多发性骨髓瘤肠道微生物标志物及应用和检测制剂

文档序号：1609438 发布日期：2020-01-10 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 多发性骨髓瘤肠道微生物标志物及应用和检测制剂 (Multiple myeloma intestinal tract microbial marker, application and detection preparation ) 是由周文简星星朱应红武明花向娟娟于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明首次公开了多发性骨髓瘤疾病检测的肠道微生物标志物及其应用和检测制剂,即：弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、产气克雷伯菌、变栖克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、唾液链球菌、口腔链球菌、格登链球菌、缓症链球菌、肺炎链球菌<I>、</I>丁酸盐产生菌、丁酸梭菌、糖丁基梭菌。这些肠道微生物标志物可一种单独或多种组合应用。本发明公开了以这些微生物标志物为特征构建的支持向量机(SVM)分类模型,应用于多发性骨髓瘤疾病的临床诊断。本发明还公开了该微生物标志物应用于制备多发性骨髓瘤疾病的诊断制剂。(The invention discloses an intestinal microbial marker for multiple myeloma disease detection, application and a detection preparation thereof for the first time, wherein the intestinal microbial marker comprises the following components in parts by weight: citrobacter freundii, enterobacter cloacae, Raoultella ornithinolytica, Klebsiella aerogenes, and Klebsiella variicolaBacteria, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, and Streptococcus pneumoniae 、 Butyrate producing bacteria, clostridium butyricum and clostridium saccharolyticum. These intestinal microbial markers may be used alone or in combination of two or more. The invention discloses a Support Vector Machine (SVM) classification model constructed by taking the microbial markers as characteristics, which is applied to clinical diagnosis of multiple myeloma diseases. The invention also discloses application of the microbial marker in preparation of a diagnostic preparation for multiple myeloma diseases.)

技术领域

本发明涉及生物技术、疾病诊断和生物医药领域，具体涉及多发性骨髓瘤的肠道微生物标志物及应用和检测制剂。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统的恶性肿瘤疾病，主要表现为骨髓浆细胞异常增生、并过度产生单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)。其发病率约为2～3人/10万人，多见于60岁以上老年人；随着我国近年来人口老龄化，MM发病人数呈上升趋势。在临床上MM患者常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害；且由于正常免疫球蛋白的生成受抑制，使得MM患者易于受到各种细菌性感染。但是MM的起病徐缓，早期并无明显症状，容易被误诊。当前，关于MM的临床诊断标准主要依据：1)血或尿中存在M-蛋白；2)骨髓中有克隆性浆细胞或浆细胞瘤；3)相关的器官或组织损害。而这些依据通常还需要与某些慢性疾病(如：风湿系统疾病、慢性结核感染、肾病、慢性肝病等)、淋巴瘤等可引起反应性浆细胞增多症和意义未明单克隆丙球蛋白血症(MGUS)进行鉴别；一些严重骨质疏松或低磷性骨病或转移癌也需要与MM的骨质破坏鉴别；此外，也存在极少数的无症状MM患者。另外，评估MM患者治疗效果的直接方法是检测患者骨髓中癌细胞的比例，而这个过程中的骨穿刺会增加患者的痛苦，也可能对能对患者造成二次伤害。

目前，关于MM患者的发病机理与其肠道菌群相关性的研究报道极少，机制尚不明确。此外，研究人员已发现宿主肠道对膳食营养能够优先吸收，这使得肠道中微生物菌群梯度氮限，表明宿主可以分泌含氮代谢物来实现对肠道微生物菌群的调节。而且，由于在MM患者发病进程中产生大量的无效单克隆蛋白在肾小管沉积，导致患者肾脏损伤，这直接使得患者血清中的尿素、肌酐等含氮代谢物的积累。我们通过研究发现，患者血清中累积的尿素会进入肠道中，并作为氮源物质调节肠道中的微生物菌群组成与丰度的改变，这将导致肠道中高效尿素利用的微生物大量增殖，而短链脂肪酸生产菌的生长受到抑制。因此，该项研究提示我们可以将某些特异性微生物作为标志物，通过检测并比较其在粪便样本中丰度的变化，一方面可作为MM临床诊断参考标准之一，另一方面也可以作为MM患者治疗效果的评价因素之一。

