阅读说明：本技术 副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法 (Preparation method of haemophilus parasuis type 2 inactivated vaccine ) 是由 肖敏 孙勇 刘建 卢昌 罗志文 任华 王闯 于 2020-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法,该方法包括菌种制备、发酵罐扩大培养、菌种收集、灭活、稀释等步骤。通过该方法可以得到具有较强针对性的副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗；该副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗具有血清型丰富多样的特点,临床免疫抗体水平达到商品苗的应用效果,死亡率综合评价比未免疫组降低2.78％。(The invention provides a preparation method of a haemophilus parasuis type 2 inactivated vaccine, which comprises the steps of strain preparation, fermentation tank expanded culture, strain collection, inactivation, dilution and the like. The haemophilus parasuis type 2 inactivated vaccine with stronger pertinence can be obtained by the method; the haemophilus parasuis type 2 inactivated vaccine has the characteristics of abundant and diverse serotypes, the clinical immune antibody level reaches the application effect of commercial vaccine, and the comprehensive evaluation of the death rate is reduced by 2.78 percent compared with that of a non-immune group.)

副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用疫苗制备技术，具体涉及副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)为巴氏杆菌科嗜血杆菌属中的一种革兰氏阴性球杆菌，是猪的一种条件性病原菌，呈世界性分布，感染仔猪后引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的猪格拉泽氏(Glasser’s)病。副猪嗜血杆菌主要危害2～8周龄的仔猪，发病率一般为10％～15％，死亡率可达50％以上。副猪嗜血杆菌有15个血清型，不同血清型的致病力也不相同，其中1型、2型、3型、4型、5型、8型、10型、12型、13型、14型和15型的致病力较强，而6型、7型、9型和11型没有致病力。副猪嗜血杆菌的流行病学调查显示，我国猪群中主要的流行血清型为2型、4型、5型、7型、12型和13型。目前，商品化副猪嗜血杆菌疫苗以灭活疫苗为主，血清型包括1型、4型、5型、12型和13型，然而还没有2型和7型商品化疫苗。

发明内容

为了预防副猪嗜血杆菌2型感染猪只，本发明提供一种副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法。

本发明提供的一种副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

向无菌容器中加入第一培养基、体积分数(V/V)为1‰～5‰的NAD溶液、体积分数为5％～10％的血清，挑取副猪嗜血杆菌菌落于其中，在36℃～37℃下培养12～16h，得到菌种液；

向发酵罐中加入所述第一培养基、所述菌种液、体积分数为1‰～5‰的NAD溶液和体积分数为5％～10％的血清，在36℃～37℃下培养10h～12h，得到菌液；

将所述菌液离心，去除上清培养液后，得到菌种悬浊液；

向所述菌种悬浊液中加入体积分数为1‰～3‰的甲醛溶液，在36℃～37℃下灭活48～72h；

将灭活后的所述菌种悬浊液与疫苗佐剂、pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)混合，得到副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗。

进一步地，所述无菌容器为无菌摇瓶。

进一步地，所述第一培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，所述血清为小牛血清。

进一步地，所述离心的转速为5000r/min～6000r/min，时间为5min～10min，离心后去除85％～90％的上清培养液，用移液管将沉淀与底部的菌体吹散，混匀。

进一步地，所述疫苗佐剂为畜禽用水包油包水佐剂(Summit-S550)。

进一步地，所述疫苗佐剂配比为30％～40％(V/V)，磷酸盐缓冲液稀释后抗原配比为60％～70％(V/V)，抗原终浓度为3×10⁹CFU/ml。

本发明的有益效果：提供了副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗的制备方法，通过该方法可以得到具有较强针对性的副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗；该副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗具有血清型丰富多样的特点，临床免疫抗体水平达到商品苗的应用效果，死亡率综合评价比未免疫组降低2.78％。

附图说明

图1显示了HPs在金黄色葡萄球菌周围的“卫星”生长现象，其中A无“卫星”生长现象，B有“卫星”生长现象。

图2显示了本发明实施例中HPs生化鉴定试验结果，其中A革兰氏染色试验结果(阴性)，B过氧化氢试验结果(产气)，C糖类试验结果。

图3显示了本发明实施例中浛洸、重阳菌液副猪通用引物测定结果，其中泳道1：浛洸猪场菌液；泳道2：重阳猪场菌液；M：DNA maker。

图4显示了本发明实施例中浛洸、重阳菌液副猪PCR血清型鉴定结果，其中泳道1：浛洸猪场菌液；泳道2：重阳猪场菌液；M：DNA maker。

图5显示了本发明实施例中副猪菌液通用引物测定结果，其中泳道1：扶余三7猪场菌液；泳道2：枫田猪场菌液；泳道3：大地鑫(原有)猪场菌液；泳道4：福水三场猪场菌液；泳道5：福山二9猪场菌液；泳道6：福山二3猪场菌液；泳道7：浛洸(原有)猪场菌液；泳道8：扶余三猪场菌液；泳道9：扶余一场猪场菌液；泳道10：凤凰猪场菌液；M：DNA maker。

