阅读说明：本技术 黄连配方颗粒的微生物限度检查方法 (Microbial limit inspection method for coptis chinensis formula granules ) 是由 胡梦莹 王志斌 张连中 高春 牛策 秦柳 李娜娜 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法,包括以下步骤：S1分别配制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液；S2供试液的制备：配制含有3%组氨酸的供试液；S3需氧菌总数计数方法适用性试验；S4霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验；S5大肠埃希菌检查方法适用性试验；其中限度检测标准为：1 g供试品中,需氧菌总数≤10<Sup>3</Sup> cfu,霉菌和酵母菌总数≤10<Sup>2</Sup> cfu,大肠埃希菌不得检出。本发明的方法可用于黄连配方颗粒中微生物限度检查,具有有效地消除样品的抑菌性、简化检查过程、减少试剂用量、高效检测出黄连配方颗粒中微生物的优点。(The invention discloses a microbial limit inspection method of coptis chinensis formula granules, which comprises the following steps: s1 respectively preparing bacterial suspensions of staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa, bacillus subtilis, candida albicans and aspergillus niger; s2 preparation of test solution: preparing a test solution containing 3% histidine; s3 test of applicability of total aerobic bacteria count method; s4 mould and yeastCarrying out a total bacteria count method applicability test; S5E, performing an Escherichia coli inspection method applicability test; wherein the limit detection criteria are: 1g of the sample contains aerobic bacteria with a total number of less than or equal to 10 3 cfu, total number of mould and microzyme less than or equal to 10 2 cfu, Escherichia coli could not be detected. The method can be used for checking the microbial limit in the coptis chinensis formula particles, and has the advantages of effectively eliminating the bacteriostatic activity of a sample, simplifying the checking process, reducing the reagent dosage and efficiently detecting the microbes in the coptis chinensis formula particles.)

黄连配方颗粒的微生物限度检查方法

技术领域

本发明涉及中药检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法。

背景技术

黄连具有清热燥湿，泻火解毒的功效，常用于治疗湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮等症状，因此黄连被制成中药制剂进行相关疾病的治疗。

黄连常被制作成颗粒状，在进入市场流通之前，根据由国家食品药品监督管理总局公告发布的《中华人民共和国药典》的相关要求，要对黄连进行微生物限度检查。目前，对于药物中微生物限度检查的研究较多。

申请号为201810077354.4的发明专利公开了一种富马酸比索洛尔胶囊的微生物限度检查方法，所述的富马酸比索洛尔胶囊的微生物限度检查方法，步骤如下：(1)菌液制备；(2)供试液制备：取富马酸比索洛尔胶囊供试品10g，置于无菌均质袋中，加100ml的45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，用均质器拍打1min，摇匀，作为1：10的供试液；(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定；(4)大肠埃希菌的检查。

上述是对药物中进行微生物限度检查的常规方法，但是目前对于黄连中的微生物限度检查的方法还未被公开。而根据《中华人民共和国药典》中记录的中药中微生物限度检查方法，其中需要在检测过程中添加有效的中和剂，该有效的中和剂能够和黄连中干扰物结合，消除黄连样品的抑菌性，从而实现有效检测出黄连中微生物限度，但是《中华人民共和国药典》并未对黄连中能够消除干扰物的中和剂或灭活方法进行记载，而干扰物会直接影响黄连中微生物的限度检查结果。因此，根据《中华人民共和国药典》的相关记录无法准确检测出黄连中的微生物限度。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，其采用一种中和剂，具有有效地消除样品的抑菌性、简化黄连中微生物限度检查的过程、减少试剂用量、高效检测出黄连配方颗粒中微生物的优点。

为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：一种黄连配方颗粒的微生物限度检查方法，包括以下步骤：

S1菌悬液的配制：分别配制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液；

S2供试液的制备：

S2-1取黄连配方颗粒10g，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液；

S2-2取1:10的供试液20ml，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，即为1:50的供试液；

S2-3取1:10的供试液10ml，加含3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:100的供试液；

S3需氧菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的需氧菌总数；

S4霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组、菌液对照组和稀释剂对照组，并分别计数各组的需氧菌总数；