发明内容

本发明的目的是提供特异性的针对MM的肠道微生物标志物及其应用和检测制剂，为早期MM的临床诊断和MM治疗效果评估奠定了基础，提供了一种非入侵式且无创的检测方法，填补现有MM临床检测技术应用的空白。

本发明的第一个方面是提供MM特异性肠道微生物标志物，该肠道微生物标志物，来自于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和链球菌属(Streptococcus)的肠道微生物，及短链脂肪酸生产菌中的一种或多种的组合。

本发明实验结果显示肠杆菌科和链球菌属的微生物在MM样本中显著富集，而短链脂肪酸生产菌在MM样本显著缺失。

具体包括来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的Citrobacter freundii(弗氏柠檬酸杆菌)、Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)、Raoultella ornithinolytica(解鸟氨酸拉乌尔菌)、Klebsiella aerogenes(产气克雷伯杆菌)、Klebsiella pneumonia(肺炎克雷伯杆菌)、Klebsiella variicola(变栖克雷伯菌)，和来自链球菌属(Streptococcus)的Streptococcus gordonii(格登链球菌)、Streptococcus oralis(口腔链球菌)、Streptococcus mitis(缓症链球菌)、Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)、Streptococcus salivarius(唾液链球菌)；及短链脂肪酸生产菌：丁酸盐产生菌(Anaerostipes hadrus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、糖丁基梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)。

本发明结果显示有11个来自肠杆菌科或链球菌属的菌在MM样本中显著富集，和有3个短链脂肪酸生产菌在MM样本中显著缺失。

本发明的第二个方面提供一种应用于多发性骨髓瘤的临床诊断支持向量机(SVM)分类模型，是根据上述的肠道微生物标志物为特征，以微生物标志物在粪便样本中的绝对丰度或相对丰度为基础所构建的。可应用于多发性骨髓瘤疾病的临床诊断。

本发明结果显示：以上述的14个在MM样本中显著差异的微生物为特征所构建的SVM分类模型对多发性骨髓瘤疾病的诊断有较好的效果；但同样发现只以其中7个微生物为特征所构建的SVM模型对多发性骨髓瘤疾病的诊断也有较好的效果。

本发明的第三个方面是提供检测上述微生物标志物的制剂，在制备多发性骨髓瘤诊断制剂中的应用。

所述的检测上述肠道微生物标志物的制剂包括：获取待测粪便样本，提取样本中所有微生物DNA，对所提DNA序列进行宏基因组测序并获得微生物标志物绝对丰度的制剂，或者对微生物标志物的16S rDNA基因进行qPCR检测其相对丰度的制剂。

本发明的第四个方面是提供多发性骨髓瘤诊断制剂，包括利用上述的应用于多发性骨髓瘤临床诊断的SVM分类模型，以及上述的检测粪便样本中微生物标志物的绝对丰度或相对丰度的制剂构成。

本发明具体是通过宏基因组测序或qPCR检测待测粪便样本中肠道微生物标志物的绝对丰度或相对丰度，并利用已构建的SVM分类模型预测该检测样本是否患有MM的可能。

本发明的第五个方面是提供一种辅助治疗多发性骨髓瘤的食物、益生菌或者药物，所述的食物、益生菌或者药物能够降低弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)、产气克雷伯杆菌(Klebsiella aerogenes)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)、变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)、格登链球菌(Streptococcus gordonii)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)中的一种或多种的丰度或含量，和/或能够增加丁酸盐产生菌(Anaerostipes hadrus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum)中的一种或多种的丰度或含量。

本发明的第六个方面是提供一种筛选辅助治疗多发性骨髓瘤的食物、益生菌或者药物的方法，所述方法包括检测候选食物、益生菌或者药物干预之前和干预之后的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)、产气克雷伯杆菌(Klebsiella aerogenes)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)、变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)、格登链球菌(Streptococcus gordonii)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、丁酸盐产生菌(Anaerostipes hadrus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum)中的一种或多种的丰度或含量。