图6显示了本发明实施例中副猪菌液PCR血清型鉴定结果，其中泳道1：扶余三7猪场菌液；泳道2：枫田猪场菌液；泳道3：大地鑫(原有)猪场菌液；泳道4：福水三场猪场菌液；泳道5：福山二9猪场菌液；泳道6：福山二3猪场菌液；泳道7：浛洸(原有)猪场菌液；泳道8：扶余三猪场菌液；泳道9：扶余一场猪场菌液；泳道10：凤凰猪场菌液；M：DNA maker。

图7显示了本发明实施例中副猪菌液通用引物测定结果，其中泳道1：牟桥3猪场菌液；泳道2：牟桥2猪场菌液；泳道3：牟桥10猪场菌液。

图8显示了本发明实施例中副猪菌液PCR血清型鉴定结果，其中泳道1：牟桥3猪场菌液；泳道2：牟桥2猪场菌液；泳道3：牟桥10猪场菌液。

图9显示了本发明实施例中副猪菌液通用引物测定结果，其中泳道1：大地鑫3猪场菌液；泳道2：大地鑫1猪场菌液；泳道3：大地鑫4猪场菌液。

图10显示了本发明实施例中副猪菌液PCR血清型鉴定结果，其中泳道1：大地鑫3猪场菌液；泳道2：大地鑫1猪场菌液；泳道3：大地鑫4猪场菌液。

图11为本发明实施例中HPs灭活疫苗的工艺生产流程图。

图12显示了本发明实施例中HPs(浛洸)的生存曲线。

图13显示了本发明实施例中HPs免疫14天后抗体水平变化趋势，其中，A.凤凰场免疫保育猪抗体水平检测结果；B.重阳场免疫保育猪抗体水平检测结果。

图14显示了本发明实施例中HPs免疫后抗体水平变化趋势。

图15显示了本发明实施例中HPs免疫后保育猪死淘率(35-75日龄)。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在本发明的实施例中，可以使用以下培养基：

TSB液体培养基，其含有10％胎牛血清(V/V)和1‰～5‰NAD辅酶(V/V)。TSB液体培养基的制备方法可以是：用天平称取胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)6g，溶于200mL一级水中，高压灭菌，待冷却至室温后，加入10mL胎牛血清和20μL NAD，混匀，制成TSB液体培养基，置4℃保存。

TSA固体培养基，其含有10％胎牛血清(V/V)和1‰～5‰NAD辅酶(V/V)。TSA固体培养基的制备方法可以是：用天平称取大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)8g，溶于200mL一级水中，高压灭菌，待冷却至45℃～50℃，加入10mL胎牛血清和20μL NAD，混匀后立即倒平板静止15min左右，制成TSA固体培养基，置4℃保存。

在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗之前，先获取副猪嗜血杆菌(HPs)。

病料样品采集及处理：选取30～50日病猪的临床症状表现为呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪作为对象，停药5～10天后，解剖取病猪完整肺部，如有关节积液，腹腔积液，胸腔积液，用一次性无菌注射器吸取，冰袋保存，一并带回实验室。

副猪嗜血杆菌的接种培养：用点燃的酒精棉将病料表面擦拭一遍，取肺部病变部位、肺支气管粘液和其他积液，用无菌棉签涂布于血平板上，同时蘸取金黄色葡萄球菌划线，于37℃培养24～48小时。24小时后观察血平板生长情况，观察HPs在金黄色葡萄球菌周围的“卫星”生长现象，如果有卫星现象，则初步判定为分离到HPs，如果没有则证明没有分离获得HPs，具体情况见图1。挑取沿金黄色葡萄球菌“卫星生长”的菌落，再次血平板划线，同时蘸取金黄色葡萄球菌划线，于37℃培养24～48小时，进行一次纯化，如果在金黄色葡萄球菌周围的“卫星”生长现象，进一步说明分离到HPs。再一次挑取第二次划线培养的沿金黄色葡萄球菌“卫星生长”的菌落，接种TSB中培养12～16小时后，进行后续的鉴定及保种。

