用与IL-1β或TNF-α进一步诱导促炎基因。在类风湿性关 节炎(RA)滑膜成纤维细胞IL-17已经证明重要的诱发炎性因子白介素的产生和 白细胞介素-8(IL-8)通过NF-κB和pi3激酶/Akt信号通路。在OA中，IL-17 是一个调控IL-1β和TNF-α的上游因子。在关节软骨和软骨细胞中，IL-17通 过NF-κB和MAPK信号通路上调一些软骨分解代谢因子的mRNA表达如白细胞介 素6(IL-6)，一氧化氮(NO)和基质金属蛋白酶(MMPs)。在OA病理生理过程中， IL-17在软骨细胞中也比在成纤维细胞中更活跃。有趣的是，在抗TNFα治疗的 病人体内Th17细胞显著增加。因此，在实验性关节炎中同时阻断TNF-α和IL-17 比单一治疗更有效。因此，阻断IL-17通路是一种有前途的防治关节炎软骨退 变的方法，可以单独使用或和目前临床上关节炎治疗方法协同使用。
肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)是一类细胞内适应蛋白家族，介导多种 细胞表面受体的下游信号传递，从而控制细胞防御机制的早期阶段，抵抗入侵 的细菌和病毒病原体。这个家族的大多数成员，包括TRAF2、TRAF5和TRAF6， 都已经被深入研究过，然而对TRAF3的研究仍然很少。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，TRAF3的作用和机制进行了研究，发现TRAF3应 当能成为改善关节炎软骨退变的潜在治疗靶点。
本发明提供了一种活性成分的用途，其特征在于：
上述活性成分选自：
(a).TNF受体相关因子3(TRAF3)；
(b).前体，上述前体能在宿主内加工成(a)中上述的TRAF3；
(c).多核苷酸，上述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中上述的前体,并 加工形成(a)中上述的TRAF3；
(d).表达载体，上述表达载体含有(a)中上述的TRAF3、或(b).中上述的 前体、或(c)中上述的多核苷酸；
所述活性成分的用途：
(a).所述活性成分用于抑制IL-17信号；
(b).所述活性成分用于制备防治关节炎的药物。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述活性 成分用于制备治疗、预防、改善或缓解，关节炎导致的滑膜炎症、软骨损伤或 软骨退变的药物。
上述活性成分为有效量的用量标准，一般来说根据药物的制剂形式可在常 规配方量上进行调整。如：占总制剂用量的10-8-100％。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述药物 为经胃肠道给药剂型或经胃肠道以外给药途径剂型。
上述经胃肠道给药剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、 混悬剂；
上述经胃肠道以外给药途径剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴 鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述活性 成分还用于干扰IL-17R与Act1的结合。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述活性 成分还用于抑制IL-17介导的NF-κB和MAPK通路，降低IL-6和基质金属蛋白 酶的产生。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述活性 成分还用于抑制IL-17介导的p65、p38、JNK和ERK的磷酸化。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：上述活性 成分还用于抑制IL-17诱导的MMP-13的产生。
另外，关节炎动物模型，其特征在于，选自如下一种或几种动物模型：