S5大肠埃希菌检查方法适用性试验：分别设置试验组、供试品组以及阴性对照组培养物，随后接种于相应培养基中，观察结果。

通过采用上述技术方案，由于在供试液中加入有效地中和剂组氨酸，组氨酸与黄连中的有效成分结合，消除了在黄连配方颗粒的微生物限度检查中黄连配方颗粒里的干扰物对于检查结果的影响，使得依据上述的方法能够更加准确地检查出黄连配方颗粒中存在的微生物，保证了产品的质量。

同时，在进行黄连配方颗粒的微生物限度检查中，只选用了一种中和剂(组氨酸)就实现了微生物检查要求，减少多个中和剂使用的复杂性、减少薄膜过滤的冲洗次数，进而使得试验中使用的培养基及试剂减少，检查过程更加简单。

进一步地，所述步骤S3包括以下步骤：

S3-1试验组：分别取五份1:100的供试液，每份供试液的体积为1ml，分别加置于100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤法过滤后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗多次，在最后一次冲洗液中分别于五份供试液中加入一种1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，然后取下滤膜并贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，在33℃的条件下培养3天；其中，五份供试液中加入的试验菌分别为：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉；S3-2供试品组：取1:100的供试液1ml，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作；

S3-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:100的供试液同试验组操作；

S3-4稀释剂对照组：取相应量的含3％的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作。

通过采用上述技术方案，以简单高效的步骤进行需氧菌总数计数方法适用性试验，获得准确有效的试验结果，提高方法的适用性。

进一步地，所述步骤S4包括以下步骤：

S4-1试验组：与步骤S3-1的不同之处在于，供试液选取1:50的供试液，试验菌液为白色念珠菌试验菌液和黑曲霉试验菌液，取下滤膜后贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20-25℃的条件下培养5天；

S4-2供试品组：取1:50的供试液1ml，以稀释剂代替菌液同步骤S4-1的试验组操作；

S4-3菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:50的供试液，其它同试验组操作；

S4-4稀释剂对照组：取相应量的含3％的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作。

通过采用上述技术方案，以简单高效的步骤进行霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验，获得准确有效的试验结果，提高方法的适用性。

进一步地，所述步骤S5具体包括以下步骤：

S5-1菌液制备：制备大肠埃希菌的菌悬液；

S5-2试验组：取1:10的供试液10ml，加置500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1ml含菌量为10-100cfu的大肠埃希菌菌液，注入上述500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，于33℃培养18-24h，观察；

S5-3供试品组：取1:10的供试液10ml，加置500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1ml稀释液代替菌液同试验组操作，观察；

S5-4阴性对照组：取相应量的含3％的组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作；

S5-5取上述培养物各1ml至100ml麦康凯液体培养基中，43℃的条件下培养24-48h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，33℃的条件下培养18-72h，观察结果。

通过采用上述技术方案，以简单高效的步骤进行大肠埃希菌检查方法适用性试验，获得准确有效的试验结果，提高方法的适用性。

进一步地，所述金黄色葡萄球菌菌悬液的制备包括以下步骤：接种金黄色葡萄球菌于10ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。

通过采用上述技术方案，由于采用3％的中和剂，消除金黄色葡萄球菌在生长过程中产生的干扰物质影响检测结果，使得对黄连配方颗粒中金黄色葡萄球菌的限度检查不受影响。

进一步地，所述铜绿假单胞菌菌悬液的制备包括依以下步骤：接种铜绿假单胞菌的新鲜培养物置于10ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。

通过采用上述技术方案，由于采用3％的中和剂，消除铜绿假单胞菌在生长过程中产生的干扰物质影响检测结果，使得对黄连配方颗粒中铜绿假单胞菌的限度检查不受影响。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌悬液的制备包括依以下步骤：接种枯草芽孢杆菌新鲜培养物置于10ml胰酪大豆胨液体培养基中，在30-35℃的条件下培养18-24h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。

通过采用上述技术方案，由于采用3％的中和剂，消除枯草芽孢杆菌在生长过程中产生的干扰物质影响检测结果，使得对黄连配方颗粒中枯草芽孢杆菌的限度检查不受影响。

进一步地，所述白色念珠菌菌悬液的制备包括以下步骤：接种白色念珠菌新鲜培养物于10ml的沙氏葡萄糖液体培养基中，在20-25℃的条件下培养18-24h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。

