基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法
阅读说明：本技术 基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法 (Method for carrying out enzyme system structure analysis on aroma Daqu based on macroproteomics technology ) 是由 赵鑫锐 李江华 范伟业 施思 赵东 乔宗伟 郑佳 于 2021-01-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于宏蛋白质组学技术领域,具体涉及一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。针对目前还未见有对浓香大曲中酶种类和酶成分的具体解析的方法的问题,本发明提供了一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法,通过建立浓香大曲粗酶液和宏蛋白质组样品的提取方法以及浓香大曲酶系结构的分析方法,实现了应用宏蛋白质组学对浓香大曲酶系组成的解析,解决了之前的研究缺少对浓香大曲未知酶系的深入解析的问题。本发明为白酒中风味物质的解析提供了理论基础,具有重要的意义。(The invention belongs to the technical field of macroproteomics, and particularly relates to a method for carrying out enzyme system structure analysis on aroma yeast based on the macroproteomics technology. Aiming at the problem that a method for specifically analyzing the enzyme types and the enzyme components in the aroma Daqu is not available at present, the invention provides a method for analyzing the enzyme system structure of the aroma Daqu based on a macroproteomics technology, and the analysis of the aroma Daqu enzyme system composition by applying the macroproteomics is realized by establishing an extraction method of crude enzyme liquid and a macroproteinaceous sample of the aroma Daqu and an analysis method of the aroma Daqu enzyme system structure, so that the problem that the prior research lacks deep analysis of the unknown enzyme system of the aroma Daqu is solved. The method provides a theoretical basis for the analysis of flavor substances in the white spirit, and has important significance.)
技术领域
本发明属于宏蛋白质组学技术领域，具体涉及一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。
背景技术
白酒是全球消费量最大的烈性酒，它和伏特加、白兰地、威士忌被称为世界四大蒸馏酒。根据白酒风味特征的不同，可以将其分为三种主要类型：浓味白酒、酱味白酒和清香白酒。白酒的发酵采用的是沿用了几千年的固态糖化发酵工艺，这种工艺的核心在于它的发酵剂——酒曲，它的作用是为整个酿酒过程提供微生物和酶，而这些微生物和酶对于形成白酒中各种风味物质有着重要作用。酿造浓香白酒使用的酒曲是浓香大曲，行业内对于浓香大曲开展了很多研究，但是却没有实质性的揭示浓香大曲中酶系的组成。目前对于浓香大曲的研究主要集中在两个方面。第一，是集中在对浓香大曲的酶活检测上，通常是检测大曲中常见的酶类。第二，是关于浓香大曲中微生物群落动态解析上，这种是从微生物水平来解析浓香大曲的微生物组成及变化。但是，目前缺乏对浓香大曲中的酶种类和各种酶的酶活方面的进一步研究，还有待开发。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：目前还未见有对浓香大曲中酶种类和酶成分的具体解析的方法，无法从酶的水平去明确浓香大曲在白酒酿造中的作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。该方法包括以下步骤：