(A).包含经修饰的，用于构建关节中炎症因子IL-17高表达的关节炎模型 的，经IL-17诱导的啮齿类动物；
(B).包含经修饰的，用于构建骨关节炎动物模型的，经DMM诱导的啮齿类 动物；
(C).包含经修饰的，用于构建与年龄相关的自发性骨关节炎动物模型的啮 齿类动物。
进一步地，本发明提供的一种溃疡性结肠炎动物模型，其特征还在于：
所述(B)或(C)中提及的啮齿类动物还经IL-17诱导。
进一步地，本发明提供的一种溃疡性结肠炎动物模型，其特征还在于：上 述啮齿类动物包敲除TRAF3的啮齿类动物。
本发明的作用和效果：
经本发明对TRAF3的作用和机制进行了研究，发现破骨细胞前体中TRAF3 表达的上调可减轻常见骨病的骨破坏和炎症性骨丢失。同时，TRAF3是控制I型 干扰素诱导和抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)表达的关键因子。这些发现 提示了TRAF3在恢复免疫稳态中起着复杂的作用。
另外，本研究还发现TRAF3在IL-17介导的NF-κB和MAPK信号通路中能 起到负调控作用，在人原代滑膜细胞中敲除TRAF3极大地增强了IL-17信号通 路。同时，在OA过程中，IL-17对软骨细胞的影响大于滑膜细胞。
故而，本发明认为，在软骨细胞中过表达TRAF3明显抑制IL-17介导的NF- κB和MAPK通路，从而降低IL-6和基质金属蛋白酶的产生。相反，敲除TRAF3 可导致IL-17诱导的基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的升高。在体内，IL-17的丢 失明显减轻了手术引起的OA和年龄相关的自发OA所造成的软骨破坏。与对照 组相比，TRAF3转基因小鼠在不同关节炎动物模型中软骨破坏较少。此外，使用 腺病毒沉默TRAF3显著加剧实验OA的软骨降解，IL-17的缺失部分挽救了实验 OA的软骨降解。总之，TRAF3应当能成为改善关节炎软骨退化的潜在治疗靶点。
附图说明
图1.IL-17在软骨细胞中激活NF-κB和MAPK信号上调分解代谢的因子。
其中，图A为IL-17刺激的原代软骨细胞中分解代谢基因mRNA水平(24h, 10ng/mL)；
图B为IL-17刺激的ATDC5细胞系中分解代谢基因mRNA水平(24h,10ng /mL)；
图C为IL-17刺激的SW1353细胞系中分解代谢基因mRNA水平(24h,10ng /mL)；
图D为在IL-17介导的原代软骨细胞中参与NF-κB和MAPK信号通路的主 要分子的免疫印迹；
图E为在IL-17介导的ATDC5细胞系中参与NF-κB和MAPK信号通路的主 要分子的免疫印迹；
图F在IL-17介导的SW1353细胞系中参与NF-κB和MAPK信号通路的主要 分子的免疫印迹；
图G为图D所示的免疫印迹结果的定量。数据表示至少n＝3个独立实验的 平均值±S.E.M.；
图H为图E所示的免疫印迹结果的定量。数据表示至少n＝3个独立实验的 平均值±S.E.M.；
图I为图F所示的免疫印迹结果的定量。数据表示至少n＝3个独立实验的 平均值±S.E.M.；
***p<0.05,p<0.01,***p<0.001。
图2A.在原代软骨细胞中Ad-Traf3感染的TRAF3表达水平；
图2B.在原代软骨细胞中Ad-Traf3感染的TRAF3的免疫印迹；
图3.TRAF3负调控软骨细胞中il-17介导的信号转导和基质降解酶的诱导。
其中，图A为用质粒转染空载体(EV)或标记为M2(Flag)的TRAF3的原代软 骨细胞与anti-p65、anti-p-p65anti-p-JNK,anti-p38,anti-p-p38,anti-ERK, anti-p-ERK,anti-TRAF3或anti-β-actin的免疫印迹；
图B为ATDC5细胞未处理或用IL-17(10ng/mL)处理15或30分钟完整的 细胞溶解产物与anti-p65、anti-p-p65 anti-p-JNK,anti-p38,anti-p-p38, anti-ERK,anti-p-ERK,anti-TRAF3或anti-β-actin的免疫印迹；
