一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法 (Haemophilus parasuis adjuvant vaccine and preparation method thereof ) 是由 李晓华 刘栋 赖连杰 林晨宇 薛少华 林寰 郑新添 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法。属于植物材料的药物制品技术领域。本发明将银杏叶黄酮苷与副猪嗜血杆菌疫苗原液相结合,制备出副猪嗜血杆菌佐剂疫苗。与现有技术相比,本发明取得的有益效果为：该疫苗能够有效提高副猪嗜血杆菌的IgG抗体效价,有效提高细胞因子IL-2,IL-4、TNF-α、IFN-γ水平,仔猪免疫副猪嗜血杆菌佐剂疫苗二免后2周,仔猪T细胞亚群CD4～(+)、CD8～(+)数量显著增高,实现了对副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型和血清13型攻击的60～100％的保护效果,为致病性副猪嗜血杆菌提供了新型疫苗和免疫方法。(The invention discloses a haemophilus parasuis adjuvant vaccine and a preparation method thereof. Belongs to the technical field of medicinal products of plant materials. The invention combines the ginkgo leaf flavonoid glycoside and the haemophilus parasuis vaccine stock solution to prepare the haemophilus parasuis adjuvant vaccine. Compared with the prior art, the invention has the following beneficial effects: the vaccine can effectively improve the IgG antibody titer of the haemophilus parasuis, effectively improve the levels of cytokines IL-2, IL-4, TNF-alpha and IFN-gamma, and can effectively improve the T cell subgroup CD4 of piglets 2 weeks after the immunization of the haemophilus parasuis adjuvant vaccine on the piglets + 、CD8 + The quantity is obviously increased, the protection effect of 60-100% of attack on the haemophilus parasuis serotype 4, serotype 5 and serotype 13 is realized, and a novel vaccine and an immunization method are provided for the pathogenic haemophilus parasuis.)
技术领域
本发明涉及植物材料的药物制品技术领域，更具体的说是涉及一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌是一种革兰阴性短小杆菌，常定植于猪的上呼吸道。该菌主要危害仔猪和成年猪，主要特征是纤维蛋白性多浆膜炎、关节炎和脑膜炎，亦可导致猪的猝死。近年已经鉴定出的副猪嗜血杆菌血清型共有15种，其中血清型4型和5型最为普遍。
目前对副猪嗜血杆菌感染的发病机制的了解较为有限，预防措施仍不能完全控制该病的发生。通常情况下，控制副猪嗜血杆菌病发生的关键因素是仔猪自身的天然免疫及其从母源抗体获得的免疫力，该病的控制主要通过疫苗接种的方法。
然而，猪副嗜血杆菌疫苗存在如下问题：(1)由于其血清型较多，且还有很大比例的菌株没有分型，因此高效交叉保护疫苗的研制存在极大困难；(2)佐剂的局限性，使得佐剂种类及佐剂用量影响后续疫苗效果。
综上，如何提供一种高效交叉保护的副猪嗜血杆菌佐剂疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法。从银杏科植物Ginkgobilobal中分离、提取并制备了佐剂有效组份银杏叶黄酮苷，再与副猪嗜血杆菌疫苗原液相结合，制备出副猪嗜血杆菌佐剂疫苗。具有很好地免疫调节功能，能调节淋巴细胞、吞噬细胞活性，调节机体血清中细胞因子水平等，具有天然、低毒、无药物残留等优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗，包括疫苗原液和佐剂；
所述疫苗原液由(4+5+13)型菌液抗原组成，三者体积比为1：1：1；
所述佐剂为银杏叶黄酮苷，其在佐剂疫苗中的终浓度为1～4mg/mL。
进一步的，银杏叶黄酮苷在佐剂疫苗中的终浓度为4mg/mL。
进一步的，所述佐剂疫苗中4、5型菌液抗原的菌浓度为2.0×109CFU/mL，13型菌液抗原的菌浓度为2.5×109CFU/mL。
一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备银杏叶黄酮苷；
(2)制备菌液抗原：采用液体发酵培养副猪嗜血杆菌4、5和13型菌液，之后加入菌液体积0.25％的甲醛溶液灭活后保存备用；
(3)制备疫苗原液：按照比例配置疫苗原液；
(4)制备佐剂疫苗：将疫苗原液与佐剂配置成佐剂疫苗。
进一步的，步骤(2)中所用培养基包括质量浓度3％的胰蛋白大豆肉汤培养基、新生牛血清和质量浓度为0.04％的NAD溶液，三者的体积比为5000:250:1。
进一步的，所述步骤(2)中的培养条件为：37℃、180r/min培养22～24h。
进一步的，所述步骤(2)中还包括将菌液抗原稀释成4、5型菌液抗原的菌浓度≥2.0×109CFU/mL，13型菌液抗原的菌浓度≥2.5×109CFU/mL。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：该疫苗能够有效提高副猪嗜血杆菌的IgG抗体效价，有效提高细胞因子IL-2，IL-4、TNF-α、IFN-γ水平，仔猪免疫副猪嗜血杆菌佐剂疫苗二免后2周，仔猪T细胞亚群CD4+、CD8+数量显著增高，实现了对副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型和血清13型攻击的60～100％的保护效果，为致病性副猪嗜血杆菌提供了新型疫苗和免疫方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实验2免疫仔猪Hps抗体效价检测结果，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图2附图为本发明实验3仔猪血清中IL-2水平，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图3附图为本发明实验3仔猪血清中IL-4水平，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图4附图为本发明实验3仔猪血清中TNF-a水平，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图5附图为本发明实验3仔猪血清中IFN-r水平，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图6附图为本发明实验4仔猪外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞的表达量，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图7附图为本发明实验4仔猪外周血CD4+/CD8+ T淋巴细胞比例，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图8附图为本发明实验5仔猪外周血T淋巴细胞刺激指数，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001；
图9附图为本发明实验5仔猪外周血B淋巴细胞刺激指数，其中*示与生理盐水组相比P＜0.05；**示与生理盐水组相比P＜0.01；***示与生理盐水组相比P＜0.001；#示与疫苗原液组相比P＜0.05；##示与疫苗原液组相比P＜0.01；###示与疫苗原液组相比P＜0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)银杏叶黄酮苷的制备：
应用超声波辅助提取和乙醇回流提取技术对银杏叶进行提取，得到银杏叶黄酮苷；其中，浸提温度70℃、浸提时间2h、料液比1:25和乙醇体积分数70％；
(2)制备菌液抗原：
(21)培养基的制备：取胰蛋白大豆肉汤(TrypticSoyBroth，TSB)30g溶于去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解后，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的新生牛血清和200μL过滤除菌的质量浓度0.04％的NAD即可。
(22)采用液体发酵培养分别培养副猪嗜血杆菌4、5和13型菌液，37℃、180r/min培养22～24h收获各型菌液，按菌液体积的0.25％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。
(3)制备疫苗原液：
将步骤(2)制备的灭活的副猪嗜血杆菌4、5和13型菌液抗原均稀释成4、5型≥2.0×109CFU/mL，13型≥2.5×109CFU/mL后按如下比例混合：
(4型+5型+13型)＝V/3+V/3+V/3；(注：V指体积)。
(4)制备佐剂疫苗：
取制备得到的银杏叶黄酮苷与疫苗原液制备成不同浓度的猪副嗜血杆菌佐剂疫苗(银杏叶黄酮苷在佐剂疫苗中的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL)。
实验1仔猪免疫实验
选取实施例1中制备不同浓度的猪副嗜血杆菌佐剂疫苗，分别在仔猪15日龄通过颈部肌肉注射途径免疫副猪嗜血杆菌佐剂疫苗2mL，首免21天后进行二免，免疫途径和剂量同首免，二免后14天，对仔猪用副猪嗜血杆菌血清4、5、13型进行攻毒，攻毒方式为腹腔注射菌液3mL/头，副猪嗜血杆菌血清4、5型活菌含量均为7.5×109cfu/mL，副猪嗜血杆菌血清13型为3.75×1010cfu/mL，同时设立疫苗原液及空白对照(对照组腹腔注射生理盐水)(具体见表1)。各组分别在免疫前及二免后第7、14天及攻毒后第7、14天采血，4℃4000r/min离心25min分离血清-70℃冷冻保存备用；同时，在二免后14天采抗凝血用于T细胞亚群流式检测。
表1疫苗免疫情况
结果如下：
疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组：副猪嗜血杆菌血清4型菌液攻毒16h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒124h后死亡1头仔猪，2周后仍存活4头仔猪，保护率为80％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组副猪嗜血杆菌血清5型菌液攻毒23h后出现静卧，3天后精神恢复，全部存活，保护率为100％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组副猪嗜血杆菌血清13型菌液攻毒26h后出现扎堆、静卧、精神不振，1头出现跛行等症状，攻毒53h后死亡2头仔猪，攻毒96h后精神逐渐恢复，2周后仍存活3头仔猪，保护率为60％。
疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组：副猪嗜血杆菌血清4型菌液攻毒13h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒19h后死亡2头仔猪，2周后仍存活3头仔猪，保护率为60％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组副猪嗜血杆菌血清5型菌液攻毒5h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒46h后死亡2头仔猪，2周后仍存活3头仔猪，保护率为60％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组副猪嗜血杆菌血清13型菌液攻毒12h后出现精神沉郁、1头出现呼吸困难症状，攻毒50h后死亡2头仔猪，2周后仍存活3头仔猪，保护率为60％。
疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组：副猪嗜血杆菌血清4型菌液攻毒6h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒9h后死亡2头仔猪，2周后仍存活3头仔猪，保护率为60％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组副猪嗜血杆菌血清5型菌液攻毒4h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒33h后死亡2头仔猪，攻毒57h再死亡1头仔猪，2周后仍存活2头仔猪，保护率为40％；疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组副猪嗜血杆菌血清13型菌液攻毒9h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状，攻毒61h后死亡2头仔猪，保护率为60％。
实验结果表明，以4mg/mL银杏叶黄酮苷添加量制成的猪副嗜血杆菌佐剂疫苗，免疫效果较好，对副猪嗜血杆菌血清4型的保护率可达80％，对副猪嗜血杆菌血清5型的保护率可达100％，对副猪嗜血杆菌血清13型的保护率可达60％(详见表2、表3)。
表2不同浓度佐剂疫苗副猪嗜血杆菌攻毒结果
表3仔猪疫苗免疫保护实验
注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～3日)、精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。
实验2免疫仔猪Hps抗体效价检测
免疫及攻毒方法同实验1。
仔猪免疫保护实验Hps抗体效价检测结果，二免后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组抗体水平显著高于疫苗原液组和生理盐水对照组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组抗体水平与疫苗原液组相比，差异不显著；攻毒后1周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组抗体水平显著高于疫苗原液组和生理盐水组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组抗体水平低于疫苗原液组；攻毒后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组抗体水平显著高于疫苗原液组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组抗体水平高于疫苗原液组(见图1)。
实验3免疫仔猪细胞因子水平检测
免疫及攻毒方法同实验1。
①细胞因子IL-2水平检测
二免后2周及攻毒后1周，黄酮苷佐剂疫苗组均显著高于生理盐水组，与疫苗原液组相比，差异不显著。(见图2)
②细胞因子IL-4水平检测
二免后1周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组显著高于疫苗原液组和生理盐水组；二免后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组IL-4水平略有下降；攻毒后1周和攻毒后2周，各组差异不显著。(见图3)
③细胞因子TNF-a水平检测