本发明优势：

(1)本发明MM的肠道微生物标志物经过大量筛选和验证，能够准确反映MM的临床诊断和MM治疗效果评估。

(2)本发明首次为早期MM的临床诊断和疗效评估提供了一种非入侵式且无创的检测方法，填补现有MM临床检测技术应用的空白。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细说明。除另外的定义，本文中所用的科技术语均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。本文中所用的命名和实验方法是公知的，且在所属领域中常规使用。使用标准技术进行的所有操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求以及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

附图说明

图1.两组样本中显著差异的肠道微生物。

图2.几种MM样本中富集的微生物丰度在ISS-2期与ISS-3期病人中比较。

图3.将14种微生物标志物作为特征，应用于宏基因组测序的绝对丰度数据构建SVM分类模型时的ROC曲线。

图4.将分类效果最好的7种微生物标志物作为特征，应用于宏基因组测序的绝对丰度数据构建SVM分类模型时的ROC曲线。

图5.将14种微生物标志物作为特征，应用于qPCR检测的相对丰度数据构建SVM分类模型时的ROC曲线。

图6.将7种微生物标志物作为特征，应用于qPCR检测的相对丰度数据构建SVM分类模型时的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1：粪便样本收集与DNA提取

在实施例中，我们遵守相关伦理要求共获取了19例初诊多发性骨髓瘤(MM)患者的新鲜粪便样本，和收集了18例健康对照(healthy control，HC)的粪便样本。两组(MM，HC)样本的性别比例、年龄和BMI指数均相匹配且不具有显著性差异(表1)。

获取两组新鲜的待测粪便标本后，立即用无菌棉签蘸取中间部位的粪便，放入无菌冻存管中，并于液氮中立即速冻，－80℃长期保存。若需立即提取粪便细菌DNA，则将新鲜样本放入无菌EP管待用即可。

使用Mogen公司的粪便微生物DNA提取试剂盒(HiPure Stool DNA Kits，MogenD3141-02)参照说明书提取粪便样本中微生物DNA，并于－20℃保存待用。

为了检测所提取的DNA的质量，可使用Nanodrop测定所提取的DNA的浓度，并配制1％Agarose gel胶，点样500ng DNA，于100V电压下凝胶成像30min以检测所提取的DNA是否降解。

表1.研究样本的临床特征

注:表示双尾Fisher精确检验；

表示双尾Welch T检验。

实施例2：样本宏基因组测序及生物信息学分析

利用Illumina HiSeq 2500测序平台，完成对所提取DNA样品完成宏基因组双端测序。利用软件Trimmomatic将原始序列中的低质量序列去除，并利用Bowtie2参照hg38基因组去除原始序列中的人类序列，以保留高质量的微生物序列读段。随后，利用Kraken软件和Kraken标准数据库可将其进行物种分类注释，得到每个样本中各分类水平(门、纲、目、科、属、种)的丰度矩阵(利用Kraken软件比对得到各菌种的读段数量被认为是绝对丰度；而对每个样本的绝对丰度归一化处理后的数据被认为是相对丰度)。最后，利用R包vegan和DESeq2分别对两组样本的物种多样性分析比较，并筛选识别两组样本中显著差异的物种分类。

我们对实施例1中两组样本(MM，HC)宏基因组测序，并基于两组样本在种水平的绝对丰度数据，计算了样本间的Bray-Curtis指数，结果显示两组样本的微生物组成显著差异(PERMANOVA,P＝0.001)；且基于菌属和菌种水平的绝对丰度数据，分别计算样本的Shannon-Wiener指数，发现MM样本在菌属和菌种水平的物种多样性均显著更高(单尾wilcoxon秩和检验，属水平：P＝0.045；种水平：P＝0.043)。尤其，在菌种水平上，我们利用R包DESeq2共识别了36个丰度显著差异的菌种，其中20个在MM样本显著富集，16个在HC样本中显著富集(图1)，这些显著差异的菌种均可作为MM疾病的潜在微生物标志物。