通过采用上述技术方案，由于采用3％的中和剂，消除白色念珠菌在生长过程中产生的干扰物质影响检测结果，使得对黄连配方颗粒中白色念珠菌的限度检查不受影响。

进一步地，所述黑曲霉菌悬液的制备包括以下步骤：取经20-25℃培养5-7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3-5ml的含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含孢子数为10-100cfu的孢子悬液。

通过采用上述技术方案，由于采用3％的中和剂，消除黑曲霉在生长过程中产生的干扰物质影响检测结果，使得对黄连配方颗粒中黑曲霉的限度检查不受影响。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

第一、本发明的方法在供试液中加入有效地中和剂组氨酸，有效消除了黄连配方颗粒中干扰物对于微生物限度检查结果的影响，使得依据上述的方法能够更加准确地检查出黄连配方颗粒中存在的微生物，保证了产品的质量；同时，在只选用一种中和剂的情况下就实现了黄连配方颗粒微生物限度检查的要求，使得试验过程简化、试剂使用减少、检查过程简单。

第二、本发明中优选采用在制备供试液中添加3％组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，有效消除了微生物生长过程中产生的干扰物对于微生物限度检查结果的影响，使得依据上述的方法能够更加准确地检查出黄连配方颗粒中微生物的含量，保证了产品的质量。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明中采用的菌株均购自中国医学细菌保藏管理中心，其中大肠埃希菌(Escherichia coli)的菌种编号为[CMCC(B)44102]，枯草芽孢杆菌的菌种编号为[CMCC(B)63501]，白色念珠菌(Monilia albican或Candida albicans)的菌种编号为[CMCC(F)98001]，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌种编号为[CMCC(B)10104]，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的菌种编号为[CMCC(B)26003]，黑曲霉(Aspergillusniger)的菌种编号为[CMCC(F)98003]。

胰酪大豆胨液体培养基购自北京三药科技开发公司；沙氏葡萄糖液体培养基购自北京三药科技开发公司，沙氏葡萄糖琼脂培养基购自北京三药科技开发公司；组氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；麦康凯液体培养基购自北京三药科技开发公司，麦康凯琼脂培养基购自北京三药科技开发公司。

实施例

本发明采用添加组氨酸的稀释液溶解样品，联合使用薄膜过滤法进行黄连配方颗粒的微生物检测。

(一)试验液的制备

菌液的制备

(1)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备接种一种菌于10ml胰酪大豆胨液体培养基中，在33℃的条件下培养21h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。选择的菌为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。

(2)白色念珠菌菌悬液制备

接种白色念珠菌新鲜培养物于10ml的沙氏葡萄糖液体培养基中，在23℃的条件下培养22h后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。

(3)黑曲霉

取经23℃培养6天的黑曲霉的新鲜培养物，加4ml的含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含孢子数为10-100cfu的孢子悬液。

供试液的制备

(1)1:10的供试液制备

取本品黄连配方颗粒10g，加含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液。

(2)1:50的供试液制备

取1:10的供试液20ml，加含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，即为1:50的供试液。

(3)1:100的供试液制备

取1:10的供试液10ml，加含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:100的供试液。

(二)需氧菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取五组1:100的供试液1ml，每组供试液加置于100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，所加入的试验菌分别为：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。然后取下滤膜后贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，在33℃的条件下培养3天，测定需氧菌总数。每种试验菌株平行制备2个平行样，并计算每种试样的需氧菌总数的平均值，具体的结果见表1，其回收比值平均值见表4。

表1试验组菌落计数

(2)供试品组：

取1:100的供试液1ml，以3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作，每种供试品组平行制备2个平行样，测定供试品本底的需氧菌总数，计算每种试样的需氧总数的平均值，结果见表2。

表2供试品对照组菌落计数

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:100的供试液同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，结果见表3。

表3菌液对照组的活菌数

表4试验组需氧菌回收比值

(4)稀释剂对照组：取相应量的3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液同试验组操作，计数后结果见表5，回收比值平均值见表6。

其中：每株菌株进行3次独立的平行试验，并分别计算每次试验的回收比值。

回收比值＝(试验组菌落数平均值-供试品组菌落数平均值)/菌液组菌落数平均值；每种试验菌的回收比值的范围为0.5-2.0即符合规定。

表5稀释剂对照组菌落计数(cfu)