在本实施例中，分别采集了申请人管理的猪场(浛洸、大地鑫、枫田、福水三场、扶余一场、扶余三场、凤凰、福山二场、福山二场等)的病料样品，共分离18株HPs。虽然本实施例中的样品采集自申请人管理的猪场，但是其他实施例中也可以采用其他含有副猪嗜血杆菌的样品；除了从病猪体内分离的副猪嗜血杆菌外，也可以通过其他途径获取的副猪嗜血杆菌。

对HPs进行生化鉴定，依据生化鉴定试剂盒说明书进行操作，主要涉及革兰氏染色、过氧化氢酶、吲哚、糖类试验。判定标准见表1，每一项生化试验结果图片见图2。

表1 HPs生化鉴定判定依据及结果

对HPs进行分子生物学鉴定和分型，采用的试剂与仪器可以有：

Takara公司生产的RR901 Premix Taq酶，北京康为世纪生物科技有限公司生产的CW0663S TAE，琼脂糖，其余所有试剂均为分析纯；

BIO-RAD公司生产的T100^TMThermal Cycler PCR仪、POWER-PAC 300电泳仪、水平电泳槽、Gel Do^TMXR+自动凝胶图像分析仪，赛默飞世尔科技公司生产的Legend Micro 21R冷冻高速离心机，江苏净化设备有限公司生产的SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台等。

根据GenBank公布的猪副猪嗜血杆菌(HPs)序列，结合Oligo6.0及Primer Premier软件自行设计1对副猪16S rRNA引物以及15对分型引物，引物参数指标见表2，本实施例的引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

表2副猪嗜血杆菌血清型引物核苷酸序列

将申请人管理的猪场(浛洸、重阳、大地鑫、枫田、扶余、福水、福山、凤凰、牟桥猪场)分离出的被检菌液样品以12000r/min～13000r/min的转速离心5min～10min，弃上清液，用无菌生理盐水悬浮，涡旋后于沸水中水浴10min～15min后，再在-20℃冻结，溶解后12000r/min～13000r/min离心5min～10min，取上清液作为DNA模板。

进行PCR扩增，采用25μL反应体系：Premix Taq酶(×2)12.5μL、无RNA酶水7.5μL、不同血清型上下游引物各1μL以及菌液3μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度根据表1设定1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增后取5μLPCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳30min。凝胶用溴化乙啶染色，最后置于Gel Do^TMXR+自动凝胶图像分析仪中紫外线透射观察。对比Marker进而判断条带大小，再与理论大小对比，从而得出结论。

取申请人管理的猪场(浛洸、重阳)分离出的菌液样品进行副猪通用引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示均出现单一条带(见泳道1～2)，条带大小约为814bp，与预期(814bp)大小一致(图3)。

取申请人管理的猪场(浛洸、重阳)分离出的菌液进行15种副猪分型引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示浛洸猪场菌液经副猪血清型10型引物PCR扩增后，在约320bp大小处有一条显著条带(图4A)，与预期(320bp)大小一致，重阳猪场菌液则经副猪血清型15型引物扩增后，在约530bp大小处有一条显著条带(图4B)，与预期(536bp)结果一致，初步判定浛洸猪场副猪为血清型10型，重阳猪场副猪为血清型15型。

取申请人管理的猪场(浛洸、大地鑫、枫田、福水三场、扶余一场、扶余三场、扶余三7场、凤凰、福山二3场、福山二9场)分离出的菌液进行副猪通用引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示均出现单一条带(见泳道1～10)，条带大小约为814bp，与预期(814bp)大小一致(图5)。

取申请人管理的猪场(浛洸、大地鑫、枫田、福水三场、扶余一场、扶余三场、扶余三7场、凤凰、福山二3场、福山二9场)分离出的菌液进行15种副猪分型引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示浛洸、扶余三场猪场菌液经副猪血清型2型引物PCR扩增后，在约1000bp大小处有一条显著条带(图6A)，与预期(1032bp)大小一致；大地鑫、福水三场、扶余一场、凤凰猪场菌液则经副猪血清型4型引物扩增后，在约753bp大小处有一条显著条带(图6B)，与预期(753bp)结果一致；扶余三7场、福山二3猪场菌液则经副猪血清型7型引物扩增后，在约600bp大小处有一条显著条带(图6C)，与预期(600bp)结果一致；枫田猪场菌液则经副猪血清型5型引物扩增后，在约560bp大小处有一条显著条带(图6D)，与预期(560bp)结果一致；福山二9猪场菌液则经副猪血清型12型引物扩增后，在约508bp大小处有一条显著条带(图6E)，与预期(508bp)结果一致；即初步判定浛洸、扶余三场猪场副猪为血清型2型，大地鑫、福水三场、扶余一场、凤凰猪场副猪为血清型4型，扶余三7场、福山二3猪场为血清型7型，枫田猪场为血清型5型，福山二9猪场为血清型5型。

取申请人管理的猪场(牟桥2、牟桥3、牟桥10场)分离出的菌液进行副猪通用引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示均出现单一条带(见泳道1～10)，条带大小约为814bp，与预期(814bp)大小一致(图7)。

取申请人管理的猪场(牟桥2、牟桥3、牟桥10场)分离出的菌液进行15种副猪分型引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示牟桥3、牟桥10场菌液则经副猪血清型12型引物扩增后，在约508bp大小处有一条显著条带(图8A)，与预期(508bp)结果一致；牟桥2猪场菌液则经副猪血清型13型引物扩增后，在约800bp大小处有一条显著条带(图8B)，与预期(508bp)结果一致。

取申请人管理的猪场(大地鑫1、大地鑫3、大地鑫4场)分离出的菌液进行副猪通用引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示均出现单一条带(见泳道1～10)，条带大小约为814bp，与预期(814bp)大小一致(图9)。

取申请人管理的猪场(大地鑫1、大地鑫3、大地鑫4场)分离出的菌液进行15种副猪分型引物PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示大地鑫1、大地鑫4场菌液则经副猪血清型4型引物扩增后，在约753bp大小处有一条显著条带(图10A)，与预期(753bp)结果一致；大地鑫3猪场菌液则经副猪血清型13型引物扩增后，在约800bp大小处有一条显著条带(图10B)，与预期(508bp)结果一致。

用副猪通用引物以及15种分型引物经PCR扩增，得到18个猪场的副猪血清型，如表3所示，血清型为2型的有浛洸、扶余三场，血清型为4型的有大地鑫、扶余一场、福水三场、凤凰、大地鑫1、大地鑫4，血清型为5型的有枫田，血清型为7型的有扶余三7场、福山二3场、血清型为10型的有浛洸，血清型为12型的有福山二9场、牟桥3、牟桥10，血清型为13型的有牟桥2、大地鑫3，血清型为15型的为重阳。

表3各猪场副猪嗜血杆菌血清型统计表

利用上述副猪嗜血杆菌2型菌株制备副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗：

复苏：取已纯化好的冻存副猪嗜血杆菌2型菌株，用无菌棉签蘸取后，直接涂布在TSA上，36℃～37℃培养箱培养12～16h，用于查看是否有杂菌；同时取0.5mL～0.6mL冻存菌液加入10～15mL的TSB中，36℃～37℃摇床培养12～16h；

纯检：取上步摇浑TSB菌液，同时涂布血平板(划金黄色葡萄球菌)和TSA，TSA涂布2个，36℃～37℃培养箱培养12～16h；血平板上呈现的“卫星生长”，并无杂菌生长，同时TSA上表征一致，未见杂菌为纯检合格；

菌种制备：取500mL的无菌三角瓶，加入50～100mL的TSB，加入总量1‰～5‰NAD(V/V)、总量5％～10％血清(V/V)，挑取纯检TSA上的菌落于其中，放入36℃～37℃摇床培养12～16h；摇浑后再次做纯检，此次纯检培养时间为24～48h，再次确认为目标菌株且无杂菌后，做为菌种液备用；

发酵罐扩大培养：10L发酵罐，配制7L～8L TSB于其中，密闭后，121℃高压灭菌15min；加入总量1‰～5‰NAD(V/V)、总量5％～10％血清(V/V)和菌种液，36℃～37℃培养10h～12h，取样进行细菌活菌计数，采用倍比稀释方法，对10^-5、10^-6、10^-7三个梯度取100μL进行TSA涂布；菌落数在30～300为有效计数，每个梯度做2～3个重复，菌落数约1×10⁹CFU/ml；同时进行纯检，纯检培养时间为24h～26h；

菌种收集：纯检合格的菌液，采用5000r/min～6000r/min，离心5min～10min，去除85％～90％的上清培养液后，将沉淀与底部的菌体吹散，混匀；

灭活：按体积比加入总量1‰～3‰甲醛溶液(V/V)进行灭活处理，加入甲醛后放置36℃～37℃培养箱中灭活48～72h，灭活期间，间隔摇匀。灭活后取样在TSA上进行灭活检验；36℃～37℃培养12h～16h无菌落生长；确认灭活后55℃～56℃水浴30～60min，4℃～6℃冰箱保存备用；

副猪嗜血杆菌2型灭活苗的配制：副猪嗜血杆菌2型菌液按照每头份按6×10⁹菌数配制疫苗，每头份体积为2mL；采用畜禽用水包油包水佐剂，佐剂配比为10％～40％(V/V)，磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0～7.4)稀释后抗原配比为60％～90％(V/V)；混合后磁力搅拌，转速400转/min～500转/min，搅拌时间为40～60min，得到副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗。

副猪嗜血杆菌2型小鼠致病力评价：选取25只6～8周龄balb/c小鼠分为5组，每组5只小鼠。分别设置不同活菌浓度的组，6×10⁹CFU/mL、6×10⁸CFU/mL、6×10⁷CFU/mL、6×10⁶CFU/mL和未攻毒对照，每组皮下注射0.2mL/只HPs菌液，未攻毒组注射生理盐水。连续观察7天，依据小鼠死亡情况确定HPs的LD₅₀剂量。结果表明：HPs的50％感染致死剂量为6×10^-7CFU/mL。为了安全起见，选取6×10^-6CFU/mL浓度作为疫苗安全免疫剂量。

副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗仔猪安全性评价：选取20-25日龄的仔猪15头分为3组，每组5头，设置试验Ⅰ组(HPs灭活疫苗)、试验Ⅱ组(佐剂组)、试验Ⅲ组(空白组)，每组分栏饲养。试验Ⅰ组(HPs灭活疫苗)每头仔猪颈部肌肉注射2mL(6×10⁹CFU/mL)，试验Ⅱ组(佐剂组)每头仔猪颈部肌肉注射2mL畜禽用水包油包水佐剂，试验Ⅲ组(空白组)每头仔猪颈部肌肉注射2mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0～7.4)，观察仔猪发热、饮食、精神状况、死亡情况，评价疫苗的安全性。

表4各分离毒株制备疫苗的安全性评价结果(猪群)

以下通过临床试验对副猪嗜血杆菌2型灭活苗免疫的效果进行评价。

临床攻毒保护试验：取20～25日龄的仔猪40头分成4组，每组10头，试验组Ⅰ(HPs灭活疫苗)、试验组Ⅱ(商品疫苗组)、试验组Ⅲ(不免疫组)、试验组Ⅳ(未免疫不攻毒组)，分栏饲养。免疫前采集血清样本，21日龄注射疫苗1mL/头，56日龄再肌肉注射疫苗1mL/头，二免结束后14天(即60日龄)口服接种4mL副猪嗜血杆菌2型菌液(5×10⁹CFU/mL)，攻毒前和攻毒后7天分别采集血清和鼻腔式子，称取体重，记录猪群状况和死亡率。

临床攻毒保护试验结果表明，副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗免疫攻毒组未出现仔猪死亡情况，鼻腔拭子未检测出副猪嗜血杆菌核酸；而未免疫攻毒组出现仔猪死亡情况，且鼻腔拭子的副猪嗜血杆菌核酸为阳性。用副猪嗜血杆菌间接血凝诊断试剂盒对仔猪免疫前和免疫后14天的血清抗体进行检测，二免后14天疫苗免疫组仔猪抗体水平较免疫前明显升高，且副猪嗜血杆菌2价灭活疫苗抗体水平与商品苗的抗体水平差异不显著(P≥0.05)(见图13)。

临床免疫效果试验：浛洸、扶余、重阳、凤凰等场，副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗和猪圆环病毒疫苗免疫21日龄保育仔猪。免疫14、21天后测定抗体效价和计算仔猪死亡率。浛洸场试验结果显示：免疫后，副猪嗜血杆菌的抗体水平明显上升，经T检验，P<0.0001,差异非常显著。副猪嗜血杆菌2型灭活疫苗猪群的死淘率为0.75％，未免疫猪群平均死淘率为4.23％，相差3.48％，仔猪死淘率明显下降。统计结果见图14和图15。

表5免疫后30天各猪场保育猪大数据分析结果

以上实施方式仅用于说明本申请，而并非对本申请的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本申请的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本申请的范畴，本申请的专利保护范围应由权利要求限定。