阅读说明：本技术 一种猕猴桃离体花粉活力测定方法 (Actinidia chinensis in-vitro pollen activity determination method ) 是由 姚春潮 刘占德 蒋宏勤 李建军 杨开宝 白雪 钱峥 王潇 仇长斌 于 2020-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种花粉活力测定方法,尤其涉及一种猕猴桃离体花粉活力测定方法,属于植物技术领域。本发明公开了一种猕猴桃离体花粉活力测定方法,可有效的测定猕猴桃花粉活力。所用的花粉离体萌发液体培养基,以纯净水为溶剂,组分为10％蔗糖及浓度为100mg·L<Sup>-1</Sup>的硼酸。在10mL试管内装上6-7mL花粉培养液,然后加入0.1％～0.2％的花粉,试管封口,置于摇床之中,在25℃、100rpm/min的条件下培养2-3h,然后将花粉培养液混均,加一滴于载玻片,盖上盖玻片,在电子显微镜下观察花粉萌发和花粉管生长情况。培养液制备方便,操作简单,耗时短,成本低,效果好。本发明用于猕猴桃花粉萌发能力的测定领域。(The invention relates to a pollen activity determination method, in particular to a kiwi fruit in-vitro pollen activity determination method, and belongs to the technical field of plants. The invention discloses a method for determining the vitality of kiwi fruit in-vitro pollen, which can effectively determine the vitality of kiwi fruit pollen. The pollen in vitro germination liquid culture medium comprises purified water as solvent, 10% sucrose and 100 mg.L ‑1 Boric acid of (a). Putting 6-7mL of pollen culture solution in a 10mL test tube, adding 0.1% -0.2% of pollen, sealing the test tube, placing the test tube in a shaking table, culturing for 2-3h at 25 ℃ and 100rpm/min, uniformly mixing the pollen culture solution, adding a drop of the pollen culture solution to a glass slide, covering the glass slide, and observing the pollen germination and pollen tube growth conditions under an electron microscope. The culture solution is convenient to prepare, simple to operate, short in time consumption, low in cost and good in effect. The method is used for the field of determination of pollen germination capacity of kiwi fruits.)

一种猕猴桃离体花粉活力测定方法

技术领域

本发明属于植物技术领域，涉及植物的花粉活力测定，特别涉及一种猕猴桃离体花粉活力测定方法。

背景技术

猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属植物，原产于中国。猕猴桃富含维生素C、矿物质和可溶性膳食纤维，是果品中营养最全面的水果之一，被誉为“水果之王”。花粉作为植物的雄配子体，在有性生殖中发挥着重要作用，为了解决亲本花期不一致和远距离杂交及人工辅助授粉的问题，通常需要早期进行花粉的采集和贮藏，使用之前必须进行生活力的鉴定，以估价花粉是否有授精能力，以确定人工辅助授粉的花粉用量及授粉的效果。对猕猴桃花粉活力测定的现有技术中，采用固体培养基培养的操作相对复杂，需要的时间较长。专利CN201610136320.9记载了一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法,在晴天早晨9:00～10:30采集软枣猕猴桃大蕾期花苞并取出花药,将花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，在温度20～25℃的条件下，干燥20～28小时,使花药含水量达到4.5～6％，过60～80目的筛，然后将收集到的花粉密封并于-85～-75℃低温贮藏。将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温5～10min，将花粉均匀播撒于硼酸250～350mg/L、蔗糖45～55g/L、琼脂9.5～10.5g/L的固体培养基上培养(花粉播撒密度为在10×10倍显微镜下每个视野下花粉粒数为50～100粒)，在19～21℃暗培养5.5～6.5h，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。但固体培养基需要熬制、冷却才能使用，比较繁杂、耗时，花粉培养时间也需要5.5～6.5h。而采用染色法，虽然速度快、时间短，但结果极不稳定(杨红,余和明,李小艳,冯莹莹.猕猴桃花粉生活力测定方法及花药处理方法研究[J].北方园艺,2015(08):36-39)。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种猕猴桃离体花粉活力测定方法，其培养液制备方便，操作简单，耗时短，成本低，效果好，能够快速准确地测定猕猴桃离体的花粉活力。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种猕猴桃离体花粉活力测定方法，包括如下步骤：

