灭活的apxia、apxiia和apxiiia毒素
阅读说明:本技术 灭活的apxia、apxiia和apxiiia毒素 (Inactivated APXIA, APXIIA and APXIIIA toxins ) 是由 V·佛罗莱恩 H·皮德 S·斯坦泽尔 F·德士肯 于 2020-01-30 设计创作,主要内容包括:公开了灭活的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA毒素、包括所述灭活的毒素的疫苗以及其用于免疫和保护哺乳动物的用途。(Inactivated ApxIIA, ApxIIA and ApxIIIA toxins, vaccines comprising the inactivated toxins and uses thereof for immunizing and protecting mammals are disclosed.)
技术领域
本发明涉及灭活的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA毒素、包括所述灭活的毒素的疫苗以及其用于哺乳动物免疫和保护的用途。
背景技术
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种革兰氏阴性细菌并且属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成员。APP是猪胸膜肺炎的病原体,猪胸膜肺炎是一种在全球养猪生产中造成巨大经济损失的严重的猪肺病。所述疾病的特征在于出血性、纤维性和坏死性肺病变。幸免于所述疾病的猪通常成为APP的无症状携带者,并且是细菌播散的主要原因。
迄今为止,基于荚膜多糖(CPS)的抗原特性并且作为基因型分析的结果,已经鉴定出18种血清型。APP的主要毒力因子是外毒素、CPS、脂多糖(LPS)和膜蛋白。最重要的毒力因子是Apx外毒素,所述外毒素属于毒素(RTX)家族中的成孔重复序列。已知毒素具有高度免疫原性,并且对于获得针对APP相关胸膜肺炎的保护性免疫非常重要。APP产生至少四种不同的Apx毒素,命名为ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。ApxI示出强溶血活性,并且ApxII示出低溶血活性。两者都对不同宿主物种的广泛细胞具有细胞毒性和活性。ApxIII是非溶血性的,但对作为主要靶标的猪肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞具有强烈的细胞毒性。ApxIV示出没有细胞毒性,并且在仅一周内具有溶血活性。没有APP的血清型产生所有四种Apx毒素。大多数血清型产生三种Apx毒素。Apx毒素产生的模式与毒力相关,其中产生ApxI和ApxII的血清型1、5、9和11是毒力最强的。
至少四种基因负责产生和分泌活性Apx毒素。基因A对结构毒素进行编码,并且基因C对酰基转移酶进行编码,这对于毒素的翻译后活化是强制性的。基因B和D对分泌成熟毒素所需的两种膜蛋白进行编码。Apx基因被组织成操纵子。ApxI和ApxII毒素的操纵子由基因CABD组成,而ApxII操纵子仅含有基因CA。因此,ApxIIA的分泌取决于ApxI操纵子的活性基因B和D。
目前,由猪的APP感染引起的胸膜肺炎通常用抗生素治疗。然而,已经发现,APP经常对通常用于治疗APP感染的抗生素中的至少一种抗生素表现出抗生素耐药性。
针对APP的疫苗接种是一种有前景的预防胸膜肺炎的预防性策略。若干种疫苗已经被商业化。可商购获得的疫苗是化学灭活的全细胞疫苗或亚单位疫苗或两者的组合。用全细胞疫苗接种的动物的免疫反应主要针对表面结构,如CPS和LPS。已知具有高度免疫原性并且对保护必不可少的分泌蛋白(如Apx毒素)的缺乏解释了用细菌疫苗观察到的有限的保护作用。此外,APP全细胞疫苗仅赋予针对用于制备疫苗的血清型的同源保护。
可商购获得的亚单位疫苗(专利EP0453024 B1)含有化学灭活的ApxA毒素以及外膜蛋白。用变性物质(如甲醛)灭活ApxA毒素可能导致类毒素的免疫原性降低。此类疫苗的缺点是由于毒素变性导致的保护不足以及由于ApxA毒素的不完全灭活而导致的可能由于剩余毒性而伴随的严重副反应。随后,由于灭活后免疫原性降低,需要使用更高量的毒素,所述更高量的毒素导致疫苗中的污染LPS的量增加。如通过商业APP亚单位疫苗所见,高LPS含量可能引起副作用。
可以得出结论,当前可商购获得的疫苗不具有令人满意的针对APP感染的安全性和/或功效特征。
此外,还有一些针对APP疫苗的其它实验方法。
专利申请W02004045639(A1)公开了一种针对猪胸膜肺炎的减毒活疫苗,所述减毒活疫苗含有在对毒素ApxIA和ApxIIA进行编码的基因的跨膜结构域中修饰的APP菌株。为了测试衰减程度,用经改进的活APP菌株接种三个月大的猪。接种后七天,处死动物并记录呼吸器官中的肉眼可见的病变。所有动物都示出其行为改变和在尸检时有肺病变。没有检查此类活疫苗的功效。
专利申请EP0810283(A2)和专利EP0861319(B1)描述了在ApxA激活基因apxC中具有缺失的活减毒APP菌株。经修饰的APP菌株不产生呈功能形式的激活蛋白ApxC,并且因此毒素ApxIA和ApxIIA未通过酰化活化。用AapxC菌株接种小鼠,并且用毒性APP野生菌株进行激发。保护接种疫苗的小鼠免受同源激发,并且部分保护免受异源激发。在猪中进行了一项研究。6头接种疫苗的猪中的1头猪在异源激发和尸检后出现肺病变。这些减毒活疫苗似乎是有效的,但这种疫苗具有安全风险。由于缺乏apxC,疫苗株产生未通过酰化活化的Apx毒素。然而,这些毒素具有毒性ApxA的原始氨基酸序列。很可能异源酰基转移酶可以酰化ApxA,从而将其转化为活性毒性形式。在世界上大多数养猪场中,存在毒性APP菌株的渐近携带者以及感染低毒性APP菌株的猪。如果用AapxC疫苗株接种此类猪,则疫苗株的未活化的ApxA毒素可以被野生菌株的功能性ApxC蛋白活化。此外,有可能通过摄取功能性apxC基因来补充apxC缺失。减毒株有可能恢复到导致接种动物患病的致病菌株。
直到今天,还没有可商购获得的减毒活疫苗。
因此,需要经改进的针对APP的疫苗,所述疫苗是安全的并且能够诱导针对猪和/或幼仔猪中的所有相关血清型的交叉保护。
因此,本发明的目的是提供灭活的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA毒素以及这些类毒素在针对猪胸膜肺炎的安全且有效的亚单位和活疫苗中的用途。
发明内容
本发明公开了对ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA毒素的酰化侧的修饰,以产生这些蛋白质的无活性但完全免疫原性的类毒素形式。两个酰化侧的两个氨基酸被另一个置换防止其被酰化。随后,这些经修饰的Apx毒素不能引发与靶细胞膜的结合并且不具有细胞毒性或溶血活性。毒素不需要化学灭活,从而产生高度免疫原性的蛋白质。产生有效亚单位疫苗所需的这些蛋白质的量相对较低。因此,污染LPS的含量也相对较低,从而产生较少副作用,如发烧和呕吐以及冷漠。由于与化学灭活的Apx亚基相比具有更好的免疫原性,因此根据本发明的亚单位疫苗提供了更好的安全性。
此外,本发明可以用于活疫苗中,因为两种氨基酸的置换基于apxA基因的基因修饰。因此,其可以转移到随后产生灭活且具有高度免疫原性的Apx蛋白的APP菌株中。这些菌株可以用作产生ApxA类毒素以及广谱的其它APP蛋白的活疫苗。这些疫苗诱导针对广泛的APP血清型的复杂免疫应答和交叉保护。由于apxA基因的基因修饰,所产生的Apx类毒素不能被异源酰基转移酶活化。在使用活APP疫苗株时,还有一些优点。与由高度免疫原性抗原组成的亚单位疫苗相比,当使用活疫苗时,预期母体抗体对疫苗的影响较低。因此,所述疫苗很可能在6周龄之前用于仔猪,并且可以避免可用疫苗的现有免疫学差距。另外的基因敲除可以用于获得甚至更减毒的疫苗株,并且使用基因敲除作为用于区分受感染的动物与疫苗接种的动物(DIVA)的标志物,例如通过缺失apxIVA基因。因此,本发明提供了比所有已知疫苗方法更好的安全性和功效特性。由于APP强烈适于猪,因此减毒的APP疫苗株也可以用作与猪相关的其它病原体的抗原的载体。
本发明由所附权利要求限定。
公开了胸膜肺炎放线杆菌的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽,其中
a.以下的野生型氨基酸序列
i.如SEQ ID NO:1中所示的ApxIA在选自由K560和K686组成的组的至少一个氨基酸中被修饰;
ii.如SEQ ID NO:2中所示的ApxIIA在选自由K557和N687组成的组的至少一个氨基酸中被修饰;以及
iii.如SEQ ID NO:3中所示的ApxIIIA在选自由K571和K702组成的组的至少一个氨基酸中被修饰,
并且所述至少一个氨基酸被不易于酰化的氨基酸交换;或
b.如在a.下定义的经修饰的氨基酸序列的类似物或片段,所述类似物或片段与如在a.下定义的所述经修饰的氨基酸序列至少90%同源,并且片段包括如在a.下定义的所述经修饰的氨基酸序列的至少50%的连续氨基酸,并且所述类似物或片段包括如在a.下定义的不易于酰化的氨基酸;或
c.以下的野生型氨基酸序列
i.如SEQ ID NO:1中所示的包含缺失的ApxIA,所述缺失包括选自由K560和K686组成的组的至少一个氨基酸;
ii.如SEQ ID NO:2中所示的包含缺失的ApxIIA,所述缺失包括选自由K557和N687组成的组的至少一个氨基酸;以及
iii.如SEQ ID NO:3中所示的包含缺失的ApxIIIA,所述缺失包括选自由K571和K702组成的组的至少一个氨基酸,
其中所述缺失不缺失所述野生型氨基酸序列的超过50%;
d.包括如在c.下定义的缺失的所述氨基酸序列的类似物,所述类似物与包括如在c.下定义的缺失的所述氨基酸序列至少90%同源。
具体实施方式
以下标题仅用于组织本公开,但不应被视为将本公开的一个部分与本公开的另一部分分开。每个部分的特征可以与任何另外部分的特征组合。
一般定义
如本文所使用的,术语“片段或类似物”定义如下:
“类似物”可以被认为是与原始氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或97%的同源性水平的氨基酸序列。如本文所使用的,同源性意味着同一性。如此,序列可能基于保守取代、缺失或插入而彼此不同。
可以使用具有默认参数的blastp算法通过蛋白质blast程序确定同一性程度,所述默认参数例如预期阈值:10,字号:3,矩阵:BLOMSUM62,空位罚分:存在:11扩展:1和组成调整:条件组成评分矩阵调整(BLAST是国家医学图书馆的注册商标)。所述程序可以用于使用蛋白质查询搜索蛋白质数据库。同一性报告所比对的查询与数据库序列之间的完全匹配。
优选地,保守氨基酸“取代”是将一种氨基酸用具有类似的结构和/或化学性质的另一种氨基酸置换(即保守性氨基酸置换)的结果。氨基酸取代可以在涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质上具有相似性的基础上进行。例如,非极性(疏水)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电荷的(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸;并且带负电荷的(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。
“插入”或“缺失”通常在约1、2或3个氨基酸的范围内。允许的变异可以通过使用重组DNA技术系统地在蛋白质中引入氨基酸的插入或缺失并测定所得重组变体的活性来实验性地确定。对于技术人员来说,这不需要超过常规实验。
多肽的“片段”包括原始多肽的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或97%。这些片段可以用作根据本发明的疫苗中的唯一活性成分。
APP“毒素”是由ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA的氨基酸序列组成的多肽(例如,如SEQID NO:1-3中所示),并且表现出细胞毒性和/或溶血活性。本公开中的“类毒素”是多肽,所述多肽是“毒素”的修饰形式,其中修饰是通过置换或缺失在APP中易于体内酰化并且不表现出任何细胞毒性或溶血活性的氨基酸来实现的。
如本文在疫苗组合物的上下文中所使用的,术语“包括”意味着可以存在另外的活性或免疫原性组分。“由……组成”意指不存在另外的组分,并且“基本上由……组成”意指可以存在特定的另外组分,即不会对疫苗的基本特性产生实质性影响的组分(即无活性或非免疫原性成分)。
放线杆菌属(Actinobacillus)包括革兰氏阴性、非孢子形成和主要包封的细菌物种,所述细菌物种定殖于呼吸道和泌尿生殖道的粘膜表面。相关的兽医物种是例如胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)、猪放线杆菌(A.suis)、马放线杆菌(A.equuli)和李氏放线杆菌(A.lignieresii),
其是本公开的优选的放线杆菌(Actinobacillus spp.)。放线杆菌通常示出强烈宿主特异性。优选的APP血清型是血清型1、5、7、8、9和11。
多肽
本公开涉及ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽(为简洁起见,以下可交换地称为ApxA多肽),其中野生型ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽已通过在野生型多肽中易于酰化的氨基酸位置处的氨基酸取代或缺失而被修饰。氨基酸取代引入不易于酰化的氨基酸。令人惊讶地发现,以上述方式修饰的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽不再表现出任何溶血和/或细胞毒性活性。因此,当用于疫苗接种哺乳动物时,其可以表现出较少的副作用,同时赋予针对APP的免疫保护。因此,其可以被认为是灭活的毒素,即类毒素。因此,本公开的多肽可以安全地用于针对APP感染的用于免疫受试者,具体地是哺乳动物的疫苗中。