图C为IL-17(10ng/ml)诱导的IL-6、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5mRNA 在Ad-C或Ad-Traf3感染的原代软骨细胞中的表达；
图D为IL-17(10ng/ml)诱导的IL-6、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5mRNA 在Ad-C或Ad-Traf3感染的ATDC5细胞中的表达；
图E为Western blot分析感染Ad-C或Ad-Traf3的原代软骨细胞的分解代 谢因子(MMP-13和COX-2)的免疫印迹分析；
图F为感染Ad-C或Ad-sh-Traf3的原代软骨细胞中分解代谢因子(MMP-13 和COX-2)的免疫印迹分析；
图G为图E所示MMP-13免疫印迹结果的定量，数据表示至少n＝3个独立实 验的平均值±S.E.M.；
图H为图E所示COX-2免疫印迹结果的定量，数据表示至少n＝3个独立实 验的平均值±S.E.M.；
图I为图F所示MMP-13免疫印迹结果的定量，数据表示至少n＝3个独立实 验的平均值±S.E.M.；
图J为图F所示COX-2免疫印迹结果的定量，数据表示至少n＝3个独立实 验的平均值±S.E.M.；
***p<0.05,p<0.01。
图4A.在原代软骨细胞中TRAF3表达对mRNA和蛋白水平的影响；
图4B.在原代软骨细胞中TRAF3表达的mRNA和蛋白水平的免疫印迹；
图5A.3个Act1特异性的siRNAs对软骨细胞内的Act1的影响；
图5B.3个Act1特异性的siRNAs的软骨细胞内的Act1的免疫印迹；
图6.敲除Act1对IL-17诱导的MMP-13蛋白水平的影响；
图7.IL-17的缺乏减弱了手术诱导OA和衰老诱导的自发OA的软骨基质降 解；
其中，图A为3月龄时，内侧半月板(DMM)操作的WT和IL-17a-/-小鼠的软 骨破坏和OARSI分级(n＝6)，比例尺:100μm；
图B为14个月WT和IL-17a-/-小鼠的番红-O染色和OARSI分级(n＝8)，比 例尺:50μm，值表示平均值±S.E.M.**p<0.01。
图8.TRAF3转基因小鼠(T3TG)中，IL-17诱导的MMP13的产生和软骨EMC的 丢失较少；
其中，图A为T3TG(n＝6)和littermate对照组(n＝6)小鼠关节内注射IL-17 或PBS后，MMP-13的免疫组织化学代表性图像；
图B为T3TG(n＝6)和littermate对照组(n＝6)小鼠关节内注射IL-17或PBS 后，MMP-13的免疫组化定量,比例尺:50μm，框内区域比例尺:20μm。框内显示 MMP-13阳性软骨细胞；
图C为关节内注射IL-17或PBS后，T3TG关节软骨番红-O染色(n＝6)和 littermate对照(n＝6)，比例尺:50μm，框内区域比例尺:20μm。框内区域显示 关节软骨放大，值代表的意思是±S.E.M.***p<0.05,p<0.01,***p <0.001。
图9.实验OA发病过程中TRAF3表达降低；
其中，图A为DMM诱导的实验性OA或Sham组大鼠术后1个月(n＝8)、2个 月(n＝6)、3个月(n＝9)软骨中TRAF3表达的免疫组化结果，比例尺:20μm；
图B为上述大鼠软骨组织中TRAF3 mRNA表达水平的变化；
图C为OA患者关节软骨组织中TRAF3阳性的软骨细胞(n＝3)，比例尺:50 μm，框内区域比例尺:20μm，框内区域显示TRAF3阳性软骨细胞，值代表的意 思是±S.E.M.***p<0.05,p<0.01,***p<0.001。
图10.TRAF3可能通过抑制IL-17信号来控制OA的发展；
其中，图A为内侧半月板(DMM)操作的WT和T3TG小鼠假手术或不稳定的软 骨破坏和OARSI分级(n＝12)，比例尺:100μm,框内区域比例尺:50μm，框内区 域显示关节软骨放大；