1)培养液配制

2)花粉准备

3)花粉培养

在试管内装入花粉培养液，然后加入培养液重量0.1％～0.2％的猕猴桃离体花粉，试管封口，置于摇床之中培养2-3h；

4)观察花粉萌发情况

滴加花粉培养液一滴于载玻片，盖上盖玻片，在电子显微镜下观察载玻片上花粉的萌发情况，以花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发，随机观察5个视野进行记录，实验重复3次；

5)计算花粉的萌发率

花粉萌发率＝每个视野萌发的花粉数/视野内花粉粒总数，计算15个视野的花粉萌发率，并取平均值，得出猕猴桃离体花粉活力。

所述培养液以纯净水为溶剂，加入蔗糖和硼酸，培养液中蔗糖质量分数为10％，硼酸浓度为100mg·L^-1。

所述花粉为新鲜花粉或冷冻花粉，新鲜花粉于上午9:00～10:00选择当日散粉的猕猴桃雄株花朵采集花粉，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉；冷冻花粉是将冷冻的花粉从冻存环境中取出，置于4～5℃环境下10～12小时，然后打开装花粉瓶的盖子或将花粉倒在玻璃器皿、塑料器皿内，置于15～22℃、湿度70～80％、避免阳光直晒的环境下复温、吸湿2～3小时，得到经过预湿处理的冷冻存放花粉。

所述花粉培养是在10mL试管中装入6-7mL花粉培养液，然后加入猕猴桃离体花粉，在25℃、100rpm/min的条件下培养2-3h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种猕猴桃离体花粉活力测定方法，相对于目前花粉活力固体培养法，其操作简便，且花粉培养仅需2-3h，远低于固体培养法的5.5～6.5h；

目前，染色法测定猕猴桃花粉活力的方法包括氯化三苯四氮唑(TTC)染色法、碘－碘化钾(I2－KI)、亚甲基蓝染色法3种，虽然染色快，但误差较大。本发明相对于染色法，猕猴桃离体花粉分散在培养液中，采用适宜浓度的蔗糖-硼酸溶液并在合适的温度下培养离体花粉，并通过摇床的不断摇动，为猕猴桃花粉萌发提供充足的氧气，以保证有生活力的花粉正常萌发，并且统计方法明确，因此运用此方法测定花粉活力，其结果易于观察，便于统计，可重复性高，所得数据准确可靠。

附图说明

图1是不同蔗糖浓度下花粉的萌发率。

图2是不同硼酸浓度下花粉的萌发率。

图3是不同培养温度下花粉的萌发率。

图4是不同培养时间下花粉的萌发率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

实施例1

本实施例所述猕猴桃离体花粉萌发的培养方法，所用离体花粉为猕猴桃的新鲜花粉。

于猕猴桃开花期采集猕猴桃大蕾期花朵带回实验室，用镊子取出花药并置于白纸上，在20℃左右的室温条件下进行阴干一天左右，用100-150目的筛子筛出花粉，在液体培养基中加入重量为其0.1％的花粉进行培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。

实施例2

本实施例所述猕猴桃离体花粉萌发的培养方法，所用离体花粉为猕猴桃的冷冻花粉。

将冷冻的猕猴桃花粉从冻存环境中取出，置于4～5℃环境下10～12小时，然后打开装花粉瓶的盖子，置于15～22℃、湿度70～80％的培养箱内复温、吸湿2～3小时，然后在液体培养基中加入重量为其0.1％的花粉进行培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。