a、提取浓香大曲粗酶液并测定粗酶液中的各种酶活；具体的提取粗酶液的操作为：将浓香大曲破碎后，用Tris-HCL作为溶剂进行提取，大曲与Tris-HCL溶剂的加入量为液固比为1︰5～10，提取过程中的pH值为5.0～7.0，提取时间为0.5～2h；
b、提取宏蛋白样品并采用宏蛋白质组学技术进行解析；
提取的具体操作步骤为：在大曲样品中加入BPP提取液，震荡、离心后取上清液，加入同体积的Tris-饱和酚溶液，再次震荡离心获得含有蛋白的酚层，再加入相同体积的BPP提取液，震荡离心取上清液，加入等体积的乙酸铵甲醇溶液，-20℃过夜沉淀蛋白，在沉淀中加入丙酮，离心去上清，采用裂解液溶解蛋白，得到待测样品；
提取样品的酶解：将提取的蛋白，加入二硫苏糖醇，37℃孵育1h；冷却至室温，加入碘乙酰胺，室温放置30min；加入胰酶37℃恒温过夜，加入甲酸终止酶切，收集消化后的馏分，保存在-80℃下进行MS分析；
c、将宏蛋白质组学技术解析结果与酶活测定结果进行对比。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤a中所述的酶包括：α-淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶或果胶酶中的至少一种。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中加入的大曲样品与BPP提取液的比例为0.4g︰1mL。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的裂解液为含有8M尿素的裂解液。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的二硫苏糖醇的终浓度为10mM。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的碘乙酰胺的终浓度为30mM。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述胰酶的加入量为：胰酶与蛋白的质量比为1︰25。
其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的甲酸的浓度为0.1％。
本发明的有益效果为：
本发明成功建立了浓香大曲粗酶液和宏蛋白质组样品的提取方法以及浓香大曲酶系结构的分析方法，实现了应用宏蛋白质组学对浓香大曲酶系组成的解析，解决了之前的研究缺少对浓香大曲未知酶系的深入解析的问题。通过GO和KEGG生物功能分析，实现了对浓香大曲中酶行使的功能和参与代谢途径的预测，该结果将为进一步认识大曲在白酒酿造中不可替代的作用提供线索，并为分析浓香白酒特色风味物质形成的机理奠定基础。
附图说明
图1所示为浓香大曲中常见酶类酶活的测量结果；
图2所示为不同组合方式的蛋白提取效果；
图3所示为浓香大曲酶系的GO分析结果；
图4所示为浓香大曲酶系的KEGG通路分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种能够解析浓香大曲中蛋白的种类和追溯蛋白的物种来源的方法，通过宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析。浓香大曲中所有的蛋白被分为植物、动物和微生物三类。微生物蛋白被进一步划分为真核微生物蛋白和原核微生物蛋白。本发明通过蛋白质的物种组成分析(通过对质谱数据进行SWISS和Uniprot数据库注释，可以搜寻到蛋白的ID、名称以及来源，然后进一步统计所有蛋白的来源，将来源于相同种水平的生物归为一类)，解析出浓香大曲中产蛋白含量最高的真核微生物和原核微生物及相应的蛋白丰度，蛋白丰度为36.81％。
本发明的方法不仅可以单一解析浓香大曲中蛋白的物种组成，还可以应用于不同类型大曲蛋白物种组成的差异性研究。
具体的，本发明的基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法包括以下步骤：