图B为假手术或DMM操作的WT或IL-17a-/-小鼠关节内注射Ad-C或 Ad-sh-Traf3获得的关节软骨的番红-O染色和OARSI分级(n＝10)，比例尺:50μ m，值表示平均值±S.E.M.*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
一、材料与实验方法：
A.动物
TRAF3转基因小鼠和IL-17a-/-小鼠是由中国科学院上海生命科学研究院钱 友存教授赠送的。TRAF3转基因小鼠的产生在以前的研究中有报道。T3TG和 IL-17a-/-小鼠以及8-12周龄的同窝出生的野生型小鼠(WT)对照组被用于实验。 C57BL/6小鼠和SD大鼠购自中国科学院上海实验动物中心。所有动物均在无菌 条件下饲养。所有动物实验均按照《实验室动物饲养和使用指南》进行，并获 得了中国科学院上海生命科学研究院生物医学研究伦理委员会的批准。
A-1.IL-17关节内注射模型
用250mg/kg三溴乙醇(Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)麻醉小鼠。在 PBS中以5μl包含10ng/ml重组IL-17(美国研发,麦金利MN)的总量，如前所 述，用30G针头(65460–05，汉密尔顿有限公司瑞士)通过髌下韧带注射到左 膝关节间隙，髌韧带通过皮肤小切口是可见的，右膝被注射5μl PBS作为对照 组。将IL-17(10ng/ml在PBS)和PBS分别注入T3TG小鼠和同窝出生的WT对 照组，每24小时连续注射3次。在最后一次注射T3TG和WT小鼠经CO2处理后 3天(每组10只)，收集膝关节标本，4％多聚甲醛固定。
A-2.DMM模型和OARSI评分
小鼠内侧半月板(DMM)的不稳定是由内侧半月板的前附着部分横切至胫骨 平台引起的。然后准备好膝盖进行无菌手术，在髌韧带内侧作纵行切口，打开 关节囊，发现将内侧半月板固定在胫骨平台上的半月板韧带。对假手术组的一 部分动物没有进行进一步的操作。实验组切断内侧半月板韧带，形成DMM。假手 术组和DMM组分别缝合关节囊和皮下层。DMM后6周，T3TG和WT小鼠经CO2处 理安乐死。对于腺病毒注射，对照组病毒(Ad-C)或Ad-sh-TRAF3病毒在DMM术 后一周内关节内注射1次，共5周。收集膝关节，10％***缓冲液4℃静置 过夜，14％EDTA脱钙2周。关节被嵌入在石蜡和切割5μm厚度。准备组织学切 片，切片使用翻红-O和快绿染色，然后由4名独立评分者使用国际骨关节炎研 究协会(OARSI)评分系统对OA严重程度进行分级。从每个关节取三个切片(内侧、 中央、外侧)进行染色和评估。三个节段分别分级，每个节段取平均值。
A-3.大鼠OA动物模型人软骨标本
如上所述，DMM手术诱导大鼠OA。简单地，动物被麻醉，然后进行手术来 横切MCL。将内侧半月板全层切开，诱导右膝关节失稳。假手术组与对照组相同， 均未发生韧带横断或半月板撕裂。术后1、2、3个月处死(每组7～10只)，收 集膝关节标本，4％多聚甲醛固定。取因原发性膝关节骨性关节炎而行全关节置 换术的患者的OA软骨作为样本(N＝3)。取同一例患者未损伤区域作为正常软骨。 获得上海市第九人民医院、上海交通大学医学院医学伦理委员会的伦理批准， 并获得所有参与者的知情同意。
A-4.组织学和免疫组织化学
用12.5％EDTA脱钙4％多聚甲醛PBS(pH＝7.0)固定实验动物膝关节过夜， 石蜡包埋。组织部分(5μm)在二甲苯中脱蜡、乙醇连续水化、用PBS冲洗。切 片用翻红-O/快绿染色以鉴别蛋白多糖的丢失。使用Image J软件(Image J 1.52t, https://imagej.nih.gov/ij/)根据密度对翻红-O染色进行定量。在免疫组化 中，组织部分在10mm柠檬酸钠缓冲(pH＝6.0)中以95℃在微波炉中加热10 分钟。切片在室温下冷却30分钟后抗原暴露。用3％过氧化氢阻断内源性过氧化 物酶活性，用PBS冲洗几次。