实施例3

5月上旬，在西北农林科技大学猕猴桃试验站选择生长健壮，无病虫害的猕猴桃雄株，于上午9:00～10:00摘取当日散粉的花朵，置于硫酸纸上，迅速带回实验室，用毛刷刷下已散粉的花粉囊，收集花粉待用。配制蔗糖浓度为10％、硼酸浓度为100mg·L^-1的花粉液体培养基(即培养液)，分装于10mL试管内，每管6-7mL，然后加入0.1％的花粉，试管封口，置于摇床之中，于25℃，100rpm/min的条件下培养2.5h，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。统计时以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个处理进行3次重复，每重复随机选取5个视野，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数，计算花粉的萌发率，取平均值。萌发率(％)＝萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

实施例4

将冷冻的猕猴桃花粉从冻存环境中取出，置于4～5℃环境下10～12小时，然后打开装花粉瓶的盖子，置于15～22℃、湿度70～80％的培养箱内复温、吸湿2～3小时备用。配制蔗糖浓度为10％、硼酸浓度为100mg·L^-1的花粉液体培养基(即培养液)，分装于10mL试管内，每管6-7mL，然后加入0.1％的花粉，试管封口，置于摇床之中，于25℃，100rpm/min的条件下培养3h，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。统计时以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个处理进行3次重复，每重复随机选取5个视野，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数，计算花粉的萌发率，取平均值。萌发率(％)＝萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

上述各实施例中，液体培养基(即培养液)的成分相同。

实验例1

蔗糖浓度、硼酸浓度、培养温度、培养时间对花粉萌发率的影响

将实验变量分别设置为液体培养基中的蔗糖浓度、硼酸浓度、培养温度、摇床转速、培养时间，其余操作均与实施例3相同，变量设置具体如下：

将猕猴桃雄株花粉加入液体培养基中，蔗糖浓度(1％、5％、10％、15％、20％)，硼酸浓度(0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)，培养温度(19℃、22℃、25℃、28、31℃)，培养时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h)条件下进行培养。

以上变量分别在基础条件上进行变动，基础培养基为蔗糖10％，硼酸100mg/L。基础培养条件25℃、2.5h，黑暗培养。每次仅变动蔗糖浓度、硼酸浓度、培养温度、摇床转速、培养时间中的一个参数。

1)不同蔗糖浓度对花粉萌发率的影响

由图1可以看出蔗糖10％的培养基的花粉萌发率最高，其次为15％的蔗糖浓度的培养基。

2)不同硼酸浓度对花粉萌发率的影响

由图2可以看出培养基中硼酸浓度为100mg/L时，花粉萌发率最高，其次为50mg/L硼酸浓度的培养基。

3)不同培养温度对花粉萌发率的影响

由图3可以看出，当培养温度为25℃时，花粉萌发率最高，其次为22℃和28℃。

4)不同培养时间对花粉萌发率的影响

由图4可以看出，在1h～4h时间范围内，随着培养时间的延长，花粉萌发增加，2h前花粉萌发率增幅较大，但2h后花粉萌发率增加不明显。

实验例2

本发明与目前猕猴桃花粉活力测定方法的比较

以实施例4为本发明的基本操作，对照花粉固体培养方法参考专利CN201610136320.9，花粉染色活力测定法参照杨红等方法(2015)。花粉为冷冻花粉，花粉处理按实施例4进行。实验结果如下：

表1猕猴桃花粉活力测定方法比较

由表1可以看出，固体培养法花粉培养的时间最长，其次为本发明的液体培养法，染色法总体用时短。从判断花粉活力难易程度分析，固体和液体法的花粉活力判断是直接看花粉是否发芽，容易判断，但染色法则看花粉是否染色，由于花粉染色程度不一、染色范围不一，判断时难度较大。从花粉活力检测结果来看，固体和液体法基本相近，但染色法差异较大，说明培养法比染色法结果更精确。由此，本发明在缩短培养时间的前提下，保证了精确的结果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应注意，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。