a、提取浓香大曲粗酶液并测定粗酶液中的各种酶活；具体的提取粗酶液的操作为：将浓香大曲破碎后，用Tris-HCL作为溶剂进行提取，大曲与Tris-HCL溶剂的加入量为液固比为1︰5～10，提取过程中的pH值为5.0～7.0，提取时间为0.5～2h；所述的酶包括α-淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶或果胶酶中的至少一种；
b、提取宏蛋白样品并采用宏蛋白质组学技术进行解析；
提取的具体操作步骤为：在大曲样品中加入BPP提取液(两者的比例为0.4g：1mL)，震荡、离心后取上清液，加入同体积的Tris-饱和酚溶液，再次震荡离心获得含有蛋白的酚层，再加入相同体积的BPP提取液，震荡离心取上清液，加入等体积的乙酸铵甲醇溶液，-20℃过夜沉淀蛋白，在沉淀中加入丙酮，离心去上清，采用含有8M尿素的裂解液溶解蛋白，得到待测样品；
提取样品的酶解：直接取上述提取的蛋白，取50μg蛋白/每样溶液置于EP管中；加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇(10mM IAA(是碘乙酰胺)in H2O)，37℃孵育1h。冷却至室温，加入终浓度为30mM的IAA(50mM IAA in H2O)，室温放置30min。加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:25)37℃恒温过夜。第二天，加50μL 0.1％的甲酸终止酶切，收集消化后的馏分，保存在-80℃下进行MS分析。
c、将宏蛋白质组学技术解析结果与酶活测定结果进行对比。
本发明还能够解析浓香大曲中的所有酶类并通过生物功能分析这些酶的作用。浓香大曲中的所有酶也被划分为植物酶，动物酶、真核微生物酶和原核微生物酶，即每一种酶都能追溯到来源生物。浓香大曲中所有的酶类根据EC号分类体系被系统的分为七个大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶和易位酶。浓香大曲中常见酶类酶活的测量结果如图1所示，不同组合方式的蛋白提取效果如图2所示。
进一步的，本发明通过GO数据库分析，对浓香大曲中酶的生物功能进行了分析。其中的GO分析包括biological process、cellular component和molecular function三个类别，可以分别找出每个大类中富集到的所有酶类。浓香大曲酶系的GO分析结果如图3所示。
此外，本发明通过KEGG数据库分析对浓香大曲中酶参与的代谢通路进行分析，可以找出浓香大曲中的酶协同参与的最主要代谢过程。浓香大曲酶系的KEGG通路分析结果如图4所示。
本发明利用宏蛋白质组学从酶的角度证实浓香大曲具有合成浓香白酒某种典型风味物质的能力。本发明在宏蛋白质组学的结果中发现了合成异丁醇的重要前提物质缬氨酸的关键酶，跟缬氨酸合成相关的关键酶有ketol-acid reductoisomerase(EC:1.1.1.86)，dihydroxy-acid dehydratase(EC:4.2.1.9)和branched-chain aminoaminotransferase(EC:2.6.1.42)。本发明发现了乳酸脱氢酶包括L-lactatedehydrogenase(EC:1.1.1.27)和D-lactate dehydrogenases(EC:1.1.2.4)。此外，本发明还发现了在合成丁酸(合成己酸乙酯的重要前体物质)途径上的关键酶3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase(EC:1.1.1.157)。本发明对浓香大曲酶系结构解析的目的之一就是为了与浓香白酒风味物质建立关联，在宏蛋白质组学结果中发现了跟重要风味物质合成相关的酶，证明了浓香大曲中的酶系对形成浓香白酒的风味物质有着重要作用。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所使用的各种试剂均为普通市售产品。
实施例1粗酶液提取方法的优化
将大曲破碎后，用Tris-HCL作为溶剂进行提取，然后浸提液在经过两次离心后即为粗酶液，即可进行各种酶活的检测。当Tris-HCL的pH为7，浸提时间为2小时，料液比为1︰5时的浸提效果最好，浸提液的总蛋白浓度最高为285.68μg/mL，明显高于其他优化组合方式。
应用上述提取的粗酶液进行各种酶活的检测，α-淀粉酶的测定采用的是还原糖测定法-DNS测定法，测量结果显示优级浓香大曲(PBBQ)的α-淀粉酶活为86.98±1.14U/g，普通浓香大曲(NBBQ)的酶活为83.43±2.61U/g；
蛋白酶活力测定依照SB_T 10317-1999,PBBQ的蛋白酶活力为360.45±2.62U/g，NBBQ的蛋白酶活力为213.92±10.49U/g；
纤维素酶活的测定依照QB 2583-2003；PBBQ的纤维素酶活力为187.95±2.74U/g，NBBQ的纤维素酶活力为56.19±0.78U/g；
果胶酶活的测定采用的是还原糖测定法—DNS测定法，PBBQ的果胶酶活力为17.41±0.27U/g，NBBQ的果胶酶活力为10.73±0.38U/g。
实施例2宏蛋白组样品提取方法的建立
取出在合适温度下保存的大曲样品，在MP震荡管中加入适量的大曲样品，然后再加入适量的BPP提取液，加入适量的研磨珠。使用高通量组织研磨仪进行震荡，震荡后在相应的条件下离心获得上清液，将3个MP震荡管中的上清转移到同一个离心管中，再加入相同体积的Tris-饱和酚溶液，再次震荡离心获得含有蛋白的酚层，再次加入相同体积的提取液，然后震荡离心获得含有蛋白的上清液，加入相同体积预冷的乙酸铵甲醇溶液，-20℃过夜沉淀蛋白；第二日震荡离心去掉上清液，向沉淀中加入预冷丙酮混匀后离心去掉上清，重复这个操作两次。用裂解液溶解蛋白样品后，通过蛋白浓度测定和SDS-PAGE操作显示，用此方法提取的宏蛋白质组样品符合质谱分析要求。
实施例3宏蛋白组样品的酶解和质谱分析方法
宏蛋白组蛋白样品的酶解：蛋白定量后，取50μg蛋白/每样溶液置于EP管中；加入终浓度为10mM的DTT(二硫苏糖醇)(10mM IAA(碘乙酰胺)in H2O)，37℃孵育1h。冷却至室温，加入终浓度为30mM的IAA(50mM IAA in H2O)，室温放置30min。加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:25)37℃恒温过夜。第二天，加50μL 0.1％的FA甲酸终止酶切，收集消化后的馏分，保存在-80℃下进行MS分析。
LC-MS/MS分析：将每个级分重悬于缓冲液A(0.1％甲酸，FA)中。使用EASY-nLC1000系统(美国Thermo Fisher Scientific)和Orbitrap Fusion(美国Thermo FisherScientific)质谱仪进行分离。肽以0.3μL/min的流速经过C18捕集柱(3um，0.1×20mm)。在线将肽脱盐，并使用1％-96％缓冲液B(0.08％FA和80％ACN)的梯度将其加载到C18柱(1.9um，150um×120mm)上，持续120分钟。质谱仪使用依赖于数据的采集方法以正模式运行。在Orbitrap中获得了完整的MS扫描(250-1450m/z)，分辨率设置为120,000。使用Maxquant和Proteome Discoverer软件(Thermo Fisher Scientific)在Uniprot-gallusFASTA数据库中搜索所有MS/MS光谱数据(RAW文件)。用于搜索的前体质量公差为20ppm，碎片离子质量公差为±0.5Da。最大错过的切割位点为两个，酶特异性为胰蛋白酶，在氧化(M)和乙酰基(蛋白质N-末端)的可变修饰下进行搜索，将半胱氨酸氨基甲酰甲基化设置为固定修饰。
实施例4浓香大曲物种组成和酶的生物功能分析
在剔除植物(全部来源于小麦)进行浓香大曲蛋白来源的物种组成分析后，在浓香大曲中发现了各种常见的酵母菌和霉菌，并且它们由它们产生的蛋白比例很高。这些菌代谢产生的代谢产物，在大曲发酵过程以及后续白酒酿造过程起着不同的作用。例如红曲霉在生长代谢过程中能够产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶、麦芽糖酶等多种酶类物质。通过KEGG代谢通路分析发现，浓香大曲中大部分的酶跟碳水化合物代谢和氨基酸的生物合成相关，这两条途径上富集了浓香大曲中大量的酶。并且氨基酸的进一步代谢会产生很多浓香白酒典型风味物质的前体，已经有研究表明白酒中的氨基酸对高级醇的合成有着重要的影响。包括由亮氨酸生成的异戊醇、由苏氨酸生成的1-丙醇、由缬氨酸生成的异丁醇、由苯丙氨酸生成的2-苯乙醇，以及白酒的酸、甜、苦和涩的味道。结果如图4所示，可见通过宏蛋白质组学技术解析出浓香大曲中蛋白的物种来源和浓香大曲酶系主要参与的生物过程是可行的。
实施例5酶活测量对宏蛋白质组学结果的验证
通过浓香大曲优级曲和普通曲酶活的检测，在宏蛋白质组学结果中查找所有跟相应酶类相关的蛋白，计算蛋白的含量反映的酶活高低是否跟酶活检测结果相一致。宏蛋白质结果显示，浓香优级大曲中的所有跟α-淀粉酶相关蛋白的总含量高于浓香普通大曲，结果表明前者的α-淀粉酶活力应高于后者，与酶活检测结果一致。
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