实施例3：荧光定量PCR检测粪便样本中差异微生物的相对丰度

为了排除由宏基因组测序及生信分析过程中所引进的偏差，我们在扩大样本中通过荧光定量PCR(qPCR)对实施例2中识别的36个显著差异的菌种进一步验证。首先，在NCBI数据库中找到差异菌种的16S rDNA基因序列，对其进行引物设计并生物合成待用。所设计完成的引物可利用TestPrime工具(https://www.arb-silva.de)查看该引物的细菌覆盖率，覆盖率越低，代表引物的特异性越高。由于我们只找到了其中34个差异菌种的16S rDNA序列，因此本例中只对34个菌种进行了验证(表2)。另外，本例中除了需要对差异菌种的16SrDNA设计引物外，还需要一对通用引物，该引物可实现对尽可能多的菌种的16S rDNA扩增(Maeda H,et al.Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green forActinobacillus actinomycetemcomitans,Porphyromonas gingivalis,Prevotellaintermedia,tetQ gene and total bacteria.FEMS Immunology&MedicalMicrobiology.2003,39:81-86)。其次，按照实施例1提取粪便样本中的DNA序列，并在扩大样本中通过qPCR进一步检测34种差异微生物的相对丰度。经验证，我们发现其中的14个菌种呈现显著差异(双尾Mann-Whitney检验，P<0.1)，其中Anaerostipes hadrus(丁酸盐产生菌)、Clostridium butyricum(丁酸梭菌)、Clostridium saccharobutylicum(糖丁基梭菌)在HC样本中显著富集，而Citrobacter freundii(弗氏柠檬酸杆菌)、Enterobactercloacae(阴沟肠杆菌)、Raoultella ornithinolytica(解鸟氨酸拉乌尔菌)、Klebsiellaaerogenes(产气克雷伯菌)、Klebsiella variicola(变栖克雷伯菌)、Klebsiellapneumonia (肺炎克雷伯菌)、Streptococcus salivarius(唾液链球菌)、Streptococcusoralis(口腔链球菌)、Streptococcus gordonii(格登链球菌)、Streptococcus mitis(缓症链球菌)、Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)在MM组显著富集(表3)。该结果显示3个短链脂肪酸生产菌在HC样本中富集；而11个来自肠杆菌科或链球菌属的菌在MM样本中富集。该结果也提示，将这14个差异微生物作为MM疾病的微生物标志物可能会更加准确。此外，我们还发现11个MM样本中富集的菌种在ISS-3期病人中的丰度比ISS-2期病人更高(图2)，这暗示了随着MM病程增加，这些微生物标志物丰度也在增加。

表2.实施例3中涉及的34个差异菌种16S rDNA的引物(以下引物依次见序列表SEQID No.1-70)

注:“覆盖率”是指该引物可用于16S rDNA引物的菌种占所有菌种的比例，占比越低说明该引物的菌种特异性越高；Total Bacteria表示可用作全部细菌的16S rDNA引物，即通用引物。

表3.qPCR验证显著的14个差异菌种

qPCR检测粪便样本中差异微生物的相对丰度的实验方法及步骤：首先通过常规PCR扩增，检测并确定各菌种引物的退火温度；随后以每个样本所提DNA作为模板、分别用每个差异菌种的特异引物进行荧光定量PCR反应，并记录每对引物的循环数(CT值)；最后采用Roche LightCycler96对qPCR结果进行初步分析：首先调整阈值和基线，将阈值设置在指数期的初期，且同一个基因阈值调成一致。然后去除无表达、溶解曲线较差、且CT<8和CT﹥35的反应。并计算每个样本中各差异菌种的相对丰度，任意菌种i的相对丰度可公式表示为：R(_i)＝(1/2)^(CT_i－CT_c)，其中CT_i表示菌种i引物的循环数，CT_c表示通用引物的循环数。

常规PCR反应体系如下：

共计20μL。在Biorad常规PCR仪上按下述条件完成PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火梯度温度(50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃)30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，确定各细菌的引物的退火温度。

qPCR反应体系如下：

共计20μL。不同的细菌分别在各自的反应体系中进行单重qPCR扩增。在荧光定量PCR仪上进行qPCR反应，反应条件为：1)50℃孵育2min；2)95℃变性2min；3)95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸1min、并重复40个循环；4)熔解曲线分析，60℃～95℃，15s。

