阅读说明：本技术 一种针对胸膜肺炎放线杆菌保护猪的疫苗 (Vaccine for protecting pigs against actinobacillus pleuropneumoniae ) 是由 M·H·威特夫莱特 J·J·E·比杰斯玛 于 2018-12-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)感染的疫苗,所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素,以及药学上可接受的载体。(The present invention relates to a vaccine for protecting pigs from infection by a. pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) comprising a RTX toxin of a. pleuropneumoniae recombinantly expressed by a baculovirus, and a pharmaceutically acceptable carrier.)

一种针对胸膜肺炎放线杆菌保护猪的疫苗

技术领域

一般而言，本发明涉及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)感染的疫苗。

背景技术

本发明涉及针对猪胸膜肺炎的疫苗，猪胸膜肺炎是一种对养猪业造成重大经济损失的世界范围的疾病。猪胸膜肺炎的病原体是胸膜肺炎放线杆菌(APP)，一种属于巴斯德氏菌科(family Pasteurellaceae)的革兰氏阴性菌。该疾病通过气溶胶途径或与感染猪的直接接触传播，并以出血、纤维化和坏死性肺病变为特征。临床表现可以从超急性到慢性范围，当将无症状携带猪引入未感染种群中时，其可以传播疾病。根据荚膜多糖和脂多糖(LPS)O链组分，已经描述了15种血清型。对胸膜肺炎放线杆菌的血清分型和其他基因分型方法为监测和流行病学研究做出了巨大贡献。这些工具为控制程序中旨在消除细菌毒性类型的决策提供了重要信息。据报道，在北美，血清型1、5和7是最普遍的，而血清型2和9在欧洲最常见，血清型15是澳大利亚猪的主要分离株。

针对胸膜肺炎放线杆菌描述的毒力因子包括LPS、荚膜多糖、Apx毒素I-IV(也称为重复毒素或RTX毒素)、外膜蛋白(OMP)和各种铁捕获系统。Frey已在Trends inMicrobiology 257,Vol.3,No.7,July 1995中描述了胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素(Apx毒素I、II和III)。随后，发现了APP的第四种RTX毒素(称为Apx IV)(参见，Dreyfus等，Veterinary Microbiology,2004,April 19；99(3-4):227-238)。然而，每种组分对感染过程的总体贡献仍不清楚，对这种菌的发病机制也不清楚。目前，针对A.pleuropneumoniae的几乎所有可用疫苗都是灭活的全细胞细菌素或Apx毒素与蛋白的亚单位组合，任选地与外膜级分组合。在任何情况下，已经普遍理解，为了获得足够的保护，在疫苗中必须存在脂多糖(LPS)(Julien Gouré等，BMC Genomics 2009,10:88，2009年2月24日发表；Dubreuil等，Animal Health Research Reviews 1(2):73-93,2000年12月)。实际上，已知LPS与Apx毒素之间的特异性结合在改善毒素免疫原性方面具有重要作用(参见，i.a.Ramjeet等，Molecular Biology,2008,70(1),pp 221-235)，其可能解释了其中Apx毒素与LPS形成复合物的组合亚单位疫苗具有充分的保护作用。

脂多糖的严重缺点是其内毒素性质，因此与多种不良副作用如嗜睡、腹泻、呕吐、食欲不振或者甚至死亡有关。因此，乍看之下，应试图降低疫苗中LPS的量或使LPS解毒。然而，适当的APP疫苗依赖于LPS的存在，因而，众所周知，降低LPS的量会固有地降低疫苗的有效性。替代地，如从WO2011/015614中所知晓地，可以通过向疫苗中添加抗生素多粘菌素来消除LPS的负面影响。但是，从监管的角度来看，在疫苗中添加抗生素受到严格限制。因此，这种解决方案不能在所有监管辖区中使用。

实际上，当前的理解是，要达到如此高的保护水平，疫苗中必须存在至少一种Apx毒素，该毒素存在于与异源分子(如LPS)的免疫复合物中。尽管已知纯化的Apx毒素可以提供一定程度的保护作用(参见，i.a.Bhatia等，Veterinary Microbiology,29,1991,147-158)，但是为了获得充分的保护，理解在疫苗中使用纯化的Apx毒素作为抗原是不够的。已知有很多在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中表达Apx毒素的实例。尽管有时指由大肠杆菌生产的“纯化的”重组Apx毒素，但是在每种这些情况下，由于与大肠杆菌细菌细胞壁中所含的LPS接触，毒素会与LPS形成复合物。用于真正获得不与LPS或另一种异源毒素复合的纯化Apx毒素的更独特的表达系统在本领域中也是公知的。Kyung-Yeol Lee等在FEMS ImmunolMed Microbiol 48,2006,381-389中描述了使用在转基因烟草植物中生产的重组Apx毒素诱导针对胸膜肺炎放线杆菌感染的保护性免疫应答。但是，没有显示出对猪的保护作用。另外，疫苗需要以口服方式连续给药四次。对于给猪接种疫苗，这是不现实的选择。相应地，Mi-Young Kim等在Protein Expression and Purification 132,2017,116–123中指出，Apx毒素能够在转基因水稻愈伤组织中表达，当鼻内施用时，纯化的毒素在小鼠中能够针对胸膜肺炎放线杆菌感染提供至少一些保护作用。但是，其没有显示出对猪的保护作用，更不用说与商业上可用于预防APP的疫苗产生相当水平的保护作用。

发明目的

本发明的目的是提供一种替代疫苗，以充分保护仔猪免受胸膜肺炎放线杆菌的感染，优选地以与使用市售APP疫苗所达到的保护水平相当的水平。

发明内容

为了达到本发明的目的，已经设计出一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素和药学上可接受的载体。

令人吃惊的是，包含分离的毒素，但不存在LPS或另一种异源毒素的目前的疫苗可以产生充分的保护作用，甚至达到与使用疫苗如APP(荷兰Boxmeer的MSDAnimal Health)所获得的保护水平相当的水平。尽管杆状病毒表达本身是众所周知的，并且已经使用了很多年以表达病毒或细菌病原体的免疫原，但是尚未用于通过表达一种或多种RTX毒素提供针对APP的适宜疫苗。杆状病毒是能够感染600多种昆虫物种的DNA病毒。在生物技术中最常用的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)。杆状病毒具有环状的双链DNA(～134kb)，其包装在杆状核衣壳内，并被来源于宿主细胞的膜所包裹。感染昆虫后，杆状病毒可以以出芽形式从细胞中释放出来，或者包埋在由病毒表达的多角体蛋白和p10蛋白组成的多面体内。多角体蛋白和p10蛋白表达丰富，但对于杆状病毒复制是非必需的，因此可以在多角体蛋白或p10启动子的控制下克隆异源基因，以产生重组杆状病毒。自1980年代以来，众所周知，所得到的重组杆状病毒可用于感染培养的昆虫细胞以稳健地进行蛋白表达。迄今为止，已经开发了多种商业杆状病毒载体系统(例如，Bac-to-Bac^TM,Invitrogen；BaculoDirect^TM,Invitrogen；ProEasy^TM,AB Vector)，以使得以“即插即用”形式进行基因克隆和重组杆状病毒构建(例如，参见Lin SY,Chen GY,Hu YC.Recent PatBiotehnol 2011；5:1-11)。此外，已经开发了多种工程化的杆状病毒载体，如flashBAC^TM和flashBACGOLD^TM(Oxford Expression Technologies Ltd)，以通过缺失杆状病毒基因组中的某些病毒基因(例如，chiA和v-cath)改善重组蛋白的表达(例如，参见Hitchman RB,Possee RD,King LA.Recent Pat Biotechnol 2009；3:46-54)。此外，MultiBac^TM系统(Geneva Biotech)通过归巢核酸内切酶和Cre-loxP转座，能够快速灵活地构建带有多个基因表达盒的杆状病毒。相反地，开发了基于MultiBac的SweetBac^TM系统，以克服昆虫细胞中的糖基化问题并表达哺乳动物化蛋白(例如，参见Palmberger D,Klausberger M,Berger I等，Bioengineered 2013；4:78-83)。

本发明还涉及由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素，其用于一种方法，所述方法通过向动物施用包含RTX毒素和药学上可接受的载体的疫苗而保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染。.

紧接着，本发明能够用于由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素用于通过将RTX毒素与药学上可接受的载体混合而制备保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗的用途，以及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染的方法，其通过向所述猪施用疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素和药学上可接受的载体。

定义

疫苗是一种能够安全地向受试者动物施用，并能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫(即，成功诱导针对微生物感染的保护)的药物组合物。在通常情况下，可以使用本领域公知的方法配制疫苗，所述方法基本地包括将一种或多种抗原(活的或灭活的、全细胞、提取物、纯化级分或亚单位)与药学上可接受的载体混合，例如液体载体，如(任选地缓冲的)水或固体载体，如常用于获得冻干疫苗。任选地，根据疫苗的预期用途或所需性质，添加其他物质，如佐剂、稳定剂、粘度调节剂或其他组分。

药学上可接受的载体是生物相容性介质，即在施用后不会在受试者动物中引起明显的不良反应，在施用疫苗后能够将抗原呈递至宿主动物的免疫系统的介质。例如，这样的药学上可接受的载体可以是含有水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或如通常用于获得冻干疫苗(基于糖和/或蛋白)的固体载体，其任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。任选地，根据相应疫苗的预期用途或所需性质，添加其他物质，如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。

保护免受微生物感染有助于预防、改善或治愈微生物感染或由该感染引起的病症，例如预防或减少由病原体感染引起的一种或多种临床症状。

疫苗的全身施用指疫苗到达机体的循环系统(即，包括心血管和淋巴细胞的系统)，从而影响整个机体，而不是特定部位(如胃肠道)。例如，可以通过向肌肉组织(肌内)、向皮肤(皮内)、皮肤下(皮下)、某些粘膜下(粘膜下)、静脉内(静脉内)等等施用疫苗进行全身施用。

胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素(Apx毒素)是由胸膜肺炎放线杆菌产生的蛋白毒素，其对于猪胸膜肺炎的发病机制具有重要贡献。ApxI(约105kDa)对白细胞具有强烈的溶血性和细胞毒性，并由作为apxI-CABD操纵子一部分的apxIA基因(1023个密码子)编码。ApxII(约105kDa)具有弱溶血性和中等细胞毒性。apxII操纵子含有结构基因apxIIA(956个密码子)和apxIIC基因。由apxIIIA基因(1052个密码子)编码的ApxIII(约120kDa)具有非溶血性，但对猪肺巨噬细胞具有强烈的细胞毒性。ApxIV由apxIVA基因编码，其基因在不同血清型中的长度在约1382至约1805个密码子之间变化。ApxIV与脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)铁调节RTX蛋白FrpA和FrpC具有显著的序列相似性。众所周知，APP的RTX毒素的重组表达可以产生一种蛋白，该蛋白仅是天然存在的Appx毒素的一部分(省去不是获得充分免疫应答所必需的部分)，并且与天然存在的毒素在重叠区域具有小于100％的序列同一性，优选地与任何天然存在的ApxI、ApxII、ApxIII或ApxIV的同一性大于70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、至多100％。可以使用带有默认参数的blastp算法，使用BLAST程序确定序列同一性。通常，Apx免疫原性组分的长度是全长蛋白的至少约35％(参见Infection and Immunity,Vol.70,No.11,Nov.2002,p 6464-6467)，例如35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、至多100％，但是即使显著小于35％的部分也已经显示出作为免疫原的潜在作用(参见Vaccine,17(1999),441-447)。

具体实施方式

在第一个实施方式中，疫苗包含RTX毒素ApxI。ApxI是由很多APP血清型产生的，并且在疫苗中仅具有这种毒素，因此可以获得广泛的保护。

在另一个实施方式中，疫苗是全身施用的，例如通过肌内或皮内施用。

现在将使用以下非限制性实施例进一步解释本发明。

实施例

实施例1：ApxI的重组表达

转移载体pFastbac-ApxIA的构建

基于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)菌株4074(Swissprot登录号：P55128)合成rApxIA基因。针对杆状病毒多角体蛋白(polyhedrin)使用情况对基因进行密码子优化，并包括了Kozak序列(TATAAAT)和3’六组氨酸标签。以BamHI片段形式，将rApxIA-His基因克隆在质粒pFastbac1(Life Technologies,Carlsbad,USA)的多角体蛋白启动子之后，得到质粒pFastbac-ApxIA TAT。

重组杆状病毒BacdCCApxIA-TAT的产生

根据生产厂商的实验方案，使用上文所述的质粒在Bac to Bac系统(LifeTechnologies,Carlsbad,USA)中产生重组杆状病毒。用于转化的大肠杆菌细胞含有亲本杆状病毒，并具有几丁质酶和v-组织蛋白酶基因缺失(Kaba SA,Salcedo AM,Wafula PO,VlakJM,van Oers MM.J Virol Methods.2004Dec 1；122(1):113-8)。在无动物成分(ACF)培养基中培养大肠杆菌。

从大肠杆菌中分离出BacdCCApxIA-TAT DNA，并用于转染到草地贪夜蛾(Sf)9-900细胞中。在无动物化合物的培养基中培养Sf9-900细胞。使用SDS-PAGE凝胶，Western印迹以及使用抗-组氨酸标签单克隆抗体的免疫荧光测定确认了110kDa ApxIA蛋白的表达。一旦扩增转染上清液，则将所得到的病毒原液用于所有进一步的病毒培养。

组氨酸标签纯化杆状病毒产生ApxIA

使用感染复数为0.1的BacdCCApxIA-TAT杆状病毒感染Sf9-900细胞，随后在27.5℃下培养4至5天。使用AKTA Avant蛋白纯化系统(GE Healthcare Life Sciences,Cleveland,USA)，利用HIStrap FF柱，从那些细胞纯化rApxIA-His蛋白。使用裂解缓冲液Triton X114(0.15M NaCl、10mM Tris-HCl pH8、2.5mM CaCl₂、1mM DTT、1％triton X114)由被BacdCCApxIA-TAT感染的昆虫细胞制备裂解物。离心后，将沉淀在洗涤缓冲液(50mMTris pH＝8、300mM NaCl、6M Ureum、2.5mM CaCl₂、1mM DTT)中重悬，并使用0.45μM滤器过滤，随后用于AKTA Avant。用变性洗涤缓冲液平衡色谱柱后，将样品以3ml/min的速度向色谱柱上样两次。使用氧化还原缓冲液(50mM Tris pH＝8、300mM NaCl、2.5mM CaCl₂、0.1％氧化型谷胱甘肽、0.01％还原型谷胱甘肽、1mM DTT)使结合到色谱柱上的蛋白变性，并使用线性咪唑梯度利用洗脱缓冲液(50mM Tis pH＝8、300mM NaCl、2.5mM CaCl₂、1mM DTT、500mM咪唑)从色谱柱上洗脱。使用Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo Scientific,Waltham,USA)，对纯化的ApxI蛋白在透析缓冲液(50mM Tris pH＝8、300mM NaCl、2.5mM CaCl₂)进行透析，并更换了几次缓冲液。

实施例2：疫苗有效性

疫苗制剂

制备了两种不同的疫苗进行研究。第一种疫苗包含如使用实施例1所述的方法获得的表达ApxI的纯化的杆状病毒。作为阳性对照的第二种疫苗与可商购的疫苗APP相当，其包含从A.pleuropneumoniae的培养物上清液中纯化的ApxI和ApxII(并因此与LPS复合)，也称为“天然ApxI+ApxII”。研究疫苗不同于可商购的疫苗APP，因为其不含ApxIII毒素。然而，对于使用血清型10野毒株的攻击，这是无关紧要的(血清型10不产生ApxIII)。将抗原与含有矿物油的佐剂(XSolve，可从荷兰Boxmeer的MSD AnimalHealth获得)混合，每种抗原的终浓度为25μg/ml。

接种方案

使用来自无A.pleuropneumoniae种群的3组仔猪，每组8只。在5周龄和9周龄时，以2ml剂量肌内施用两种疫苗。其余8只仔猪注射PBS，作为未接种阴性对照组。定期抽取血样进行血清学检查。

A.pleuropneumoniae血清型10攻击感染

在约12周龄时，全部24只仔猪接受攻击感染。攻击化合物为A.pleuropneumoniae的血清型10野毒株(毒株HV211)。在攻击前，新鲜制备攻击培养物。通过气溶胶途径使用A.pleuropneumoniae对仔猪进行攻击。通过Devilbis雾化器(总量30ml)给予气溶胶。通过平板计数确定攻击剂量，发现悬液中含有7.0x 10⁸CFU/ml。

攻击后，在7天时间段内每天对呼吸系统疾病和其他异常情况进行评分，然后对存活动物进行尸检。

使用如下所示的评分系统：

0＝正常 5＝腹泻

1＝发抖 6＝咳嗽

2＝沮丧 7＝腹式呼吸

3＝呼吸频率增加 8＝呼吸苦难

4＝呕吐

出于动物福利方面的原因，对发现处于濒死状态的动物实施了安乐死。

检查发现死亡或被安乐死的猪的典型胸膜肺炎放线杆菌病变，其中以0-5分对每个肺叶的程度进行评分(每只动物的最高评分：35).此外，在攻击后第7天对存活动物的肺进行评分。

结果

如通过使用天然ApxI作为包被抗原的ELISA所测量的，在实验开始时，所有猪的血清学均为阴性，并且在攻击时，接种疫苗的动物已经针对ApxI产生了血清转化。Baculo-ApxI和天然ApxI+ApxII组的主要抗体效价分别为log₂ 12.9±1.6和13.1±1.1。表1提供了攻击结果总结，和表2显示了每只猪观察到的临床异常情况。

表1仔猪的保护作用

*：与对照相比具有显著性差异(p<0.05，针对死亡率采用Fischer精确检验和针对病变评分采用Mann-Whitney U检验)

表2每组的临床异常情况

¹观察到的临床异常情况(如攻击感染后所述的评分)

²在攻击后的所示日死亡/安乐死

在两个接种组中观察到临床症状、死亡率和肺部病变均显著减少。两个疫苗组之间的差异不具有统计学显著性。因此，可以得出结论，含有由杆状病毒重组表达的RTX毒素的疫苗所提供的保护作用与商业疫苗APP所提供的保护相似。