一种牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法
阅读说明：本技术 一种牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法 (Digestion characteristic evaluation method of bovine bone collagen polypeptide ) 是由 朱瑶迪 李苗云 赵改名 赵静 陈夏男 李婷婷 于 2021-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法,包括以下步骤：(a)配置消化液,包括配置模拟唾液SSF、模拟胃液SGF、模拟肠液SIF,利用GI20体外模拟消化系统进行模拟体外消化过程,包括ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠；(b)测定不同分子量胶原蛋白多肽的消化特性,包括检测步骤(a)中ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠中的消化前后消化物的消化率。本发明提供的牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法,测定不同酶解条件下不同分子量胶原蛋白多肽的消化特性,采用完全模拟的方式进行快速获得数据,为企业大规模生产不同分子量胶原蛋白多肽提供有效的手段。(The invention discloses a method for evaluating the digestion characteristics of bovine bone collagen polypeptide, which comprises the following steps: (a) preparing digestive juice, including preparing simulated saliva SSF, simulated gastric fluid SGF and simulated intestinal fluid SIF, and performing simulated in-vitro digestion process by using a GI20 in-vitro simulated digestion system, including i oral cavity, ii stomach and iii small intestine; (b) determining the digestion characteristics of collagen polypeptides of different molecular weights comprising determining the digestibility of the digest in step (a) before and after digestion in the mouth i, stomach ii and small intestine iii. The digestion characteristic evaluation method of the bovine bone collagen polypeptide provided by the invention is used for measuring the digestion characteristics of the collagen polypeptides with different molecular weights under different enzymolysis conditions, and rapidly acquiring data by adopting a complete simulation mode, thereby providing an effective means for large-scale production of the collagen polypeptides with different molecular weights for enterprises.)
技术领域
本发明属于胶原蛋白多肽技术领域，尤其涉及一种牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法。
背景技术
随着我国肉牛养殖的集约化和肉类加工业的发展，肉牛屠宰加工副产物也随之增加，尤其是牛骨，据国家统计局统计2018年肉类总产量约8517万吨，约占世界总产量的1/4，其所产的鲜骨可达2500万吨，“骨头不当肉”，是人类传统的消费观念，我国有许多屠宰业废弃物如骨头可以转化成饲料或食品添加剂等资源，但由于开发力度不够，一般经过简单加工为骨泥后销往肉制品企业作为填充料，或直接销往市场，经济效益差，资源没有得到充分的利用。