实施例4：以微生物标志物为特征构建支持向量机分类模型

直接以实施例3中验证显著的14个差异菌种全部作为分类特征，以宏基因组测序的种水平的绝对丰度为数据基础，通过R软件(版本3.6.1)利用R包e1071(版本1.7-2)以核函数radial构建支持向量机(SVM)的分类模型(C-classification)(Cortes C,VapnikV.Support-vector networks.Machine Learning.1995,20(3):273–297)。

通过网格搜索方法优化发现，当设置核函数的参数(gamma)为0.5，损失惩罚函数参数C(cost)为8时，所构建的SVM模型分类表现最佳，其AUC面积为0.947，95％置信区间(95％CI)为0.884～1(DeLong)，模型ROC曲线如图3所示。此外，为进一步评价14个微生物标志物作为分类特征的重要程度，我们分别将其单独作为分类特征来构建SVM模型，并比较其AUC及95％置信区间(表4)。其中我们发现有7个微生物标志物的AUC值在0.8以上，即：Citrobacter freundii，Enterobacter cloacae，Klebsiella aerogenes，Klebsiellapneumoniae，Raoultella ornithinolytica，Streptococcus gordonii，Streptococcusmitis，这暗示了这几个特征对模型分类具有更好的分类特性。因此，联合使用这7个微生物标志物为分类特征重新构建SVM模型，当设置gamma参数为16、cost参数为1时，所构建的SVM模型分类表现最佳，其AUC面积为0.909，95％置信区间为0.816～1(图4)，暗示只需应用这7个分类特征就可以达到14个分类特征的效果。因此，该方法也提示在实际的临床应用中，我们可以灵活筛选有效的微生物标志物。

表4.将14个微生物标志物分别单独作为特征时SVM模型AUC及95％置信区间

为了进一步检验所构建的SVM分类模型在预测新样本时的准确性，我们重新收集了14例(HC样本3例，初诊MM11例)粪便样本，并完成宏基因组测序，同样通过Kraken软件获得样本的绝对丰度数据。然后，利用上文所述的两个SVM分类模型(以14个微生物为特征构建的SVM_14模型；以7个微生物为特征构建的SVM_7模型)对新测序的14例样本进行预测，结果显示两个模型均有10例样本预测正确，即正确率均为71.4％，提示这两个模型均具有较强的预测能力(表5)。

表5.两个SVM模型对验证样本的预测与真实值的对比

实施例5：微生物标志物特征对qPCR相对丰度数据构建支持向量机分类模型

根据实施例4的结果显示，以14个特征微生物构建的SVM分类模型相比于以其中7个特征微生物构建的SVM分类模型的预测效果相差不大，均表现了较强的预测能力。但是，考虑到宏基因组测序成本高、时间周期长、数据分析麻烦，我们进一步尝试以微生物标志物为特征对qPCR相对丰度数据(方法见实施例3)构建SVM分类模型。这里共有44例粪便样本被收集，其中HC样本21例，初诊MM样本23例，并通过qPCR检测了每个样本中14种特征微生物的相对丰度数据，用于构建SVM模型构建。与实施例3中所述方法一致，利用R包e1071以核函数radial构建支持向量机(SVM)的分类模型(C-classification)。其中，当以14个微生物为特征时，设置gamma参数为0.015625、cost参数为8，模型的AUC面积为0.942，95％置信区间(95％CI)为0.881～1(DeLong)(图5)；而当只以其中7个微生物(即实施例3中所述最优的7个微生物特征)为特征时，设置gamma参数为32、cost参数为1，模型的AUC面积为0.909，95％置信区间(95％CI)为0.820～0.998(DeLong)(图6)。该结果暗示这些微生物特征应用于qPCR方法检测的相对丰度数据同样适用，且同样具有较高的准确性。

序列表

<110> 中南大学

<120> 多发性骨髓瘤肠道微生物标志物及应用和检测制剂

<130> 无

<160> 70

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA