阅读说明：本技术 一种dna可逆保护和分离的方法 (Method for reversible protection and separation of DNA ) 是由 曹博 张清华 刘莉莉 季红 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种对DNA进行可逆保护和分离的方法,首先将目标DNA分子的5’端进行磷酸化；然后将5’端腺苷化修饰；终止反应后获得的样品中加入对腺苷化修饰DNA敏感的核酸外切酶消化模板；最后将获得的腺苷化修饰DNA,即分离所得目标DNA,进行测序鉴定等技术分析,所得序列的5’端即为腺苷化修饰位点。本发明提供的方法,填补了现有技术无法精确定位基因组DNA上断裂位点的空白,能够实现对不同长度和不同来源的DNA样品进行断裂位点的定量和定位分析,使用简便,易于操作,而且对样品无特殊要求,准确率高、检测背景影响低、分辨率高。(The invention provides a method for reversible protection and separation of DNA, firstly phosphorylating the 5' end of a target DNA molecule; then the 5' end is modified by adenylation; adding an exonuclease digestion template sensitive to the adenylation modified DNA into a sample obtained after terminating the reaction; and finally, carrying out technical analysis such as sequencing identification on the obtained adenylation modified DNA, namely the target DNA obtained by separation, and obtaining a sequence with the 5' end as the adenylation modified site. The method provided by the invention fills the blank that the prior art can not accurately position the fracture site on the genome DNA, can realize the quantitative and positioning analysis of the fracture site on DNA samples with different lengths and different sources, is simple and convenient to use and easy to operate, has no special requirements on the samples, and has high accuracy, low detection background influence and high resolution.)

一种DNA可逆保护和分离的方法

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于对DNA大分子进行可逆保护和分离的方法。

背景技术

DNA分子存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA的完整性对细胞至关重要。然而，多种外界环境和生物体内部的因素都会导致DNA分子的损伤或改变，如紫外线、辐射、致癌性化学物质、细胞自身代谢过程中产生的氧化压力等。这些损伤破坏了基因组的完整性，并威胁着基因组的稳定。现在普遍认为DNA损伤是癌症和许多其他与衰老相关疾病的主要原因，因此对人类健康来说这是一个非常重要的问题。

在诸多DNA损伤类型中，链断裂（Strand break）是公认的对细胞危害最大的一种损伤，因为链断裂可以阻断DNA复制、转录等过程，同时还可能导致重组事件发生。因此，DNA链断裂是生命科学领域的一个研究热点。其中，研究基因组DNA上链断裂发生的位置和规律是理解该类损伤的基础。

目前，在全基因组范围内定位DNA断裂位点的技术主要有两种：Baranello课题组开发的DSB-Seq、SSB-Seq技术和Philipp Kapranov课题组的SSiNGLe技术。前者使用生物素和地高辛分别标记双链断裂位点和单链断裂位点，然后亲和富集标记的DNA片段并结合二代测序进行分析。SSiNGLe技术在DNA片段化过程中，利用微球菌核酸酶（MNase）消化DNA产生3’磷酸末端，然后通过末端转移酶（TDT）添加PolyA尾来对具有3’羟基末端的DNA断裂位点进行标记捕获，并与二代测序相结合。这两种方法虽然实现了全基因组范围内对DNA断裂位点的定位，但是它们在应用过程中均存在局限性。例如，DSB-和SSB-seq对断裂位点定位的分辨率较低，测序过程中背景高等；而SSiNGLe技术无法检测发生在DNA腺嘌呤（Adenine，A）上的断裂。

因此，鉴于DNA断裂的重要性和目前鉴定技术的局限性，本发明开发了一种通过对目标DNA分子进行可逆保护和分离的方式，实现了低成本、高灵敏度、高分辨率定位DNA断裂位点，并且进一步应用于定位DNA多种类型的损伤和修饰的研究。该技术将极大推动DNA损伤－修复过程、癌症发生机理及预防、药物安全性评估、基因治疗、遗传疾病等领域的科学研究和临床应用。

发明内容

针对现有检测DNA损伤方法背景高、分辨率低、准确率低的问题，本发明提供一种可用于检测DNA损伤的DNA可逆保护和分离的方法，能够高精度定位DNA损伤位点，可以应用于不同长度和不同来源的DNA样品，可以对目标DNA进行单分子、单核苷水平的分离和分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种DNA可逆保护和分离的方法，包括以下步骤：

（1）将DNA分子通过酶处理，获得含5’磷酸化DNA的样品；

（2）将含5’磷酸化DNA的样品解旋获得单链DNA；

（3）将单链DNA进行5’腺苷化标记，获得含5’腺苷化DNA的样品；

（4）使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶对步骤（3）获得的样品进行消化，去除未被5’腺苷化修饰的单链DNA，纯化后获得腺苷化修饰的目标DNA分子；

（5）对腺苷化修饰的目标DNA分子进行去腺苷化处理，即可获得目标DNA分子。

步骤（1）中，所述DNA分子的来源不限，可以是人工合成或提取自动物、植物或微生物；可以根据样品的不同而采用本领域内常用的DNA提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法、CTAB法等，也可以使用商业化的试剂盒。