表6稀释剂对照组需氧菌回收比值

经过上述的试验可得，采用上述方法进行本品的需氧菌总数计数可使回收比值达到要求。其中，稀释剂对照组的菌落回收比值＝稀释剂对照组菌落数平均值/菌液组菌落数平均值，其范围为0.5-2.0即可。

(三)霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取两组1:50的供试液1ml，加置100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，在第一组的最后一次冲洗液中加入1ml含菌量10-100cfu的白色念珠菌试验菌液，在第二组的最后一次冲洗液中加入1ml含菌量10-100cfu的黑曲霉试验菌液。随后取下滤膜，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在23℃的条件下培养5天，每种试验菌株平行制备2个平行样，测定霉菌和酵母菌的总数，计算每种试样的霉菌和酵母菌的平均值，具体的结果见表7，其回收比值的平均值见表10。

表7试验组菌落计数

(2)供试品组：取1:50的供试液1ml，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品本底的霉菌和酵母菌总数，计数结果见表8。

表8供试品对照组菌落计数

(3)菌液对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:50的供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，计数结果见表9。

表9菌液对照组的活菌数

表10试验组霉菌和酵母菌回收比

(4)稀释剂对照组：取相应量的稀释剂代替供试液同试验组操作，具体的计数结果见表11，其回收比值的平均值见表12。

表11稀释剂对照组菌落计数

表12稀释剂对照组霉菌和酵母菌回收比值

(四)控制菌(大肠埃希菌)检查方法适用性试验

大肠埃希菌液的配制

接种大肠埃希菌至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，在33℃的条件下培养18-24h后，用pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。经测定，加入的试验菌菌液中的菌数为42cfu/ml。

控制菌(大肠埃希菌)检查用培养基适用性检查

麦康凯液体促进生长能力和抑制能力的检查：接种10-100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在43℃的温度下可培养不超过24h，本实施例选择培养时间为18h，结果见表13；接种10-100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在43℃的温度下可培养不少于48h，本实施例选择培养时间为50h，结果见表13。上述的对照培养基的选取为常规选择即可。

麦康凯琼脂促进生长能力和指示特性的检查：用涂布法分别接种10-100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在33℃的温度下可培养不超过18h，本实施例选择培养时间为15h，结果见表13。

表13大肠埃希菌检查用培养基适用性检查

注：“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长，“/”表示不要求检测。

(五)大肠埃希菌检查方法验证：

(1)试验组：取1:10的供试液10ml，加置500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1ml含菌量为10-100cfu的大肠埃希菌菌液，注入上述500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，可于33℃培养18-24h，本实施例选择培养时间为23h，观察，具体结果见表14。

(2)供试品组：取1:10的供试液10ml，加置500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，另取1ml稀释液代替菌液同试验组操作，观察，具体结果见表14。

(3)稀释剂对照组：取相应量的稀释剂代替供试液同试验组操作，观察，具体结果见表14。

表14大肠埃希菌的检查结果

培养基名称	试验组	供试品对照组	阴性对照组
				麦康凯液体培养基	+	-	-
麦康凯琼脂培养基	+	-	-

注：“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长。

(六)方法适用性结论

依据方法适用性结果，制定微生物限度检查方法如下：

微生物限度

1.供试液的制备如制备例所述。

2.需氧菌总数计数：分别取1:100的供试液1ml，加置100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，取下滤膜，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，随后对胰酪大豆胨琼脂培养基上的需氧菌总数进行检测计数，具体结果见表15(方法参考《中华人民共和国药典》2015版、四部、1105非无菌产品微生物限度检查)。

3.霉菌和酵母菌总数计数：分别取1:50的供试液1ml，加置100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，取下滤膜，贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，共制备5份，合并计数，具体结果见表15(方法参考《中华人民共和国药典》2015版、四部、1105非无菌产品微生物限度检查)。

4.大肠埃希菌检验：取1:10的供试液10ml，注入500ml含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，可于33℃培养18-24h，本实施例选择培养时间为23h，观察，具体的检测结果见表15(方法参考《中华人民共和国药典》2015版、四部、1105非无菌产品微生物限度检查)。

上述具体检测结果见表15。

表15供试品微生物限度检查结果

批次	1	2	3
				需氧菌总数(cfu/g)	小于100	小于100	小于100
霉菌和酵母菌总数(cfu/g)	小于10	小于10	小于10
				大肠埃希菌	未检出	未检出	未检出

注：限度检测标准：1g供试品中，需氧菌总数≤10³cfu，霉菌和酵母菌总数≤10²cfu，大肠埃希菌不得检出。

表15表明，本发明的方法能够准确、可靠地检查出黄连配方颗粒的微生物限度。

对比例1

本对比例和实施例的区别在于：在本对比例中进行黄连配方颗粒中微生物限度检查的过程中，本对比例的供试液的稀释液中不添加3％的组氨酸，且在胰酪大豆胨琼脂培养基内不添加3％的组氨酸，具体如下：

(一)试验液的制备菌液的制备：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液的分别制备同实施例。

供试液的制备

(1)1:10的供试液制备

取本品黄连配方颗粒10g，溶解于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液。

(2)1:50的供试液制备

取1:10的供试液20ml，溶解于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，即为1:50的供试液。

(3)1:100的供试液制备

取1:10的供试液10ml，溶解于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:100的供试液。

(4)1:500的供试液制备

取1:50的供试液10ml，溶解于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:500的供试液。

(二)需氧菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取五组1:50的供试液1ml，每组供试液加置于100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，五组供试液中加入的试验菌的同实施例。然后取下滤膜后贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，可在33℃的条件下培养18-24h，本实施例选择培养时间为21h，测定需氧菌总数。每种试验菌株平行制备2个平行样，并计算每种试样的需氧菌总数的平均值，具体的结果见表16，其回收比值见表18。

重复上述的操作，分别以1:100和1:500的供试液替代1:50的供试液，其每种试样的需氧菌总数的平均值的具体的结果见表16，其回收比值的平均值见表18。

表16试验组菌落计数

(2)供试品组：

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备菌悬液，其它同实施例，分别对1：50的供试液、1:100的供试液以及1:500的供试液进行供试品组的需氧菌总数测定。需氧菌总数的检测结果均为0。

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别代替供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，结果见表17。

表17菌液对照组的活菌数

表18试验组需氧菌回收比值

经过上述的试验可知，采用上述方法进行本品的需氧菌总数计数时，由于干扰物对于黄连配方颗粒中的微生物检测造成影响，使得金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的检测受到影响，因此采用此方法进行黄连配方颗粒中需氧菌微生物限度的检测是不准确的。

(三)霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取两组1:10的供试液1ml，同实施例进行操作，测定霉菌和酵母菌总数，计算每种试样的霉菌和酵母菌的总数的平均值，具体的结果见表19，其回收比值见表21。

以1:50的供试液替代1:10的供试液进行试验，测定霉菌和酵母菌总数，计算每种试样的霉菌和酵母菌的总数的平均值，具体的结果见表19，其回收比值见表21。

表19试验组菌落计数

(2)供试品组：

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备菌悬液，其它同实施例，分别对1：10的供试液、1:50的供试液进行供试品组的霉菌和酵母菌总数测定。霉菌和酵母菌总数的检测结果均为0。

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别代替供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，结果见表20。

表20菌液对照组的活菌数

表21试验组霉菌和酵母菌回收比值

经过上述的试验可知，采用上述方法进行本品的霉菌和酵母菌总数计数时，由于干扰物对于黄连配方颗粒中的微生物检测造成影响，使得白色念珠菌的检测受到影响，因此采用此方法进行黄连配方颗粒中霉菌和酵母菌的微生物限度的检测是不准确的。

对比例2

本对比例和实施例的区别在于：在本对比例中进行黄连配方颗粒中微生物限度检查的过程中，本对比例的供试液的稀释液中添加的是0.3％的组氨酸，具体如下：

(一)试验液的制备

菌液的制备：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液制备同实施例。

供试液的制备

(1)1:10的供试液制备

取本品黄连配方颗粒10g，溶解于含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，作为1:10的供试液。

(2)1:50的供试液制备

取1:10的供试液20ml，溶解于含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，即为1:50的供试液。

(3)1:100的供试液制备

取1:10的供试液10ml，溶解于含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:100的供试液。

(4)1:500的供试液制备

取1:50的供试液10ml，溶解于含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:500的供试液。

(二)需氧菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取五组1:50的供试液1ml，每组供试液加置于100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法过滤后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，五组供试液中加入的试验菌同实施例。然后取下滤膜后贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，在33℃的条件下培养3天，测定需氧菌总数。每种试验菌株平行制备2个平行样，并计算每种试样的需氧菌总数的平均值，具体的结果见表22，其回收比值见表24。

重复上述的操作，分别以1:100和1:500的供试液替代1:50的供试液，其每种试样的需氧菌总数的平均值的具体的结果见表22，其回收比值见表24。

表22试验组菌落计数

(2)供试品组：

用含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备菌悬液，其它同实施例，分别对1：50的供试液、1:100的供试液以及1:500的供试液进行供试品组的需氧菌总数测定。需氧菌总数的检测结果均为0。

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别代替供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，结果见表23。

表23菌液对照组的活菌数

表24试验组需氧菌回收比值

经过上述的试验可知，采用上述方法进行本品的需氧菌总数计数时，由于干扰物对于黄连配方颗粒中的微生物检测造成影响，使得金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的检测受到影响，铜绿假单胞杆菌的检测结果也不准确，因此采用此方法进行黄连配方颗粒中需氧菌微生物限度的检测是不准确的。

(三)霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取两组1:10的供试液1ml，同实施例进行操作，测定霉菌和酵母菌总数，计算每种试样的霉菌和酵母菌的总数的平均值，具体的结果见表25，其回收比值见表27。

以1:50的供试液替代1:10的供试液进行试验，测定霉菌和酵母菌总数，计算每种试样的霉菌和酵母菌的总数的平均值，具体的结果见表25，其回收比值见表27。

表25试验组菌落计数

(2)供试品组：

用含0.3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备菌悬液，其它同实施例，分别对1：10的供试液、1:50的供试液进行供试品组的霉菌和酵母菌总数测定。霉菌和酵母菌总数的检测结果均为0。

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别代替供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，结果见表26。

表26菌液对照组的活菌数

表27试验组霉菌和酵母菌回收比值

经过上述的试验可知，采用上述方法进行本品的霉菌和酵母菌总数计数时，由于干扰物对于黄连配方颗粒中的微生物检测造成影响，使得白色念珠菌的检测受到影响，因此采用此方法进行黄连配方颗粒中霉菌和酵母菌的微生物限度的检测是不准确的。

对比例3

本对比例和对比例2的区别在于：在本对比例中进行黄连配方颗粒中微生物限度检查的过程中，本对比例的供试液的稀释液中添加的是3％的组氨酸，且在相应的培养基内添加3％的组氨酸，利用平皿法进行试验，由于对比例中主要是金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的检测不准确，因此本对比例仅仅对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行检测，具体如下：

(一)试验液的制备菌液的制备：

金黄色葡萄球菌的菌悬液制备和白色念珠菌菌悬液制备同实施例。

供试液的制备

(1)1:10的供试液、1:50的供试液和1:100的供试液的制备同实施例；

(2)1:500的供试液制备

取1:50的供试液10ml，溶解于含3％(wt，％)组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，即为1:500的供试液。

(二)需氧菌总数计数方法适用性试验

(1)试验组：

分别取五组1:100的供试液10ml，每组供试液中加入0.1ml含菌量10-100cfu的试验菌液，混匀，五组供试液中加入的试验菌同实施例。然后分别取1ml注入平皿中，倾倒15-20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，在33℃的条件下培养3天，测定需氧菌总数。每种试验菌株平行制备2个平行样，并计算每种试样的需氧菌总数的平均值，具体的结果见表28，其回收比值均为0。

重复上述的操作，以1:500的供试液替代1:100的供试液，其每种试样的需氧菌总数的平均值的具体的结果见表28，其回收比值均为0。

表28试验组菌落计数

批次	金黄色葡萄球菌(cfu)
		1:100的供试液	0
1:500的供试液	0

(2)供试品组：

取0.1ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌液同试验组操作，金黄色葡萄球菌总数的检测结果为0。

(3)菌液对照组：

以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别代替供试液，其它同试验组操作，测定上述制备好的金黄色葡萄球菌菌液中每毫升的活菌数，其含量为72cfu/ml。

经过上述的试验可知，采用上述方法进行本品的需氧菌总数计数时，由于干扰物对于黄连配方颗粒中的微生物检测造成影响，使得金黄色葡萄球菌的检测受到影响，试验组中金黄色葡萄球菌没有生长，因此采用此方法进行黄连配方颗粒中金黄色葡萄球菌的微生物限度的检测是不准确的。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。