畜禽骨骼中富含脂质、蛋白质骨胶原、软骨素和矿物元素等营养成分，可作为一种优质的蛋白质资源和脂质来源，对其开展深度综合利用和高值高效转化对保护环境和资源的可循环利用具有重要的实际意义，尤其是牛骨中含有丰富的胶原蛋白，而胶原蛋白是一种生物性高分子，是维持正常组织构造和性能的必要成分，具有良好的生物化学和生物相容性。将牛骨胶原蛋白经分段酶解，可获得不同分子量小分子蛋白多肽，与胶原蛋白相比食用后利用率更高，易被人体吸收，其功能有很大差别，如，分子量小于10kD的组分对大肠杆菌的抑菌活性很强、小于3kDa的具有较高的自由基清除率、小于1kDa的对人体不用消化可直接吸收，对人体代谢有很大的帮助等。这不仅使得畜禽骨得到高附加值利用，且可带来良好经济效益同时避免了环境污染，实现绿色可持续发展。
胶原蛋白肽中生物活性与其多肽组成多样性密切相关，如Asp-Gly-Glu-Ala可促进骨髓细胞向成骨细胞转化，从简单的二肽到具有环形结构的大分子多肽，还可以通过糖基化、磷酸化以及酰基化等修饰，在细胞生理代谢和调节中发挥重要作用，不同多肽组成对于人体的消化吸收也有显著影响。不同的多肽组成、功能等均有显著差异。因此，需要开发一种快速、无损的胶原蛋白多肽消化特性评价方法，来探究牛骨胶原蛋白多肽在不同消化阶段消化特性的变化，不仅可提高牛骨的附加值，且为不同活性肽的开发提供技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单便捷、快速高效的牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法，包括以下步骤：
(a)配置消化液，包括配置模拟唾液SSF、模拟胃液SGF、模拟肠液SIF，利用GI20体外模拟消化系统进行模拟体外消化过程，包括ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠；
(b)测定不同分子量胶原蛋白多肽的消化特性，包括检测步骤(a)中ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠中的消化前后消化物的消化率。
进一步地，所述步骤(a)中模拟体外消化ⅰ口腔的方法为：将胶原蛋白多肽加入SSF溶液，再加入唾液淀粉酶和溶菌酶，使用口腔模拟器模拟咀嚼，充分混合后放于GI-20体外胃肠模拟仪器中。
进一步地，所述步骤(a)中模拟体外消化ⅱ胃的方法为：取模拟口腔中消化物，加入SGF溶液和胃蛋白酶，恒温孵育后置于沸水浴中灭酶处理。
进一步地，所述步骤(a)中模拟体外消化ⅲ小肠的方法为：取胃消化物，添加SIF溶液和胰蛋白酶、胆汁盐，利用NaOH调节pH值，恒温孵育后置于沸水浴中灭酶处理。
进一步地，所述步骤(b)中不同分子量胶原蛋白多肽，由以下方法制备得到：
(1)将新鲜牛骨粉碎、清洗，加入纯净水，通过高效热压抽提进行骨素的提取，静置后三相分离，去除骨油和中间混合层，经管式离心机后浓缩获得牛骨素；
(2)将EDTA溶液加入步骤(1)中的牛骨素，脱除牛骨素中钙离子，获得胶原蛋白多肽第一粗产品；
(3)将NaCl溶液加入步骤(2)中的胶原蛋白多肽第一粗产品，通过盐析法进一步提纯，低温离心分离，获得胶原蛋白多肽第二粗产品；
(4)将乙酸溶液加入步骤(3)中的胶原蛋白多肽第二粗产品进行溶解，而后进行分段透析，先用乙酸溶液透析、再用蒸馏水透析，获得胶原蛋白多肽第三粗产品；
(5)选择多梯度酶解对步骤(4)中的胶原蛋白多肽第三粗产品进行酶解，得到胶原蛋白多肽原液。
(6)将步骤(5)中的胶原蛋白多肽原液通过不同分子量半透膜反复透析提纯，获得不同分子量胶原蛋白多肽。
进一步地，所述步骤(5)中多梯度酶解的方法包括：首先添加碱性蛋白酶，pH值9.0，酶解温度50℃，酶解2h，然后调节酶解液pH值8.0，再添加胰蛋白酶和复合风味蛋白酶，酶解温度40℃，酶解2h；最后90℃，20min灭酶处理。
进一步地，所述胶原蛋白多肽的多肽分子量分布为：
本发明具有的优点是：
(1)本发明提供的牛骨胶原蛋白多肽的消化特性评价方法，测定不同酶解条件下不同分子量胶原蛋白多肽的消化特性，采用完全模拟的方式进行快速获得数据，为企业大规模生产不同分子量胶原蛋白多肽提供有效的手段。
(2)本发明提供的不同分子量胶原蛋白多肽的制备方法，牛骨处理使用高效热压抽提和物理浓缩的方式，安全污染；在酶解过程中经过多次优化酶的种类和添加量，尤其是多梯度酶解，使得每一种酶都在最优条件下进行反应，而且不同酶反应后的底物基础上进行下一个酶反应的，不仅提高了酶解效率且获得了更为丰富的小肽产物。
附图说明
图1为酶解后牛骨胶原蛋白多肽体外消化率示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，另外，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明公开了一种牛骨胶原蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：新鲜牛骨粉碎—清洗—热压抽提—脱脂—脱钙—酸溶提取—分离纯化—酶解—超滤分离—牛骨胶原蛋白多肽。
(1)取一定量的新鲜牛骨，粉碎、罐内清洗去除血水，按照1:1加入纯净水，通过135℃，0.3Mpa高压抽提技术进行牛骨素的提取，静置后将牛骨油、混合物以及下层骨汤等三相分离，去除骨油和中间混合层，经管式离心机后浓缩获得牛骨素。
(2)以步骤(1)中热压抽提的牛骨素为底物，加入0.5mol/L EDTA作为脱钙剂，脱除骨素中的钙离子，获得较为纯净的胶原蛋白多肽第一粗产品；
(3)将0.9mol/LNaCl溶液加入步骤(2)中的胶原蛋白多肽第一粗产品，通过盐析法进一步提纯，经4℃，10000rmp离心30min，获得胶原蛋白多肽第二粗产品；
(4)将0.5mol/L乙酸溶液加入步骤(3)中的胶原蛋白多肽第二粗产品进行溶解，而后进行分段透析，先用0.2mol/L乙酸溶液透析、再用蒸馏水反复透析2d，获得胶原蛋白多肽第三粗产品；
(5)选择多梯度酶解对步骤(4)中的胶原蛋白多肽第三粗产品进行酶解，即首先添加3％碱性蛋白酶，pH值9.0，酶解温度50℃，酶解2h，然后调节酶解液pH值8.0，再2％添加胰蛋白酶和3％复合风味蛋白酶，酶解温度40℃，酶解2h；最后90℃，20min灭酶处理，得到胶原蛋白多肽原液。
表1牛骨胶原蛋白多肽的多肽分子量分布
分子量范围
分子量占比
<1kDa
25％～44％
1kDa-1.5kDa
15～40％
1.5kDa-2.5kDa
6％～10％
2.5kDa～3kDa
2％～5％
>3kDa
0.5％～1％
将上述胶原蛋白多肽原液通过不同分子量<1kDa、1～1.5kDa、2kDa，2～3kDa以及>3kDa半透膜反复透析提纯，可获得不同分子量胶原蛋白多肽。
利用GI20体外胃肠模拟体系进行探究牛骨胶原蛋白多肽在不同消化阶段消化特性变化，具体评价方法包括以下步骤：
(a)使用该系统前需要配置消化液，包括配置模拟唾液SSF、模拟胃液SGF、模拟肠液SIF，利用GI20体外模拟消化系统进行模拟体外消化过程，包括ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠；
消化液配置：①模拟唾液(SSF)配置：主要包括37.3g/L KCl 15.1mL，68g/LKH2PO43.7mL，84g/L NaHCO36.8 mL，30.5g/L MgCl2(H2O)60.5mL，48g/L(NH4)2CO30.06 mL，44.1g/L CaCl2(H2O2)0.025mL。②模拟胃液(SGF)：37.3g/L KCl 6.9mL，68g/L KH2PO40.9mL，84g/L NaHCO312.5 mL，117g/L NaCl，11.8mL，30.5g/L MgCl2(H2O)60.4mL，48g/L(NH4)2CO30.5 mL，6M HCl 1.3mL，44.1g/L CaCl2(H2O2)0.005mL，使用HCl调节pH＝2.0。③模拟肠液(SIF)：37.3g/L KCl 6.8mL，68g/L KH2PO40.8 mL，84g/L NaHCO342.5 mL，117g/L NaCl9.6mL，30.5g/L MgCl2(H2O)61.1mL，6M HCl 0.7mL，44.1g/L CaCl2(H2O2)0.04mL，使用NaOH调节pH至7.0。
模拟体外消化过程：①ⅰ口腔：取5mL的胶原蛋白多肽+10mL SSF，加一定酶活的唾液淀粉酶和溶菌酶，使用口腔模拟器模拟咀嚼2min，充分混合后放于GI-20体外胃肠模拟仪器中。②ⅱ胃：向模拟口腔的10mL口腔消化物中加8mL的SGF和2000U/mL的胃蛋白酶，0.448mL H2O，200r/mim，37℃恒温孵育2h，反应结束后将样品置于沸水浴中灭酶处理。③ⅲ小肠：取20mL胃消化物，添加8mL的SIF，添加100U/mL胰蛋白酶、10mM胆汁盐3mL，利用5MNaOH调节pH值，200r/mim，37℃恒温孵育2h，反应结束后将样品置于沸水浴中灭酶处理。
(b)测定不同分子量胶原蛋白肽的消化特性，包括检测步骤(a)中ⅰ口腔、ⅱ胃和ⅲ小肠中的消化前后消化物的消化率。测定不同分子量胶原蛋白多肽的消化特性，主要是检测ⅱ胃和ⅲ小肠中的消化前后消化物的消化率，详细指利用凯氏定氮法检测不同消化物的总氮的变化情况，同时利用激光共聚焦拉曼光谱快速测定消化后不同分子量胶原蛋白多肽的变化情况，检测不同分子量胶原蛋白多肽的消化前后的吸收率。
体外消化率的计算公式如下：
其中：DT表示不同酶液消化后蛋白质多肽的消化率，WO、WD分别代表消化前、后的多肽含量。
本发明实施例中不同分子量胶原蛋白多肽消化率有明显的差异，具体见图1所示，分子量越小，消化率越高，即<1kDa的小肽，消化率最高，能达到95％，1kDa-1.5k Da多肽，消化率约87％，1.5kDa-2.5k Da多肽，消化率约为68％左右。
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