在室温条件下，将5％BSA与非特异性蛋白在PBS 中阻断30分钟后，用TRAF3(Abcam,ab217033,Cambridge,UK)或MMP-13(Abcam,ab219620)的一抗在4C孵育过夜。用PBS冲洗，然后按照制造商说明用二抗(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA,USA)孵育。然后用苏木精(Sigma)对切 片进行染色。冲洗后，用3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐(EnVision检测试剂盒， 过氧化物酶/DAB，兔/小鼠，Dako细胞瘤，Santa Clara,CA,USA)染色。正常 IgG染色和无一抗染色也作为阴性对照。采用Image J软件计算阳性细胞百分比， 量化免疫组化结果。
B.细胞培养
B-1.大鼠软骨细胞分离培养
主要大鼠软骨细胞分离得到老鼠的膝盖软骨,由II型胶原酶消化后5小时 37℃,通过使用70μm过滤器过滤(BD康宁,富兰克林湖,新泽西,美国),然后在 DMEM/F12培养(amixture of Dulbecco’s modified Eagle’s medium and Ham’ sF12 medium,Gibco BRL,德国)，用10％的FBS(胎牛血清、Gibco BRL、德国),100 单位/毫升青霉素G,100μg/毫升链霉素,和2.5μg/毫升两性霉素B，在37℃ 下5％的二氧化碳环境中培养。
B-2.ATDC5细胞系
小鼠软骨源性ATDC-5细胞系取自日本筑波的RIKEN细胞库。未分化的ATDC5 细胞在含有10％的FBS,100单位/毫升青霉素G,100μg/毫升链霉素,2.5/毫升 两性霉素B的DMEM/F12培养基中培养。
B-3.SW1353细胞系
人软骨肉瘤细胞系SW1353细胞获得于中国科学院标准培养收集。细胞同样 在DMEM/F12中培养。
B-4.瞬时转染基因表达
标记的TRAF3被克隆到逆转录病毒介导的pMSCV-IRES-GFP载体(由中科院 上海生命科学研究院健康科学研究所的钱友存的实验室提供)和pcDNA 3.0质粒 中。ATDC5细胞受转染TRAF3质粒的293FT细胞的病毒上清液和帮助载体的感染。 利用lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，用pcDNA-TRAF3 和空pcDNA载体转染SW1353细胞。
B-5.RNA干扰
采用siGENOME SMART pool siRNA(Dharmacon,Lafayette,CO,USA)靶向 大鼠Act1(gene ID 369048)进行RNA干扰。
B-6.RNA纯化与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
按照说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen)制备总RNA。取总RNA中的1ug 用逆转录酶在42度条件下温育1小时合成cDNA第一链。逆转录反应后，使用 瑞士罗氏公司(Roche)生产的LightCycler480体系(SYBR1Premix Ex TaqTM) (TakaraBio，日本)按照制造商说明进行qRT-PCR。real-time PCR的条件如下: 先95度10s变性，接着95度10s 40个循环，最后60度30s。溶解阶段加到扩 增过程的最后，直到溶解曲线未见非特异性扩增为止。所有的扩增都以 beta-actin做参照。数据分析采用比较Ct(2-△△Ct)方法，并以折线变化形式 表示。
B-7.免疫印迹
细胞在含有50mm Tris-HCl、pH 7.4、150mm NaCl、1％Nonidet P-40、0.1％ SDS的蛋白酶抑制剂(10mg/ml的白蛋白、10mg/ml的胃蛋白酶抑制剂A和10mg /ml的抑肽酶)的裂解液中在冰上溶解30min。在免疫印迹分析中，用50μg蛋 白质样品在10％SDS-PAGE跑电泳和在硝化纤维膜上进行转膜(Whatman,皮斯 卡塔韦,新泽西,美国)。主要的抗体使用anti-TRAF3(1:1000)(Abcam)MMP-13 (1∶sc-30073,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国),cox-2(1:500, ab15191 Abcam)GAPDH(1:5000，G9545，Sigma),和来自于CST公司的 anti-Phospho-p65(1:1000)anti-p65(1:1000)anti-Phospho-p38 MAPK (1:1000)anti-p38MAPK(1:1000)anti-Phospho-p44/42MAPK(1:2000), anti-p44/42MAPK(1:1000)anti-Phospho-SAPK/物(1:1000)和anti-SAPK/ 物(1:1000)，beta-actin作为对照。hrp偶联的二抗(细胞信号技术)以1:1000 稀释。根据制造商的建议，使用增强型化学发光检测系统(MILlipore,BILlerica, MA,USA)可以看到抗原抗体复合物。利用Alpha图像软件将扫描膜上的免疫反 应条带强度归一化为beta-actin，定量分析3个重复样本中的免疫反应条带。
B-8.统计分析
使用GraphPad Prism软件(v6,Durham,NC,https://www.graphpad.com/) 进行统计分析。所有数据均以均数±标准差(SD)表示。两组间的统计学差异由 双尾学生t检验确定。P值小于0.05为差异有统计学意义。所有实验均在至少 3个独立样本上进行。
二、实验结果：
1.IL-17诱导软骨细胞产生炎性细胞因子、MMPs和蛋白聚糖酶
为了研究IL-17在软骨细胞分解代谢中的作用，本实施例用重组IL-17处 理软骨细胞(10ng/ml,24h)。IL-17处理导致IL-6、MMP-13、一种与血小板反 应蛋白基元-4(ADAMTS-4)和ADAMTS-5在mRNA水平上显著上调，而这些mRNA 在大鼠原代软骨细胞(如图1A所示)、ATDC5细胞(如图1B所示)和SW1353细胞(如 图1C所示)的OA软骨破坏中起关键作用。
此外,在大鼠原代软骨细胞(如图1D和图1G所示)和ATDC5细胞(如图1E 和图1H所示)中用IL-17处理后立即触发p65、p38、ERK和JNK的磷酸化。
然而,在SW1353细胞(如图1F和1I所示)中IL-17仅仅激活p65、ERK和 JNK的磷酸化，没有激活p38。
这些数据表明，IL-17通过激活NF-κB和MAPK信号通路来上调软骨分解代 谢因子的。
2.TRAF3严格控制IL-17诱导的分解代谢基因表达
为了确定TRAF3在IL-17介导的信号转导中的作用，本实施例产生了包含 TRAF3整个CDS序列(Ad-TRAF3)的腺病毒。
事实上，在原代软骨细胞(如图2A和2B所示)中Ad-TRAF3感染有效提升 TRAF3表达水平。
本实施例还发现，过表达TRAF3显著抑制IL-17介导的p65、p38、JNK和 ERK的磷酸化，表明TRAF3对IL-17介导的信号通路具有普遍的抑制作用(如图 3A所示)。
此外，本实施例还将TRAF3或空载体质粒转染到SW1353细胞中，并检测IL -17介导的即时信号转导。一致认为，TRAF3过表达可抑制IL-17诱导的p65、 p38和JNK的磷酸化，但不抑制ERK磷酸化(图3B)，表明TRAF3对软骨细胞中 IL-17介导的通路具有普遍的抑制作用。
然后，本实施例还研究了TRAF3在软骨细胞中IL-17诱导的软骨分解代谢 因子表达中的作用。值得注意的是,在mRNA水平原代软骨细胞和ATDC5细胞(如 图3C和3D所示)中过表达TRAF3抑制IL-17介导的IL-6,MMP-13,Adamts-4 的表达上调，而不是Adamts-5。
在IL-17(如图3E,3G和3H)刺激下，过表达TRAF3同样显著降低MMP-13 和cox-2的蛋白表达，为了进一步证实TRAF3在IL-17介导的下游基因诱导 中的作用，本实施例中还合成了TRAF3特异性siRNA(由上海吉马生物技术有限 公司提供的针对TRAF3的特异性siRNA，5’-GAAGGTTTCCTTGTTGCAGAATGAA-3’， 5’-AGAGTCAGGTTCCGATGAT-3’)。数据表明，在原代软骨细胞中TRAF3表达 有效降低mRNA和蛋白水平(如图4A和4B所示)。正如所料，TRAF3功能缺失增 强了IL-17诱导的蛋白水平上MMP-13和COX-2的上调(如图3F、3I和3J所示)。
考虑到TRAF3干扰了IL-17R与Act1的结合，从而阻断了TRAF6的募集， 最终导致IL-17介导的信号通路和下游基因转录的抑制，于是本实施例产生了 3个Act1特异性的siRNAs来敲低软骨细胞内的Act1。siRNA#3因其最高的敲除 效率(如图5A和5B所示)而被用于以下研究。
重要的是，敲除Act1显著降低了IL-17诱导的MMP-13蛋白水平上调(如图 6所示)。总之，这些数据有力地证明了TRAF3对IL-17诱导的软骨细胞下游分 解代谢基因表达具有关键的控制作用。
3.IL-17缺乏症保护软骨降解的实验和自发骨性关节炎
本实施例进一步研究阻断IL-17信号是否可以保护软骨在体内的降解。有 趣的是，与对照组相比，DMM手术引发的软骨破坏在IL-17缺陷小鼠中显著减轻 (如图7A所示)。此外，IL-17的减少也明显减轻了由年龄相关的自发OA引起的 软骨退化(如图7B所示)。总之，这些结果表明，IL-17在OA期间的软骨降解中 起着关键作用。
4.TRAF3转基因小鼠IL-17诱导的基质丢失较少
为了研究TRAF3在体内诱导的IL-17软骨降解中的作用，本实施例使用T3TG 小鼠和同窝出生的WT小鼠对照组建立了IL-17关节内注射模型。MMP-13是软骨 细胞外基质(ECM)丢失和降解的关键降解因子。发现注射IL-17后，WT小鼠浅 表软骨区MMP-13的产生明显增加，而T3TG小鼠软骨中MMP-13的产生明显受到 抑制(如图8A和8B所示)。与对照组相比，T3TG小鼠因注射IL-17而引起的软 骨ECM丢失(翻红-O染色反映了这一现象)也有所减轻。综上所述，这些结果证 明TRAF3能够减弱IL-17诱导的MMP-13的产生，从而抑制软骨在体内的降解。
5.TRAF3在OA软骨中表达降低
为了研究在OA过程中关节软骨中TRAF3的表达水平是否发生改变。本实施 例还建立了一个实验性的OA大鼠模型来研究TRAF3在OA和正常软骨中的表达。 免疫组化结果显示，与假手术组相比，实验组OA软骨TRAF3表达水平在术后1 个月略有下降，在术后2、3个月明显下降(如图9A所示)。
同时，本实施例还分析了大鼠实验性OA模型不同阶段软骨中TRAF3的mRNA 水平，发现TRAF3在OA过程中明显降低(如图9B所示)。
同样，在人类OA患者中也发现了TRAF3在OA软骨中的表达水平低于正常 软骨(如图9C所示)。
综上所述，这些观察提示TRAF3在OA发病过程中在软骨中被下调。
6.TRAF3在OA引起的软骨降解中起保护作用
考虑到TRAF3在体外具有抑制IL-17介导的信号转导和诱导基质降解酶的 作用，本实施例进一步研究了TRAF3在体内是否影响实验性OA发病机制。为此， 本实施例在T3TG小鼠和同窝出生的WT小鼠对照组中通过DMM手术建立了实验 OA模型。
术后1个月，发现TRAF3缺乏症有效缓解了DMM手术所引发的软骨破坏， 组织学和OARSI评分均有体现(如图10A所示)。为了进一步证实TRAF3介导的 IL-17信号的抑制是否导致了其对软骨降解的保护作用，在本实施例中，将含有 TRAF3短发夹RNA质粒(Ad-sh-TRAF3)的腺病毒植入DMM诱导的OA小鼠的膝关节 内。结果显示，TRAF3的缺失加重了手术诱导的OA导致的软骨破坏，而 Ad-sh-TRAF3对IL-17a-/-小鼠DMM手术导致的软骨降解无影响(如图10B所示)。
由此表明，TRAF3介导的IL-17信号的抑制是OA软骨基质降解的一个潜在 的有效治疗靶点。
三、结果讨论：
IL-17已被发现可激活多种信号通路，强力诱导促炎细胞因子和化学激酶。 此外，IL-17也可以与IL-1β或TNF-α协同作用进一步诱导促炎细胞因子、NO 和MMPs，以及减少蛋白聚糖的水平。事实上，IL-17作为一种上游因子，在原 代软骨细胞、ATDC5细胞系和SW1353细胞系中显著增加了IL-6、MMP-13、 ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达。
然而，与IL-1β或TNF-α相比，由IL-17诱导的这些分解代谢因子的上调 是相对温和，暗示IL-17可能不是直接调控这些分解代谢因子的，相反，IL-17 可能通过激活NF-κB和MAPK通路上调IL-1β或TNF-α的表达来开启这些分解 代谢因子的表达。同样，体内局部给药IL-17可诱导关节软骨产生MMP-13，同 时伴有软骨基质丢失。然而，在IL-17注射模型中仅观察到轻度的基质损失， 这可能是由于IL-17暴露时间较短(3天)所致。最重要的是，IL-17全身性功能 丧失小鼠在手术诱导的OA和与衰老相关的自发性OA中表现出软骨降解减弱，提示IL-17可能是OA过程中软骨降解的重要介质。因此，阻断IL-17介导的 软骨细胞下游信号转导是保护软骨免受降解的有效策略。
在多种细胞类型中，TRAF3被认为是非经典NF-κB通路中的一个重要的负 调控因子。先前的研究表明，IL-17刺激会诱导TRAF3募集到IL-17受体 (IL-17R)，从而干扰IL-17R-act1-traf6活化复合物的形成。先前的研究 表明TRAF3可抑制原发性滑膜细胞中IL-17介导的信号转导。另外，TRAF3过 表达显著抑制了IL-17介导的p65、JNK、ERK和p38的磷酸化，并由此产生了 IL-6、MMP-13、Adamts-4和COX-2，但未抑制原代软骨细胞中的Adamts-5。然 而，TRAF3过表达仅能抑制ATDC5细胞系中p65和JNK的磷酸化，提示TRAF3功 能在不同细胞类型中的异质性。为了证实TRAF3在体内对IL-17介导的软骨降 解的保护作用，本实施例建立了IL-17关节内注射模型。重要的是，TRAF3的功 能增加有效地减少了IL-17诱导的小鼠MMP-13的产生和基质损失。有趣的是， TRAF3过表达并不影响Adamts-5在原代软骨细胞和ATDC5细胞系中的表达水平。 Adamts-5被认为是小鼠主要的蛋白聚糖酶，因此，TRAF3的功能获得可能不能 减弱小鼠对蛋白聚糖的降解。
与野生型小鼠相比，T3TG小鼠的软骨基质丢失和软骨降解均有所减轻。根 据OARSI评分，在T3TG小鼠中，术后仍观察到轻度软骨ECM丢失(1-2级)。T3TG 小鼠软骨未见明显降解，WT软骨降解明显(2-5级)。此外，T3TG小鼠(1-2期) 对表面积的影响小于WT小鼠(3-4期)。另一方面，TRAF3功能丧失增强了DMM 手术造成的软骨破坏。有趣的是，TRAF3的表达水平在OA发病机制的晚期(从 DMM术后2个月开始)显著下降，而在大鼠OA软骨的早期则无明显下降。DMM术 后3个月，在关节软骨中几乎没有检测到TRAF3(图9A)。mRNA表达进一步证实 了TRAF3在OA过程中的显著变化，提示TRAF3在OA发病过程中转录水平下调， 导致软骨中IL-17信号通路增强。这些结果表明TRAF3是OA过程中软骨降解的 关键负调控因子。更重要的是，IL-17的基因缺失阻断了TRAF3敲除介导的软骨 破坏。这些数据表明，TRAF3对软骨的保护作用是通过抑制IL-17介导的信号转 导来实现的。
综上所述，本实施例证实TRAF3作为IL-17介导的信号转导的负调控因子， 在OA过程中保护关节软骨的降解发挥重要作用。TRAF3对软骨的保护作用部分 是由于抑制IL-17诱导的信号通路，从而产生软骨分解代谢因子。因此，TRAF3 是一个潜在的治疗靶点，用于开发一种治疗OA引起的软骨退变的治疗方法。