在野生型多肽中,在易于酰化的氨基酸位置处包括取代的多肽
具体地,本公开涉及胸膜肺炎放线杆菌的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽,其中
a.以下的野生型氨基酸序列
i.如SEQ ID NO:1中所示的ApxIA在选自由K560和K686组成的组的至少一个氨基酸中被修饰;
ii.如SEQ ID NO:2中所示的ApxIIA在选自由K557和N687组成的组的至少一个氨基酸中被修饰;以及
iii.如SEQ ID NO:3中所示的ApxIIIA在选自由K571和K702组成的组的至少一个氨基酸中被修饰,
并且所述至少一个氨基酸被不易于酰化的氨基酸交换。
当施用于哺乳动物时,多肽可以诱导针对所述哺乳动物,具体地是猪中的APP的一种或多种血清型的体液或/和细胞免疫应答。当施用于哺乳动物时,多肽可以诱导针对所述哺乳动物,具体地是猪中的APP的一个菌株(例如,APP的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个菌株)的体液或/和细胞免疫应答。优选地,多肽诱导针对APP、PP菌株或APP血清型的无菌免疫。
ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA中的每一个包括两个易于酰化的氨基酸。修饰可能影响一个或两个所述氨基酸。
本公开还涉及如上文所定义的经修饰的氨基酸序列的类似物或/和片段,所述类似物或/和片段与如上文所定义的经修饰的氨基酸序列至少90%同源,并且片段包括如上文所定义的经修饰的氨基酸序列的至少50%的连续氨基酸,并且类似物或片段包括如上文所定义的不易于酰化的氨基酸。
如上文所定义的,类似物可以通过缺失或保守取代与野生型不同。然而,类似物总是包括置换易于酰化的氨基酸的那些氨基酸。
由于经修饰的多肽不含易于酰化的氨基酸,因此经修饰的多肽不能被酰化。以这种方式修饰的多肽不能被任何内源性或外源性酰基转移酶(例如,胸膜肺炎放线杆菌的ApxC)酰化。如下面实验性地示出的,那些经修饰的多肽不再表现出显著的病理学效应,并且因此可以安全地用于疫苗组合物中。与缺失酰基转移酶ApxC的疫苗相比,这些经修饰的多肽在疫苗组合物中使用更安全,因为即使通过天然存在的APP菌株或体内酰基转移酶的任何其它来源外源性地提供酰基转移酶,所述经修饰的多肽仍保持病理性的。相同的考虑适用于以下多肽,其中APP的一个或两个易于酰化的氨基酸被缺失。
在野生型多肽中,在易于酰化的氨基酸位置处包括缺失的多肽
代替取代野生型多肽中易于酰化的氨基酸,还可以缺失氨基酸以消除野生型多肽的病理效应。
因此,本公开还涉及胸膜肺炎放线杆菌的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽,其中野生型氨基酸序列为
i.如SEQ ID NO:1中所示的包含缺失的ApxIA,所述缺失包括选自由K560和K686组成的组的至少一个氨基酸;
ii.如SEQ ID NO:2中所示的包含缺失的ApxIIA,所述缺失包括选自由K557和N687组成的组的至少一个氨基酸;以及
iii.如SEQ ID NO:3中所示的包含缺失的ApxIIIA,所述缺失包括选自由K571和K702组成的组的至少一个氨基酸。
当施用于哺乳动物时,多肽可以诱导针对所述哺乳动物,具体地是猪中的APP的一种或多种血清型的体液或/和细胞免疫应答。当施用于哺乳动物时,多肽可以诱导针对所述哺乳动物,具体地是猪中的APP的一个菌株(例如,APP的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个菌株)的体液或/和细胞免疫应答。优选地,多肽诱导针对APP、APP血清型、APP菌株或APP血清型的无菌免疫。
如上所述,ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA中的每一个包括两个易于酰化的氨基酸。所述氨基酸的缺失可以包括所述氨基酸中的一个或两个。
因此,缺失可以包括点缺失,其中仅缺失每个野生型序列中易于酰化的一个或两个氨基酸。还公开的是,所述缺失还缺失了邻近易于酰化的一个或两个氨基酸的区域中的氨基酸。因此,相应缺失可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、350个、400个氨基酸,只要缺失包括易于酰化的两个氨基酸之一。易于酰化的每个氨基酸的缺失大小可以彼此独立,或者具有相同的大小。还公开了覆盖易于酰化的两个氨基酸之间的连续氨基酸段的缺失。
所述缺失不会缺失所述野生型氨基酸序列的超过50%。
本公开还涉及如上文所定义的经修饰的氨基酸序列的类似物,所述类似物与如上文所定义的所述经修饰的氨基酸序列至少90%同源,并且类似物不包括如上文所定义的不易于酰化的氨基酸。此类类似物可以包括如与一般定义有关的部分中所定义的保守取代和缺失。因此,多肽可以包括在缺失区域之外的另外的缺失,所述缺失区域包括易于酰化的一个或两个氨基酸,但是这些缺失将仅缺失1、2、3个氨基酸。
不易于酰化的氨基酸
易于酰化的氨基酸是天然存在的氨基酸,例如赖氨酸和/或天冬酰胺。本领域技术人员已知不易于酰化的氨基酸,并且所述氨基酸可以用于取代易于酰化的氨基酸中的一个或两个氨基酸。例如,不易于酰化的氨基酸可以独立地选自由以下组成的组:丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和谷氨酸。具体地,不易于酰化的氨基酸可以独立地选自由以下组成的组:丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。
此外,不易于酰化的氨基酸可以独立地选自由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸组成的组。不易于酰化的最优选的氨基酸是丙氨酸。
具有两个经修饰的氨基酸的APXIA、APXIIA或APXIIIA多肽
优选地,在ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA中的每一个中修饰两个易于酰化的氨基酸。
因此,如SEQ ID NO:1中所示的ApxIA的野生型序列在K560和K686处被修饰。因此,如SEQ ID NO:2中所示的ApxIIA的野生型序列在K557和N687处被修饰。因此,如SEQ ID NO:3中所示的ApxIIIA的野生型序列在K571和K702处被修饰。
还公开的是,在ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA中的每一个中易于酰化的所述两个氨基酸被修饰成丙氨酸。
因此,所公开的经修饰的多肽可以具有如SEQ ID NO:4、5或6中所示的序列,或者是如上文所定义的类似物或其片段。
核酸
还公开了包括能够编码上述多肽的核酸序列的核酸。所公开的核酸可以是cDNA、DNA、RNA、cRNA或PNA(肽核酸)。术语“核酸序列”是指这些核苷酸的序列的核苷酸的杂聚物。核酸可以包括如SEQ ID NO:10、11或12中所示的核酸。
核酸可以包括在适于克隆或表达本公开的核酸的载体中。示例性载体是pEX-A258(SEQ ID NO:19)、pQE-80L(SEQ ID NO:20)或pQE-60(SEQ ID NO:21)。核酸或载体可以包括另外的调节性非编码元件,如诱导型或非诱导型启动子、操作子(例如,lac操作子)或编码其它AP蛋白的核酸。进一步地,优选的是,根据本发明的疫苗组合物的特征进一步在于整合到载体中的多核苷酸,其中多核苷酸可操作地连接到载体的表达控制区。因此,还公开了一种表达载体,其中除了编码ApxA的修饰形式的核酸序列之外,表达载体优选地包括一个或多个调节序列。术语“表达载体”通常是指用于从DNA(RNA)序列表达多肽的质粒或噬菌体或病毒或载体。表达载体可以包括转录单元,所述转录单元包括以下的组装:(1)遗传元件或在基因表达中具有调节作用的元件,例如启动子或增强子;(2)被转录成mRNA并被翻译成蛋白质的结构或编码序列;(3)适当的转录起始和终止序列。旨在用于酵母或真核表达系统中的结构单元优选地包含使宿主细胞能够胞外分泌经翻译的蛋白质的前导序列。可替代地,在表达重组蛋白而没有前导序列或转运序列的情况下,其可以包含N端甲硫氨酸残基。此残基可以或可以不随后从所表达的重组蛋白上切割下来以提供最终产物。
微生物
还公开了包括所公开的核酸或/和上述载体的微生物。微生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)(即大肠杆菌菌株(例如,大肠杆菌Top10F'菌株)或胸膜肺炎放线杆菌(即胸膜肺炎放线杆菌菌株,例如ST2(例如,APP23)、ST2(例如,07/07)、ST5(例如,DZY47)、ST7(例如,DZY33)或ST8(例如,DZY49)。微生物还包括其它基因的核酸或/和载体。
疫苗组合物
还公开了包括一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包括如上文所定义的至少一种经修饰的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽、如上文所定义的核酸分子或如上文所定义的载体或如上文所定义的微生物。疫苗组合物可以至少包括药物载体、稀释剂或/和佐剂。
根据本发明的疫苗组合物的制备是本领域已知的,并且在本领域技术人员已知的手册中进行了描述。为了生产根据本发明的疫苗组合物,药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂包括但不限于以下:矿物盐佐剂(例如,铝、钙、铁、锆基)、张力活性佐剂(例如,Quil A、QS-21、其它皂苷)、细菌源性佐剂(例如,N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、DNA、CpG、细菌毒素)、佐剂乳剂(例如,FIA、Montanide、佐剂65、Lipovant)、脂质体佐剂、聚合物佐剂和载体、细胞因子(例如,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、碳水化合物佐剂、活抗原递送系统(例如细菌,特别是经修饰的APP)。此外,载体还可以包括干调配物,如由钛或聚合物制成的包衣贴剂。用于调配和施用本申请的疫苗的技术也可以在《雷明顿:药学科学与实践(Remington,theScience and Practice of Pharmacy)》,第22版中找到。
作为单位组合物的疫苗组合物可以包括0.01-2.0mg蛋白质、0.01-2.0mg核酸或0.5-200mg(或1×104CFU-1×1010CFU,集落形成单位)微生物。所需活性量的蛋白质、核酸或微生物可以通过本领域技术人员的常规测试方法,例如在猪或仔猪中测定。
如上所述包括至少一种ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽的疫苗组合物可以是亚单位疫苗。亚单位疫苗可以进一步包括APP多肽。
还设想到,疫苗基本上仅含有核酸或载体,例如是DNA疫苗。DNA疫苗是第三代疫苗。核酸或DNA疫苗含有编码来自APP的特异性蛋白(ApxA)的DNA/核酸。将DNA/核酸注射到哺乳动物体内并被细胞摄取,所述细胞的正常代谢过程基于其所摄取的核酸中的遗传密码合成蛋白质。因为这些蛋白质含有APP特有的氨基酸序列区,所以这些蛋白质被识别为外来的,并且当其被宿主细胞加工并展示在其表面上时,免疫系统会受到警告,然后触发免疫应答。
可替代地,可以将核酸包封在蛋白质中以促进细胞进入。如果核酸中包含这种衣壳蛋白,则所得疫苗可以结合活疫苗的效力,而无逆转风险。
疫苗组合物中如上所述的微生物可以是放线杆菌(例如,胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌)、放线杆菌菌株(例如,胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌的菌株)或放线杆菌菌株的特定血清型。疫苗组合物可以包括至少1种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种)放线杆菌菌株或放线杆菌菌株的血清型。放线杆菌、菌株或血清型中的每一种可以编码如上文所定义的至少一种多肽。
疫苗组合物中如上所述的微生物可以不包括编码与所公开的经修饰的ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽不同的APP蛋白的APP核酸。例如,微生物可以包括apxIV基因或/和sxy基因的缺失。
另外,疫苗组合物中的胸膜肺炎放线杆菌中的至少一种可以包括以下修饰中的一种或至少两种(例如,单个或多个缺失):ΔtbpA、ΔtonB2、ΔsodC、ΔdsbA、Δfur、ΔmIcA、ΔmgIA、ΔexbB、ΔureC、双突变体ΔexbB ΔureC、ΔfhuA、ΔhlyX、双突变体ΔapxIC和ΔapxIIC、三突变体ΔapxIC ΔapxIIC Δorf1、六突变体ΔapxIIA ΔureC ΔdmsA ΔhybBΔaspA Δfur、双突变体ΔapxIIIB ΔapxIIID、双突变体ΔcIpP和ΔapxIIC、ΔznuA、ΔapfA、双突变体ΔapxIIA和ΔureC、五突变体ΔapxIC ΔapxIIC Δorf1 ΔcpxAR ΔarcA、双突变体ΔapxIC ΔompP2、双突变体ΔapxIICΔapxIVA、灭活apxIIC、灭活apxIC、Δlip40、ΔcpxA/cpxR、ΔpotD2、ΔtolC2、ΔsapA或ΔPdxS/PdxT。
ApxIA的类毒素形式以及如上文所公开的包括至少一种ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽的疫苗组合物表现出显著增加的免疫原性和保护功效。ApxIA的类毒素形式以及如上文所公开的包括至少一种ApxIA、ApxIIA或ApxIIIA多肽的疫苗组合物不表现出细胞毒性效应和溶血效应,并且不会导致免疫后体温显著升高,这种升高可能在常规免疫后发生。
上述修饰公开于:
Baltes,Nina;Hennig-Pauka,Isabel;Gerlach,Gerald-F(2002):两种转铁蛋白结合蛋白都是胸膜肺炎放线杆菌血清型7感染的毒力因子(Both transferrin bindingproteins are virulence factors in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7infection),《欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS microbiology letters)》209(2),第283-287页,
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预期如本文所公开的经修饰的多肽与上文所列出的另外已知修饰的组合将导致胸膜肺炎放线杆菌协同衰减。
医疗用途或方法
所公开的疫苗组合物可以用于受试者的肺炎、胸膜炎或胸膜肺炎,具体地是由胸膜肺炎放线杆菌引起的肺炎、胸膜炎或胸膜肺炎的预防性、补救预防性(metaphylactic)或治疗性治疗。被治疗的受试者可以是哺乳动物,具体地是猪。疫苗组合物可以通过肌肉内、皮内、静脉内、皮下或通过粘膜应用(例如,鼻内)施用。
疫苗组合物可以使用如上所述的单位组合物通过至少一次(例如,一次或两次)施用来施用。具体地,所述组合物可以在受试者出生当天、出生3天、1周、2周、4周、6周、8周、10周或12周内首次施用。因此,可以有利地在哺乳动物的早期时间点施用疫苗。然而,还公开的是,所述疫苗可以在哺乳动物的生命的任何时间点施用。
疫苗组合物可以在第二时间内施用,其中两次施用之间的时间段可以介于1周与4周之间、介于1周与3周之间、或介于1周与2周之间。优选地,包括微生物的疫苗组合物仅施用一次。
附图说明
图1展示了使用从APP上清液中分离的BL-3细胞和ApxA毒素建立细胞毒性测定。
图2展示了使用BL-3细胞以及基因修饰的ApxIA和野生型ApxIA毒素(A)和基因修饰的ApxIIIA和野生型ApxIIIA毒素(B)进行的细胞毒性测定。
图3展示了使用从APP上清液中分离的绵羊血和ApxA毒素建立溶血测定。
图4展示了用绵羊血和基因修饰的ApxIA和野生型ApxIA毒素进行的溶血测定。
图5:首次疫苗接种(A)和第二次疫苗接种(B)后6小时的直肠体温。每个点代表个体动物的直肠体温。条形图表示具有95%置信区间的中值。邓恩多重比较检验(Dunn'smultiple comparison test);*=p<0.05;**=p<0.01。
图6:猪血清中ApxIA-、ApxIIA-和ApxIIIA特异性IgG的定量。使用ELISA对与不同抗原结合的IgG进行定量。分析来自疫苗接种前(d0)、首次疫苗接种后2周(d14)和第二次疫苗接种后2周(d28)的不同组的猪的血清。将每个时间点的定量的平均组IgG值与第1组的对应时间点进行比较。邓恩多重比较检验;*=p<0.05;**=p<0.01。条形图表示中值。AU:任意单位。
图7:使用6μg活性ApxIA毒素和来自第二次疫苗接种后两周的猪的血清进行血清中和测定。使用由代谢活性细胞代谢的WST-1评估细胞的活力。图例在括号中显示了动物编号和ApxIA特异性IgG ELISA数据(A)。通过非线性回归曲线计算ymax/2的x值(血清浓度)(B)。邓恩多重比较检验;**=p<0.01;n.s.=不显著。条形图表示中值。AU:任意单位。
图8:在用APP血清变型9激发接受“疫苗1”(第1组)、(第2组)或安慰剂(第3组)的三组之后累积的临床评分。将累积的临床评分与第3组的对应临床评分进行比较。邓恩多重比较检验;*=p<0.05;**=p<0.01。条形图表示中值。
图9:在用APP血清变型9激发接受“疫苗1”(第1组)、(第2组)或安慰剂(第3组)的三组之后猪的存活率。第1组和第2组的存活率为100%,而第3组中37.5%的动物由于由APP引起的严重症状而死亡或由于动物福利原因而不得不被实施安乐死。
图10:在用APP血清变型9激发接受“疫苗1”(第1组)、(第2组)或安慰剂(第3组)的三组之后的肺病变评分。将第1组和第2组的肺损伤评分与对应的肺病变评分对照组(组3)进行比较。邓恩多重比较检验;*=p<0.05;**=p<0.01。条形图表示中值。
实例
以下实例提供了解释本发明的实验数据,并且仅应被理解为说明本发明。具体地,可设想到,实例中公开的每个特定特征可以与描述的前面部分的特征组合。
实例1:野生型和经修饰的APXIA、APXIIA或APXIIIA在PEX-A258中的克隆
从数据库uniprot获得野生型ApxIIA-ApxIIIA的蛋白序列,即ApxIIA APP ST5b(uniprot:A3N292)、ApxIIA APP ST3(uniprot B0BPP0,其中修饰为S148G)和ApxIIIA ST8(uniprot:P55131)。
另外,提供了包括以下修饰的蛋白质序列:表1
核酸源自蛋白质序列,其中核酸序列被密码子优化并合成制造(EurofinsGenomics)而没有起始密码子。质粒pEX-A258(SEQ ID NO:19)中提供了每个核酸序列,所述质粒侧接有5'端处的限制位点BamHI和3'端处的Sacl。
实例2:野生型和经修饰的APXIA-APXIIIA基因在PQE-80L(SEQ ID NO:20)中的克隆和表达
根据制造商的说明,使用BamHI FD(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))和SaclFD(赛默飞世尔科技公司)对1μg的pEX-A258(包括相应的ApxIA-ApxIIIA)进行限制,并通过1%琼脂糖凝胶进行分解。从琼脂糖凝胶(QUIAEX-II)中提取适当大小的核酸片段。根据制造商的说明,用BamHI FD(赛默飞世尔科技公司)和Sacl FD(赛默飞世尔科技公司)对pQE-80L进行限制。在室温下,使用T4-DNA连接酶(赛默飞世尔科技公司)以1:5的比率使pQE-80L与相应的核酸片段连接过夜。将所连接的DNA电穿孔到大肠杆菌Topf10F'中,并且通过限制分析和测序证实ApxIA-ApxIIIA的野生型和经修饰的形式的成功克隆。pQE-80L包括氨苄青霉素耐药性。
实例3:APXIC、APXIIC和APXIIIC基因在PQE-60中的克隆
使用表2中所示的引物,通过聚合酶链式反应(PCR)从APP-DNA中扩增apxIC-IIIC基因,并且随后进行纯化。
根据相应制造商的说明,用下表2中所示的限制酶对包括相应apxIC-IIIC核酸和pQE-60的PCR片段进行限制,并通过1%琼脂糖凝胶进行分解。
表2
从琼脂糖凝胶(QUIAEX-II)中提取适当大小的核酸片段。在室温下,使用T4-DNA连接酶(赛默飞世尔科技公司)以1:5的比率使pQE-60与相应的核酸片段连接过夜。
将所连接的DNA电穿孔到大肠杆菌Topf10F'中,并且通过限制分析和测序证实成功克隆。
实例4:APXIC、APXIIC和APXIIIC基因在PACYC184中的克隆和表达
使用下表3中所示的引物,从实例2的相应pQE-60载体扩增相应的apxIC、apxIIC和apxIIIC基因。
表3
以此方式,启动子/lac操作子和核糖体结合位点也包含在扩增子中(SEQ ID NO:16、17和18)。
使用表3中所示的限制酶限制相应的PCR产物,并且使用与上述相同的方法和条件通过限制位点Xbal和Nrul(apxIC和apxIIIC)或Clal/Bscl和Nrul(apxIIC)将所述产物克隆到pACYC184中。pACYC184包括氯霉素耐药性。
将所连接的DNA电穿孔到大肠杆菌Topf10F'中,并且通过限制分析和测序证实成功克隆。
实例5:包括APXIC、APXIIC或APXIIIC基因的PACYC184和包括APXIA、APXIIA或APXIIIA的PQE-80L的共转化
ApxC是激活ApxA毒素所必需的。相应地,将包括在实例4中获得的相应apxIC、apxIIC或apxIIIC基因的pACYC184与包括相应apxIA、apxIIA或apxIIIA基因的pQE-80L共转化到大肠杆菌Topf10F'中,并且在包括50μg/ml氨苄青霉素和15μg/mll氯霉素的LB琼脂板上选择成功的共转化。通过限制分析证实了转化成功。
实例6:表达和分离APXA,具体地是APXIA、毒素和类毒素
使用如在实例5中获得并且包括编码相应ApxA和ApxC基因的pACYC184和pQE-80L的大肠杆菌集落接种40ml LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素)。将培养物在30℃下在振荡下温育过夜。第二天,将过夜培养物接种在400ml LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素)中,使得光密度达到0.1(600nm处的光密度=OD600)。将所获得的培养物在振荡下温育直到获得0.5的OD600为止。为了诱导重组蛋白的表达,加入1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)。将培养物在30℃下在振荡下温育另外4小时。随后,使培养物在7000g下离心10分钟。在去除上清液后,将细菌沉淀物重新悬浮于LEW缓冲液中(50mMNaH2PO4,含300mM NaCl的Aqua dest.;pH 8.0),其中每1g细菌沉淀物5ml LEW缓冲液,并将其储存在-20℃下。
向10ml重新悬浮的细菌沉淀物中加入1ml 10x Bug-Buster(诺瓦根公司(Novagen))、5μl Benzoase(25U/μl,诺瓦根公司)和10mg溶菌酶。使所获得的悬浮液在室温下缓慢旋转持续20分钟。在4℃和15000g下离心60分钟后,在LEW缓冲液(每1mg沉淀物10mlLEW缓冲液)中洗涤沉淀物并离心(4℃,15000g,60分钟)。将洗涤后的沉淀物重新悬浮于每1g沉淀物2ml变性溶解缓冲液(含8M尿素的LEW缓冲液;pH=8.0)中,并且随后每10ml重新悬浮的沉淀物加入1ml Bug Buster(诺瓦根公司)。将悬浮液在4℃下温育1小时,并且随后离心(4℃,18000g,15分钟)。含蛋白质的上清液用于后续步骤中以进行柱蛋白纯化。
根据制造商的说明,用4ml平衡缓冲液(含8M尿素的LEW缓冲液;pH=8.0)平衡柱(Protino Ni-IDA 2000柱,Machery-Nagel)。随后,向柱中装载一半含蛋白质的上清液,并用4ml平衡缓冲液(总共8ml缓冲液)洗涤两次。用3ml洗脱缓冲液(具有250mM咪唑的平衡缓冲液,总共6ml缓冲液)洗脱蛋白质两次。用另一半含蛋白质的上清液重复所述程序。合并含蛋白质的洗脱液,并在4℃下在pH为8.0的含1M尿素的PBS中透析过夜。用含0.5M尿素的PBS(pH 8.0)交换透析缓冲液,并继续透析另外4小时。随后,用不含尿素的PBS(pH 8.0)交换缓冲液并透析另外4小时。根据制造商的说明,使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定蛋白质浓度。将蛋白质储存在-80℃下直到使用为止。
实例7:从APP中分离APXA毒素
溶液APPVX含有1g D(+)-葡萄糖(一水合物)、0.1g L-谷氨酰胺、0.362g L-半胱氨酸盐酸盐(一水合物)和10mL无核酸酶H2O。将APP分离物平板接种于包括IsovitaleX的巧克力琼脂上,并在37℃下温育过夜。合并三个APP集落,并且使用所述集落接种3ml Columbia培养基(10mM Ca2+,0.2mg/mL NAD,1%APPVX),并且将所获得的培养物在37℃下在振荡下温育5小时。随后,使培养物在3200g和4℃下离心20分钟。将澄清的上清液转移到新管中,并且逐渐添加44.05g硫酸铵并混合,直到硫酸铵完全溶解为止。随后,将溶液在4℃下温育过夜。使所沉淀的蛋白质在3200g和4℃下离心3小时并去除上清液。使蛋白质沉淀物风干,并且随后悬浮于包括6M尿素的1mL PBS中。为了去除残留的缓冲液,在PDMidiTrap G25柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上通过凝胶过滤纯化所获得的蛋白质溶液。在与包括6M尿素的PBS平衡后,将1ml蛋白质溶液装载到凝胶过滤柱上,并且随后用包括6M尿素的1.5ml PBS洗脱。随后,将经洗脱的蛋白质储存在-20℃下。通过SDS-PAGE确认经洗脱的蛋白质的同一性。
实例8:细胞毒性测定的建立
为了分析重组ApxA蛋白(野生型和类毒素形式)的细胞毒性活性,使用BL3细胞(BL3.1CRL-2306)作为靶细胞进行细胞毒性测定。从牛B细胞获得BL3细胞,已知所述BL3细胞可以被ApxA毒素裂解(Tu,A.H.;Hausler,C.;Young,R.;Struck,D.K.(1994):来自胸膜肺炎放线杆菌的ApxIIA毒素的细胞毒性和溶血活性的差异表达(Differential expressionof the cytotoxic and hemolytic activities of the ApxIIA toxin fromActinobacillus pleuropneumoniae),《感染与免疫》62(5),第2119-2121页)。将如在实例7中获得的ApxA毒素用作阳性对照,并且将包括6M尿素的PBS用作阴性对照。
在37℃和5%CO2下在培养基(含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%FCS和1×非必需氨基酸的DMEM培养基)中培养BL3细胞。使用具有25ml培养基的T75烧瓶进行培养。每周用50,000个细胞/cm2传代BL3细胞以接种新的烧瓶。
为了用于细胞毒性测定中,将培养基中的50μl BL3细胞转移到96孔板的孔中。在DMEM中稀释重组蛋白和对照。将50μl经稀释的重组蛋白和对照添加到包括细胞的每个孔中。随后,将板在37℃和5%CO2下温育24小时。在显微镜上评估细胞形态之后,向每个孔中加入10μlWST-1(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)),并将板在37℃和5%CO2下温育另外24小时。
随后,用ELISA读数器在450nm下测定吸收。在活细胞的细胞表面上通过复杂细胞机构将WST-1切割到可溶性甲臜。相应地,所形成的甲臜染料的量和ELISA读取器中的消光读数与培养物中的代谢活性细胞的数量直接相关。
实例9:溶血测定的建立
为了分析重组ApxA蛋白(野生型和类毒素形式)的溶血活性,建立了溶血测定。使用包括具有5%绵羊血的Columbia琼脂(贝迪公司(Bection Dickinson))的细胞培养板。从细胞培养板上冲出直径为3mm的孔洞。将10μl的相应重组蛋白和对照样品填充到孔洞中,并将板在37℃下温育过夜。将如在实例7中获得的ApxA毒素用作阳性对照,并且将包括6M尿素的PBS用作阴性对照。
当绵羊血琼脂脱色并因此呈现白色时,认为存在溶血活性。
实例10:从APP中分离APXA毒素
使用实例7中描述的表达和分离方法,使用APP菌株ST2、ST5、ST7和ST8分离包括ApxA毒素的上清液。SDS-PAGE显示上清液在对应于ApxIA、ApxIIA、ApxIIIA和ApxIVA的预期分子量位置处含有条带(数据未示出)。因此,相应菌株ST2、ST5、ST7和ST8的所获得的上清液中的每一种包括ApxIA、ApxIIA、ApxIIIA和ApxIVA的混合物。
实例11:来自APP的APXA在BL3细胞中的细胞毒性
使用实例8的方法,在DMEM(1:8、1:16、1:32;1:64,1:128;1:256、1:512;1:1024、1:2048、1:4096)中以增加的稀释度测试50μl从APP(APP菌株ST2、ST5、ST7和ST8)获得的实例7的ApxA毒素。
观察到APP上清液的细胞毒性效应随稀释度的增加而降低(见图1)。ST8的分离毒素表现出最高的细胞毒性,而ST7的分离毒素示出最低的毒性。没有观察到ApxA制剂中的LPS与细胞毒性的相关性(数据未示出)。
实例12:BL-3细胞中的APXIA和APXIIIA的重组形式的细胞毒性
使用实例8的方法对以下样品进行测试。
表4
在DMEM(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512)中以递增的稀释度测试50μl的每个样品。
具有细胞的对照使用PBS稀释液评估PBS的影响。未发现任何效应(见图2)。图2中展示了结果。
如图2a所示,细胞毒性测定证明重组野生型ApxIA能裂解BL3细胞,并且因此具有活性。从1:64(13.1μg/ml野生型ApxIA毒素)的稀释度开始,细胞活力值与PBS对照的活力值相当。已经用ApxIA类毒素形式温育的BL3细胞的活力与PBS对照的活力相当。这也适用于细胞形态(数据未示出)。
由于ApxIA的类毒素形式对细胞活力和形态的影响与PBS对照相同,而野生型ApxIA形式对BL3细胞有很强的细胞毒性作用,因此可以得出结论,ApxIA的类毒素形式无细胞毒性作用。关于ApxIIA(数据未示出)和ApxIIIA(图2B)的类毒素形式也获得了类似的结果。
实例13:来自APP的APXA的溶血活性
使用实例9的方法,测试从APP(APP菌株ST2、ST5和ST8)获得的实例7的10μl ApxA毒素。
图3中展示了结果。如可以从图3中从左到右逐渐变白的颜色中推断出,菌株ST8表现出强烈的溶血性,ST5表现出中度溶血性,而ST2没有溶血性。已知,ApxIA、ApxIIA和ApxIIA中的每一种并不能裂解红细胞。由于不同菌株分泌不同量的相应的ApxA形式,因此来自包括不同ApxA形式的混合物的相应菌株的上清液可以表现出不同的溶血活性。
总之,可以证明,ApxA毒素的溶血活性可以在涉及使用包括5%绵羊血的Columbia琼脂的方法中证明,如实例9所述。
实例14:APXIA的重组形式的溶血活性
使用实例9的方法对以下样品进行测试。
表5
图4中展示了结果。虽然ApxIA野生型形式可裂解红细胞,但是ApxIA类毒素形式不可裂解红细胞。ApxIIIA野生型形式未示出溶血活性,如在文献中也描述的一样。
由于ApxIA的类毒素形式与PBS对照具有相同(即无)溶血作用,而野生型ApxIA形式对绵羊红细胞具有强烈的溶血作用,因此可以得出结论,ApxIA的类毒素形式无溶血作用。获得了与ApxIIA的类毒素形式类似的结果(数据未示出)。
实例15:本发明的APXIA、APXIIA和APXIIIA多肽在猪中的免疫原性
(1)抗原和疫苗调配物的制备
合成制造了编码针对在大肠杆菌中表达而密码子优化的经修饰的ApxIA(SEQ IDNO:4)、ApxIIA(SEQ ID NO:5)和ApxIIIA(SEQ ID NO:6)的核酸(Eurofins Genomics),并且质粒pEX-A258(SEQ ID NO:19)中提供的序列的侧接有5'端处的限制位点BamHI和3'端处的Sacl。根据说明,用BamHI-FD(赛默飞世尔科技公司)和Sacl-FD(赛默飞世尔科技公司)限制包括相应的ApxIA和ApxIIIA的1μg pEX-A258。编码ApxIIA的AA 439-801的核苷酸使用含有ApxIIA基因和引物(正向:GCAGGATCCCAGGGGTATGATTCACGC和反向:GGTGAGCTCTTAGGTGATGGAGTCGTTGCC)的pEX-A258(SEQ ID NO:19)通过PCR进行扩增,从而在5'端处引入BamHI并且在3'端处引入Sacl限制位点。根据制造商的说明,使用QIAquick PCR纯化试剂盒250(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物,并使用BamHI FD(赛默飞世尔科技公司)和Sacl FD(赛默飞世尔科技公司)进行限制。通过1%琼脂糖凝胶分解经限制的ApxIA、ApxIIA(截短的)和ApxIIIA。从琼脂糖凝胶(QUIAEX-II)中提取适当大小的核酸片段。根据制造商的说明,用BamHI FD(赛默飞世尔科技公司)和Sacl FD 10(赛默飞世尔科技公司)对pQE-80L进行限制。在室温下,使用T4-DNA连接酶(赛默飞世尔科技公司)以1:5的比率使pQE-80L与相应的核酸片段连接过夜。将所连接的DNA电穿孔到大肠杆菌TopflOF'中,并通过限制分析和测序证实ApxIA、ApxIIA(截短的)或ApxIIIA的经修饰的形式的成功克隆。pQE-80L包括氨苄青霉素耐药性。根据实例5中所述的方法,在大肠杆菌Topf10F'中将编码经修饰的ApxIA、ApxIIA(截短的)或ApxIIIA的相应pQE-80L与编码源自实例4的相应apxIC、apxIIC和apxIIIC的pACYC184质粒共转化。共转化后,在包括50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml氯霉素的LB琼脂板上选择大肠杆菌Topf10F'。所获得的大肠杆菌集落包括:
-对经改进的ApxIA进行编码的pQE-80L和对ApxIC进行编码的pACYC184
-对截短的ApxIIA(截短的)进行编码的PQE-80L和对ApxIIC进行编码的pACYC184
-对经改进的ApxIIIA进行编码的PQE-80L和对ApxIIIC进行编码的pACYC184,
用于接种40ml LB培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素、30μg/ml氯霉素)。将培养物在30℃下在振荡下温育过夜。将过夜培养物接种于400ml LB培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素、30μg/ml氯霉素),使得光密度达到0.1(600nm处的光密度=OD600)。将所获得的培养物在振荡下进一步温育直到获得0.5的OD600为止。为了诱导重组蛋白的表达,加入1mMIPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)。将培养物在30℃下在振荡下温育另外4小时。随后,使培养物在7,000g下离心10分钟。在去除上清液后,将细菌沉淀物重新悬浮于LEW缓冲液(50mM NaH2P04,含300mM NaCl的Aqua dest.;pH 8.0)中,其中每1g细菌沉淀物5ml LEW缓冲液,并将其储存在-20℃下。向10ml重新悬浮的细菌沉淀物中加入1ml 10xBug Buster(诺瓦根公司)、5μl Benzoase(25U/μl,诺瓦根公司)和10mg溶菌酶。使所获得的悬浮液在室温下缓慢旋转持续20分钟。在4℃和15,000g下离心60分钟后,在LEW缓冲液(每1mg沉淀物10mlLEW缓冲液)中洗涤沉淀物并离心(4℃,15000g,60分钟)。将洗涤后的沉淀物重新悬浮于每1g沉淀物2ml变性溶解缓冲液(含8M尿素的LEW缓冲液;pH=8.0)中,并且随后每10ml重新悬浮的沉淀物加入1ml Bug Buster(诺瓦根公司)。将悬浮液在4℃下温育1小时,并且随后离心(4℃,18,000g,15分钟)。含蛋白质的上清液用于后续步骤中以进行柱蛋白纯化。根据制造商的说明,用4ml平衡缓冲液(含8M尿素的LEW缓冲液;pH=8.0)平衡柱(Protino Ni-IDA2000柱,Machery-Nagel)。随后,向柱中装载一半含蛋白质的上清液,并用4ml平衡缓冲液(总共8ml缓冲液)洗涤两次。用3ml洗脱缓冲液(具有250mM咪唑的平衡缓冲液,总共6ml缓冲液)洗脱蛋白质两次。用另一半含蛋白质的上清液重复所述程序。合并含蛋白质的洗脱液级分,并在4℃下在pH为8.0的含1M尿素的PBS中透析过夜。用含0.5M尿素的PBS(pH 8.0)交换透析缓冲液,并继续透析另外4小时。随后,用不含尿素的PBS(pH 8.0)交换缓冲液并透析另外4小时。根据制造商的说明,使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定蛋白质浓度。将相应的ApxA抗原无菌过滤(0.2μm),并储存在4℃下直到调配为止。
根据制造商的说明,使用Montanide ISA 201VG(批号36075M,Seppic)调配具有相应经改进的ApxIA、ApxIIA(截短的)和ApxIIIA的测试批次(表6)。简而言之,将佐剂和抗原在水浴中预温热到31℃。通过添加无菌PBS使抗原体积达到与佐剂相同的量(50:50,w/v),并使其进一步保持在31℃下。在烧杯中缓慢搅拌Montanide ISA 201VG。随后,将抗原添加到佐剂中,并在31℃下进一步搅拌持续5分钟。将调配物储存在20℃下持续1小时,装入玻璃小瓶中,并且进一步储存在4℃下,直到使用为止。
表6:调配用于免疫原性研究的不同测试批次
(2)动物研究(免疫原性)
通过在ELISA中定量ApxIA-、ApxIIA-和ApxIIIA特异性IgG抗体并且评估疫苗接种8周龄猪之后血清中的ApxIA中和特性来确定疫苗调配物的免疫原性。
动物
从商品猪饲养员(BHZP,21337Luneburg,Zuchtbetrieb Garlitz(DE-LWL 1051))获得两种性别的猪(雄性[阉割的]和雌性)。用唯一耳标编号标识每头猪,并使每头猪经受兽医检查以符合研究方案中规定的纳入/排除标准。所有动物均未示出APP感染的临床体征,并且在研究开始时动物没有临床体征(呼吸困难、咳嗽、腹泻、跛行)。在纳入本研究之前,在可商购获得的APP-ApxIV ELISA(IDEXX)中确认动物的血清反应呈阴性。在IDT生物股份有限公司(IDT Biologika GmbH),Am Pharmapark,D-06861Dessau-Roβlau(德国)的动物设施中,将猪饲养在密闭容器中。在单元内,实心地板上有两个空间相等的独立房间/围栏。稻草被用来做垫料,并且每天更换。使用手动填充的干饲喂器随意饲喂猪(使用团粒-商业混合物)。通过水龙头和乳头式饮水器供应自来水质量的水。每天清洁所有设施。
研究设计
总共将25只8周龄的猪随机分配成5组,每组由5只动物组成。用1.5mL“疫苗1”、“疫苗2”或“疫苗3”以14天的时间间隔肌内处理三组2次。一组五只动物以14天时间间隔接受2ml的可商购获得的针对胸膜肺炎放线杆菌的疫苗(MSD动物健康部,批号:A784A01)两次,并且用作阳性对照。另一组接受安慰剂疫苗并作为阴性对照。表7中提供了组和处理的概述。
表7:研究组和处理
*由于与测试疫苗无关的感染,第14天的研究排除了第5670号猪(第4组)
在研究第0天(第一次疫苗接种当天)、第14天(第二次疫苗接种当天)和第28天(研究结束时)从所述动物中的每只动物收集血清标本。
在两次疫苗接种中的每一次疫苗接种前1天开始直到3天后每个研究日评估一次与疫苗接种有关的局部和全身反应。为了评估局部反应,评估注射部位处的发红和肿胀。
在两次疫苗接种中的每一次疫苗接种前1天开始直到3天后每天测量一次直肠体温。在接种当天,在疫苗接种前和疫苗接种后6小时测量温度。表8和图5中示出了体温的结果。
结果:
表8:每组平均直肠体温(标记升高的温度)
(3)血清学数据(ELISA)
建立ELISA以定量猪血清中的ApxIA-、ApxIIA-或ApxIIIA-特异性IgG抗体。简而言之,如实例5中所述,表达、纯化和定量ApxIA-、ApxIIA-或ApxIIIA。在1×ELISA包被缓冲液(120125;Candor Bioscience)中将相应的ApxA稀释到最终浓度为5μg/mL。在96孔板(NuncMaxiSorb ELISA板(44-2404-21,赛默飞世尔科技公司))的每个孔中给定含100μl相应ApxA的ELISA包被缓冲液,并在4℃下温育过夜。随后,去除包被缓冲液,并用洗涤缓冲液(PBS,0.05%TWEEN 20(v/v))洗涤板3次。使用含有具有10%(v/v)FCS的PBS的封闭溶液在室温(RT)下在振荡器上封闭板持续1小时。随后,去除封闭溶液,并用洗涤缓冲液洗涤所有孔3次。将猪血清在封闭溶液中以1:100预稀释,并在封闭溶液中制备1:5稀释系列(包括稀释度1:100-1:312,500)。将50μll的每种稀释液移液到ELISA板的一个孔中。从多次感染有胸膜肺炎放线杆菌的动物获得的超免疫血清用作阳性对照,并如前所述进行稀释。在振荡器上在RT下温育1小时后,去除血清稀释液,并用洗涤缓冲液将每孔洗涤3×。山羊IgG抗猪IgG(H+L)-HRPO,MinX none(Dianova)用作次级抗体,并在封闭缓冲液中以1:4,000稀释,并且向96孔板的每个孔中给定50μl。在振荡器上在RT下温育1小时后,去除次级抗体稀释液,并且用洗涤缓冲液将每孔洗涤3×。随后,向ELISA板的每个孔中给定50μl TMB底物(555214,BD),并在RT下在黑暗中温育6分钟。通过向每孔中加入20μL 2N H2S04(X873.1,Roth)终止反应。在ELISA读数器中测量450nm波长处每个孔的吸收。使用GraphPad Prism8.0对吸收数据进行处理,其中对吸光度值进行对数转换,并且使用S形剂量应答进行非线性回归。对于统计分析,使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)和邓恩多重比较检验分析ELISA的结果。将每组的数据与安慰剂组(第1组)的对应数据进行比较。p值小于或等于0.05被认为是显著的。图6中示出了结果。
(4)血清学数据(中和测定)
中和测定允许定量相应猪血清的重组WT ApxIA中和能力。
BL3细胞(BL3.1 CRL-2306)用作靶细胞。从牛B细胞获得BL3细胞,并且描述了此细胞系被ApxIA毒素裂解的情况(Tu,A.H.;Hausler,C.;Young,R.;Struck,D.K.(1994))。在37℃和5%CO2下在培养基(含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%FCS和1×非必需氨基酸的DMEM培养基)中培养BL3细胞。使用具有25ml培养基的T75烧瓶进行培养。每周用50,000个细胞/cm2传代BL3细胞以接种新的烧瓶。为了用于中和测定,将培养基中的50μl BL3细胞转移到96孔板的每个孔中。
将猪的血清在56℃下热灭活30分钟。随后,制备DMEM中包括稀释液的2倍稀释系列的血清。根据实例7制备重组WT ApxIA(活性毒素),并将其稀释到最终浓度为240μg/mL。将70μl的每种血清稀释液与30μl的WT ApxIA稀释液(每孔最终ApxIA量:6μg)在96孔板上混合(使血清稀释度为1:2-1:256),并在37℃下温育1小时。将每个孔中50μl的内含物转移到圆底96孔板上(在50μL DMEM中,包含50,000个BL3细胞/cm2),最终血清稀释度为1:4-1:512。将板在37℃下在含有5%CO2和100%湿度的气氛下温育24小时。24小时后,根据制造商的说明将WST-1底物(西格玛)添加到板的每个孔中。将板在37℃下在含有5%CO2和100%湿度的气氛下温育另外24小时。随后,用ELISA读数器在450nm下测定吸收。在活细胞的细胞表面上通过复杂细胞机构将WST-1切割到可溶性甲臜。相应地,所形成的甲臜染料的量和ELISA读取器中的消光读数与培养物中的代谢活性细胞的数量直接相关。中和测定用于在第1组、第2组和第3组的动物血清学研究第28天获得的血清中。图7中示出了结果。
实例16:本发明的APXIA、APXIIA和APXIIIA多肽在猪中的功效
(1)抗原和疫苗调配物的制备
如实例15所述进行抗原和调配物的制备。表9总结了不同疫苗测试批次的调配物。
表9:用于功效研究的不同测试批次的调配物
(2)动物研究(功效)
本研究的目的是评估通过使用针对胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清变型9激发的重组表达的经改进的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA疫苗调配物对猪进行疫苗接种获得的保护功效。
动物
从商品猪饲养员(Dalmandi Zrt.,7211Dalmand,Felszabadulasu42)获得两种性别的猪(雄性[阉割的]和雌性)。用唯一耳标编号标识每头猪,并使每头猪经受兽医检查以符合研究方案中规定的纳入/排除标准。
来源(畜群)不含APP和支原体。仔猪源自于未针对APP进行疫苗接种的母猪,以避免母体源性抗体干扰疫苗接种。动物没有临床体征(呼吸困难、咳嗽、腹泻、跛行)。此外,在纳入本研究之前,在可商购获得的APP-ApxIV ELISA(IDEXX)中的动物的血清反应呈阴性。仔猪发育完全,健康,无任何功能障碍并且无先天性畸形。
动物被饲养在PROPHYL Ltd.Top(编号:045/7,Bar H-7711,匈牙利)动物设施的密闭容器中。使用手动填充的干饲喂器随意饲喂猪(使用碎片-商业混合物)。通过水龙头和乳头式饮水器供应自来水质量的水。每天清洁所有设施。
研究设计
将由含有25μg用Montanide ISA 201VG(批号36075M,Seppic)调配的每种经改进的ApxIA、ApxIIA(截短的)和ApxIIIA的疫苗对鼻内APP血清变型9激发诱导的功效与由注册APP疫苗(MSD动物卫生研究院,批号:A739A01)和接受PBS的安慰剂组诱导的功效进行比较。表10中提供了组和处理的概述。
表10:组和处理的概述
在42-45日龄时,根据处理组用2.0ml的相应疫苗对所有猪进行肌内疫苗接种(研究第0天)。28天后,猪接受使用肌内途径的相应疫苗的第二次疫苗接种(研究第28天)。第2次疫苗接种后2周,向所有动物施用使用APP血清变型9(5×107CFU/猪)进行的鼻内激发(第42个研究日)。
从激发日开始,每天进行一次临床检查持续7天。所述检查中的每个检查均根据临床观察结果并根据表11产生评分。随着时间的推移,对每只动物的临床评分进行累积,并计算整个观察时间段内每组的平均评分。对于统计分析,使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩多重比较检验分析临床评分的结果。将每组的数据与安慰剂组(第3组)的对应数据进行比较。p值小于或等于0.05被认为是显著的。图8中示出了结果。图9中示出了激发后动物存活率的结果。
表11:临床检查评分
在激发后7天,对所有剩余的动物实施人道安乐死并进行死后检查。对所有动物的肺进行尸检以观察由APP引起的病变。根据表12中提供的评分系统进行肺评估。根据实变肺肿块的百分比,将肺病变评分为每叶0分到5分。肺评分结果表示为每头猪的累积肺评分(范围为0到35)。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩多重比较检验分析累积的肺评分。将每组的数据与安慰剂组(第3组)的对应数据进行比较。p值小于或等于0.05被认为是显著的。图10中示出了结果。
表12:肺病变的评估
病变程度
不存在
1-20%
21-40%
41-60%
61-80%
81-100%
评分
0
1
2
3
4
5
序列表
<110> IDT生物股份有限公司(IDT Biologika GmbH)
<120> 灭活的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA毒素
<130> P46559-WO
<150> 19154466.7
<151> 2019-01-30
<160> 34
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1022
<212> PRT
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIA野生型
<400> 1
Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys
20 25 30
Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr
35 40 45
Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu
50 55 60
Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys
65 70 75 80
Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp
100 105 110
Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser
130 135 140
Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp
145 150 155 160
Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu
165 170 175
Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile
180 185 190
Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys
195 200 205
Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys
210 215 220
Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala
225 230 235 240
Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn
245 250 255
Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser
260 265 270
Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile
275 280 285
Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu
305 310 315 320
Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser
325 330 335
Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser
340 345 350
Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn
355 360 365
Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly
370 375 380
Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly
385 390 395 400
Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg
405 410 415
Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His
420 425 430
Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe
435 440 445
Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser
450 455 460
Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile
465 470 475 480
Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly
485 490 495
Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp
500 505 510
Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile
515 520 525
Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro
530 535 540
Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Lys
545 550 555 560
Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val
565 570 575
Val Thr Gly Val Gln Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu
580 585 590
Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile
595 600 605
Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly
610 615 620
Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp
625 630 635 640
Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys
645 650 655
Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val
660 665 670
Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Lys Arg Ser
675 680 685
Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly
690 695 700
Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile
705 710 715 720
Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile
725 730 735
Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His
740 745 750
Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp
755 760 765
Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly
770 775 780
Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu
785 790 795 800
Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn
805 810 815
Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val
820 825 830
Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr
835 840 845
Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp
850 855 860
Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile
865 870 875 880
Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu
885 890 895
Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp
900 905 910
Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val
915 920 925
Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr
930 935 940
Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu
945 950 955 960
Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile
965 970 975
Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly Gln
980 985 990
Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro Asn
995 1000 1005
Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala
1010 1015 1020
<210> 2
<211> 956
<212> PRT
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIIA野生型
<400> 2
Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly
1 5 10 15
Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys
20 25 30
Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys
35 40 45
Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly
50 55 60
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Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr
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Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val
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Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu
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Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp
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Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala
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Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu
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<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
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<223> ApxIA K560A K686A
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<220>
<223> ApxIIA S148G K557A N687A
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Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile
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Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp
245 250 255
Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala
260 265 270
Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu
275 280 285
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770 775 780
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Glu Glu Ile Ile Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val
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Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu
885 890 895
Ser Lys Val Val Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val
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Ser Asn Ser Leu Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser
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Ser Ser Asp Phe Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile
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<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
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<223> ApxIA野生型
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<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIA K560A K686A
<400> 10
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agtgaacggg gtattgcact gtttgcacct cagtttgaca aactgcttaa caaaaaccag 360
aagttaagca aatcactggg tggcagctcc gaagccttgg gccagcgcct gaacaaaacc 420
cagacggcat tgagtgcact gcaaagtttt ctgggcacgg ctatcgccgg aatggatctg 480
gattctctcc tgcgtcggcg tcgcaacggt gaagatgtaa gtggatcgga gctggcgaaa 540
gctggtgtcg atctcgcggc acaattggtt gacaatattg cgtcggccac aggaacggtg 600
gatgcgtttg cggaacaact cggtaaactg ggcaacgcgt tatctaacac acgcttatcc 660
ggcttagcct ctaagctgaa taaccttccg gatctgtcct tggccggccc cggctttgat 720
gcggttagtg gcattcttag cgttgtgtcg gcgagtttca ttctgtccaa caaagatgca 780
gatgcgggca ccaaagccgc cgcgggcatt gaaatttcga cgaaaattct tggtaacatc 840
ggcaaggctg tgtctcagta tatcattgct caacgtgtgg ccgccgggtt aagcactaca 900
gcagcgacag gtggcctgat tggctctgtg gtagcactcg caattagtcc gctgtcattt 960
ctgaatgtcg cggataaatt tgaacgtgcc aaacaactgg aacagtatag cgaacgcttc 1020
aagaaatttg gttatgaagg ggatagtttg cttgcgagct tctaccgcga aaccggtgcc 1080
attgaagcgg ccctgaccac gatcaactcg gtgttgtcag ccgccagcgc cggggtcggt 1140
gcggcagcga cgggttcctt ggtaggtgca ccagttgcgg cgcttgtatc agccattact 1200
ggcatcatct ccggcattct ggatgccagc aagcaagcta tcttcgaacg tgtggcgacg 1260
aaactggcga acaaaattga tgaatgggag aaaaagcacg gcaaaaatta cttcgaaaac 1320
ggttatgatg cgcgccattc ggcgtttctg gaggatacat ttgaacttct gagccagtac 1380
aacaaagaat actctgtgga gcgtgtcgta gcgatcaccc agcaacggtg ggatgttaac 1440
attggtgaac tggccggcat tacccgcaaa ggcgctgacg cgaaatcagg caaagcatac 1500
gtcgacttct ttgaagaggg gaaactgttg gaaaaggacc cggaccgttt tgataagaaa 1560
gtctttgatc cgctggaagg gaaaattgat ctgtcctcta tcaacaaaac tacgttgctg 1620
aaattcatca cgcccgtttt cacagcgggt gaggaaattc gcgagcgtaa gcagactggg 1680
gcgtatgaat acatgaccga actgttcgtc aaaggtaaag agaaatgggt ggtgaccggc 1740
gttcagtcgc ataacgccat ctacgattat accaacttaa tccagctggc gattgacaaa 1800
aaaggtgaaa agcgtcaggt gaccattgag agccatctgg gcgagaagaa tgaccgcatc 1860
tatttaagca gtggtagttc gattgtctat gctggcaatg ggcatgatgt cgcctattat 1920
gacaaaaccg atacgggcta tttgaccttt gacggtcaga gcgcccagaa agcaggcgaa 1980
tatatcgtaa ccaaagaact gaaagctgat gtgaaagtcc tgaaagaggt tgtgaaaacg 2040
caagatatta gcgttggcgc ccgctcggag aaattagaat atcgcgatta tgagctgagc 2100
ccattcgaac tcggtaacgg cattcgcgcg aaagatgaac tccactctgt ggaagaaatt 2160
attggttcta atcgtaaaga taaattcttc gggtcacgct ttaccgatat ctttcatggc 2220
gcgaaagggg acgatgaaat ctatggcaac gacggccacg acattctgta tggtgatgat 2280
gggaacgacg ttatccatgg aggggatggc aatgatcatc tggttggcgg caatggaaat 2340
gaccgtctta tcggcggcaa aggtaataac tttcttaacg gtggtgatgg ggacgacgaa 2400
cttcaggtct ttgaaggtca gtataacgta ctgctgggcg gtgctgggaa cgacatcctt 2460
tatggtagtg atggtactaa tctgttcgac ggcggcgtgg gtaacgacaa gatctacgga 2520
gggttgggta aggacattta ccgctactcg aaagaatacg gccggcacat cattattgag 2580
aaaggcggag atgacgatac cctcctgctg tcggatttaa gctttaaaga cgtgggcttc 2640
attcgcatcg gggatgatct gttagtgaac aaacgcattg gaggcacgct gtactaccac 2700
gaagattaca atggcaatgc tctgaccatt aaggactggt tcaaagaagg caaggaaggt 2760
caaaacaata agatcgagaa aatcgtagat aaagacggcg cctatgttct cagccagtat 2820
ctcactgaac tgactgcacc tggccgcggt attaattact tcaatggtct ggaagagaaa 2880
ctgtactatg gcgagggtta taacgccctg ccacaactgc gcaaagacat tgaacagatt 2940
atcagctcta ccggggcgct gactggtgag catggtcaag ttctcgttgg tgcgggtggt 3000
ccgctggcgt actcaaattc gccgaatagc atcccgaatg ccttttccaa ttacctgacc 3060
cagtcagcat aagagctc 3078
<210> 11
<211> 2880
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIIA S148A K557A K686A
<400> 11
ggatccagca aaattaccct ctcatccctc aaatcaagcc tgcagcaggg gctgaagaac 60
ggcaagaaca agctgaatca ggcgggtacg actctgaaga atggcttaac gcaaacaggg 120
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gggcagggca atggggtcca agatcttgtt aaagcggcca atgacctggg aatcgaagtg 240
tggcgtgaag aacggagcaa cctggacatt gcgaaaacca gctttgatac gacccagaaa 300
atcctgggtt tcaccgaccg cggaattgta ctgtttgccc cgcaacttga taaccttctg 360
aaaaaaaacc cgaaaattgg aaatacattg ggttcggcaa gctctatcag tcagaacatt 420
ggcaaagcta acactgtgtt aggtggtatt cagtctattc tggggtcggt cttgtccggc 480
gttaacctga atgaactgct tcaaaacaaa gatccaaatc aactggaact ggccaaagcg 540
ggcctggagt taacgaacga gttggtagga aacattgcct cctctgtgca gacggtggat 600
gcatttgctg aacagattag caaattaggt tctcatctgc aaaacgtcaa aggactgggc 660
ggcctcagca acaaactgca gaatttaccg gatctgggca aagccagcct tgggttagat 720
attatctccg ggctcttgtc aggcgcgtca gccggtctta tcctggcgga caaagaagca 780
agcaccgaaa agaaagctgc cgcaggcgtc gagtttgcga accagattat tggaaatgtc 840
accaaagcgg tcagttccta catcctggcg cagcgtgtag cgtcgggcct gtcatctact 900
ggtccagttg ccgcgttgat tgcgtctacg gtcgccttag cggtttcgcc gctgtccttt 960
ctgaacgtgg cggataagtt caaacaagcg gatttgatca aaagctatag tgaacgcttt 1020
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gcggcgagcg ctggctcact ggtaggagcc cctgttgctc ttttggttgc aggcgttaca 1200
ggcctgatta cgaccatttt agagtatagc aaacaagcga tgtttgagca cgtcgcaaat 1260
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ggggttgaca ccattgatgg caatgacggc gatgatcatc tgtttggcgg cgctggtgac 2280
gatgtgatcg atggtggtaa cggtaataat tttctcgtcg gcggtaccgg gaacgatatt 2340
atcagcggcg gtaaggacaa tgatatttat gtgcacaaga ctggtgatgg caacgactcc 2400
atcaccgata gcggtggcca ggataaactg gcatttagcg atgtgaacct caaagatctg 2460
acctttaaaa aagtggactc tagtctggaa atcattaacc agaagggcga gaaagtccgc 2520
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gtgaacgact acaatacgag taaagatcgc cagaatgttt ccaactcgct ggccaagctg 2760
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gttccttctt ccatcgacgt tagtaacaat attcagttgg cacgcgcagc ataagagctc 2880
<210> 12
<211> 3168
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIIIA K571A K702A
<400> 12
ggatccagca catggagcag tatgcttgcg gacttgaaga aacgggcgga agaagcgaaa 60
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accgcgagct ttgccctggc aaacaagaat gccagcacgt ctactaaagt ggcagcgggt 840
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cgtgatgaat ttaaaggcag caaattccgc gatatcttcc atggtgccga cggtgacgac 2280
cttcttaacg ggaatgatgg ggatgacatc ctgtatggtg acaagggcaa tgatgaactg 2340
cgtggcgata acggcaatga ccagctgtac ggtggtgagg ggaatgacaa attgttaggt 2400
ggcaacggaa acaactatct gtccggcggc gacggtaatg atgagttgca agttcttggc 2460
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tcagatttgc tggatggcgg ggaaggtaac gattatctgg aaggcggtga tggctctgat 2580
ttctatgtgt atcgctcgac ctctggcaac cataccattt atgaccaggg aaaatcctcg 2640
gatctggata aactctatct gtccgatttt agttttgatc gcctgctggt cgagaaagtt 2700
gatgacaatc tggttctgcg ctcgaacgaa tctagccaca acaatggtgt gcttaccatc 2760
aaagattggt ttaaagaggg taacaaatac aatcacaaaa tcgagcaaat tgtggataag 2820
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gataatctcc tgaactatgc aaccaaggag gaccagaacg aatcgaacct gtcctctctg 2940
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<210> 13
<211> 527
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIC
<400> 13
tcatgagtaa aaaaattaat ggatttgagg ttttaggaga ggtggcatgg ttatgggcaa 60
gttctccttt acatcgaaag tggccgcttt ctttgttagc aattaatgtg ctacctgcga 120
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aaaataaaca aaattttaaa ttttcattag taaatagcta aagatct 527
<210> 14
<211> 488
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIIC
<400> 14
acatgttaaa aaatgatttt aacgtattgg gacaaattgc ttggttatgg gcaaattctc 60
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atgaccaata tttgttacta gttgatgatg gttttcctat tgcatattgc agttgggcca 180
aattaactct agagagtgag gctcgctatg taaaggacac caattcatta aaaatagatg 240
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aaaaagtagc tgaaaagaca tttcttcagt atgagcaaga gttaataaca gctctacaat 480
aaagatct 488
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<211> 530
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> ApxIIIC
<400> 15
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aagtattccg ggccattcga gtatatcctg gttctacaga agcgaaaatc attcatgttc 420
aaggaggaca aattaataaa tttacagcta aaaaattaat acaacaatat caggaagaac 480
ttattcaagt tcttaacaat cacaaaaaaa ttgtaagagg ataaagatct 530
<210> 16
<211> 639
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> 具有启动子/lac操作子和RBS的ApxIC
<400> 16
tctagaaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
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aatcaatatg ttttgttaaa gcgtgacggt tttcctattg cattttgtag ctgggcaaat 300
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ctggcaagta aaatttttca acaatatcac tttgaattaa tgagtgagct aaaaaataaa 600
caaaatttta aattttcatt agtaaatagc taatcgcga 639
<210> 17
<211> 600
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> 具有启动子/lac操作子和RBS的ApxIIC
<400> 17
atcgataaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatgtta 120
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gcaggagatc gtatatggat cattgattgg attgccccat tcggggattc atctctattg 420
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agcaaaaaag atactggaaa aatcatatat ttaaaaggag gaaaaataac aaaaaaagta 540
gctgaaaaga catttcttca gtatgagcaa gagttaataa cagctctaca ataatcgcga 600
<210> 18
<211> 642
<212> DNA
<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actonbacillus pleuropneumoniae)
<220>
<223> 具有启动子/lac操作子和RBS的ApxIIIC
<400> 18
tctagaaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatgagt 120
tataaaaatg ttaaaaattt aacagatgat tttacaactt tagggcatat cgcttggttg 180
tgggctaatt ctccgttaca taaggagtgg tctatctctt tgtttactaa gaatattttg 240
ccagccattc aacatgatca atatatttta cttatgcgag atgagttccc tgtagcgttt 300
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<210> 19
<211> 2446
<212> DNA
<213> 质粒pEX-A258(Plasmid pEX-A258)
<220>
<223> pEX-A258
<400> 19
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cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 180
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 240
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 300
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 360
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 420
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 480
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 540
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gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 660
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 720
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gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 840
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<211> 4751
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<213> 质粒pQE-80L(Plasmid pQE-80L)
<220>
<223> pQE-80L
<400> 20
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<211> 3431
<212> DNA
<213> 质粒pQE-60(Plasmid pQE-60)
<220>
<223> pQE-60
<400> 21
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
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tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 3420
ttcgtcttca c 3431
<210> 22
<211> 4245
<212> DNA
<213> 质粒pACYC184(Plasmid pACYC184)
<220>
<223> pACYC184
<400> 22
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
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ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
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gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg 2580
gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga 2640
tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag 2700
gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca 2760
cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg 2820
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catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg 2940
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ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 3420
gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 3480
acctacatct gtattaacga agcgctaacc gtttttatca ggctctggga ggcagaataa 3540
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acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg 3720
aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag gcgtttaagg 3780
gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg 3840
taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat gaacctgaat 3900
cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg 3960
ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg 4020
attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc 4080
accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta 4140
ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg 4200
aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacg 4245
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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gcatcatgag taaaaaaatt aatggatttg agg 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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ggtagatctt tagctattta ctaatgaaaa tttaa 35
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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gcaacatgtt aaaaaatgat tttaacgtat tgg 33
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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ggtagatctt tattgtagag ctgttattaa ct 32
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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gcatcatgag ttataaaaat gttaaaaatt taaca 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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ggtagatctt tatcctctta caattttttt gtg 33
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<212> DNA
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<223> 引物
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gcatctagaa aatcataaaa aatttatttg cttt 34
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agctcgcgat tagctattta ctaatgaaaa ttta 34
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gcaatcgata aatcataaaa aatttatttg cttt 34
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agctcgcgat tattgtagag ctgttattaa ct 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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gcatctagaa aatcataaaa aatttatttg cttt 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
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agctcgcgat tatcctctta caattttttt gt 32
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