二免后1周，黄酮苷佐剂疫苗组显著高于疫苗原液组和生理盐水组；攻毒后1周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组TNF-a水平高于疫苗原液组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组与疫苗原液组相比，差异不显著；攻毒后2周，各组差异不显著。(见图4)
④细胞因子IFN-r水平检测
二免后1周及二免后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组的IFN-r水平显著高于疫苗原液组和生理盐水组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组与疫苗原液组差异不显著；攻毒后1周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组IFN-r水平仍显著高于其他组；攻毒后2周，各组IFN-r水平差异不显著。(见图5)
实验4免疫仔猪外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞的表达
免疫方法同实验1，在二免后两周测定。
仔猪外周血T淋巴细胞亚群的检测结果，二免后2周，银杏叶黄酮苷佐剂疫苗组仔猪外周血CD4+表达量显著高于疫苗原液组，其中，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组CD4+显著高于疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组；与疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)比较，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组可降低CD8+ T淋巴细胞的比例，但疫苗原液+银杏叶黄酮苷组与疫苗原液组之间差异不显著；同时，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组CD4+/CD8+ T淋巴细胞的比值也显著升高(见图6、图7)。表明疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组可刺激机体淋巴细胞的分化。
实验5仔猪外周血淋巴细胞增殖指数
免疫及攻毒方法同实验1。
①T淋巴细胞刺激指数
二免后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组T淋巴细胞刺激指数显著高于疫苗原液组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组与疫苗原液组差异不显著；攻毒后1周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组T淋巴细胞指数有所下降，攻毒后2周，又呈上升趋势。(见图8)
②B淋巴细胞刺激指数
二免后2周，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组B淋巴细胞刺激指数显著高于疫苗免疫组，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(中)组和疫苗原液+银杏叶黄酮苷(低)组略低于疫苗原液组；攻毒后1周，疫苗原液组B淋巴细胞刺激指数显著升高，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组B淋巴细胞指数有所下降；攻毒后2周，疫苗原液组B淋巴细胞刺激指数下降明显，疫苗原液+银杏叶黄酮苷(高)组B淋巴细胞指数显著高于疫苗原液组(见图9)。
实验6疫苗的安全试验
①副猪嗜血杆菌佐剂疫苗对靶动物和非使用日龄动物的一次单剂量接种的安全性试验
用本发明实施例1制备的佐剂疫苗(黄酮苷佐剂终浓度4mg/mL)，对10～15日龄仔猪(购自福建龙岩市某良种猪场)各5头进行颈部肌肉注射，2mL/头，另设生理盐水对照组。以观察试验猪接种疫苗后2周内，试验猪有无过敏，精神、饮食有无异常，注射部位有无红肿现象，仔猪增重或母猪产子情况是否正常。结果仔猪精神良好，接种后注射部位均未出现红肿现象，精神、采食均正常；生理盐水对照组试验猪均正常(见表4)。
表4对非使用日龄靶动物的一次接种安全性试验结果
②副猪嗜血杆菌佐剂疫苗对靶动物一次超剂量接种的安全性试验
用本发明实施例1制备的佐剂疫苗(黄酮苷佐剂终浓度4mg/mL)，对10～15日龄健康易感仔猪5头分别颈部肌肉注射，4mL/头，另设生理盐水对照组，观察试验猪接种疫苗后的安全性。结果表明，10～15周龄仔猪接种后注射部位均未出现红肿反应，精神、采食均正常，与生理盐水对照组仔猪无明显差异。说明本发明的佐剂疫苗一次超剂量接种是安全的(见表5)。
表5副猪嗜血杆菌佐剂疫苗超剂量接种的安全性试验
③单剂量重复接种安全试验
用本发明实施例1制备的佐剂疫苗(黄酮苷佐剂终浓度4mg/mL)，对10～15日龄健康易感仔猪进行疫苗接种，14天后重复接种一次，观察疫苗单剂量重复接种对接种猪的安全性，另设生理盐水对照组。结果表明，该佐剂疫苗对接种猪无不良影响，无过敏现象，接种部位无红肿等不良反应，接种猪的精神、采食量均正常，仔猪增重与生理盐水对照组仔猪无明显差异。证明本发明制备的佐剂疫苗单剂量重复接种是安全的(见表6)。
表6试验仔猪单剂量重复安全性试验结果
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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