步骤（1）中，所述DNA分子可以是双链也可以是单链。可选地，所述DNA分子为单链时，可省略步骤（2）。

步骤（1）中，所述酶为能够将含有5’羟基的DNA转化为5’磷酸化DNA的酶，如，T4多聚核苷酸激酶；也可以是参与DNA损伤位点的切除修复酶，这些酶能够产生的5’磷酸末端，如，DNA糖基化酶和核酸内切酶，根据具体需要检测的片段选择如尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGGl）、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）、胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）等DNA糖基化酶中的一种或几种和核酸内切酶IV。

优选地，步骤（2）中，所述解旋过程为热变性。具体地，获得单链DNA的步骤为：将DNA热变性后迅速冰上放置，保持单链状态。

步骤（3）中，所述5’腺苷化标记为通过酶修饰DNA的5’末端。所述酶为常用的DNA腺苷化酶，如，Mth RNA Ligase，T4 DNA Ligase等。所述DNA腺苷化酶在ATP存在的基础上对DNA的5’端进行腺苷化修饰。本发明的实施例中用含有Mth RNA Ligase和ATP的试剂盒进行反应。

步骤（4）中，所述腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶，包括但不限于T5核酸外切酶，RecJ核酸外切酶等任何腺苷化敏感的外切酶。

作为优选，步骤（1）（3）（5）还包括对反应后样品的纯化处理。

上述方法可用于检测DNA分子修饰和损伤。

一种采用上述方法检测DNA分子损伤和修饰位点的方法，包括以下步骤：

（i）提取DNA分子、破碎、去磷酸化，获得样品；

（ii）按照上述方法获得目标DNA分子；

（iii）对目标DNA分子进行测序并分析比对，即可获得损伤或修饰位点。

步骤（i）中，所述破碎的步骤为超声破碎；所述破碎的大小优选为200-500bp。

步骤（iii）中，所述测序选自但不限于Sanger测序、Illumina测序；对含有单个位点的样本进行Sanger测序，对含有多个位点的样本进行Illumina测序。优选地，步骤（iii）采用Illumina测序时还包括以下步骤：将去目标DNA分子转化为双链DNA后，再经PCR扩增，产物用于Illumina测序。

本发明的原理如下：

首先将DNA样品热变性后对目标DNA分子进行5’末端磷酸化处理；利用腺苷转移酶对磷酸化的DNA 5’端进行腺苷化可逆修饰，从而保护目标DNA分子；之后通过腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶将样品中未被保护的DNA消化，5’末端腺苷化修饰的DNA可以抵抗核酸酶水解而得以保留，对模板消化后的5’末端腺苷化修饰DNA进行纯化，消除背景影响；然后通过去腺苷化酶消除5’末端腺苷化修饰，使样品恢复5’末端磷酸化修饰，从而实现了目标DNA分子的可逆保护和分离；通过对去除5’端腺苷化修饰的DNA进行测序，测序所得序列的5’端即为原保护位点，即DNA的断裂位点。

本发明具有以下优点：

本发明提供的用于捕获和分离目标DNA片段的方法，利用DNA 5’末端的可逆保护，实现对不同长度和不同来源的目标DNA进行定量和定位分析，使用简便，易于操作，而且对样品无特殊要求，准确率高；检测背景影响低、分辨率高，可广泛应用于分子诊断、化疗药物安全评估、癌症发生及预防、分子生物学研究、基因治疗等诸多领域。

附图说明

图1是DNA可逆保护和分离的流程示意图；

图2是短链DNA样品腺苷化修饰结果图；

图3是腺苷化DNA抗水解结果图；

图4 是腺苷化DNA去腺苷化结果图；

图5是精确定位短链DNA损伤位点检测结果图；

图6是精确定位基因组DNA损伤位点检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 DNA腺苷化修饰及其抗核酸酶活性分析

通过DNA合成公司（IDT, 美国）合成含5’磷酸化修饰的20 nt的DNA单链片段，序列为：/5’Phos/-NNCAC TCG GGC ACC AAG GAC-3’以及不含磷酸修饰的同序列DNA。

将含有磷酸化修饰和不含修饰的DNA短片段等比例混合作为DNA底物。在20 μL反应体系中包含100 pmol Mth RNA Ligase（NEB, 美国），2 μL 1 mM ATP（NEB, 美国），2 μLDNA Adenylation Buffer（NEB, 美国），2 μg DNA底物，用水补足20 μL。65℃反应1.5 h后，85℃灭活5 min。

反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图2所示：反应前，磷酸化修饰的DNA和不含修饰的DNA在Bioanalyzer电泳时无法分离，形成一个峰（对应一条条带）；反应后，含有磷酸化修饰的DNA被腺苷化修饰，并且Bioanalyzer电泳分析时电泳速度变慢，可以和不含腺苷化修饰的DNA分离。

对含有5’腺苷化修饰以及不含修饰的DNA分别进行RecJ和T5外切酶解分析。在20μL反应体系中，含有1 μg的DNA底物中，10单位的核酸外切酶T5（NEB）或30单位的核酸外切酶RecJ_f （NEB），37℃反应1.5h，65℃灭活20min。反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图3所示：含有腺苷化修饰的DNA可以抵抗RecJ和T5核酸外切酶的水解，而不含腺苷化修饰的DNA可以被RecJ核酸外切酶或者T5核酸外切酶水解。

腺苷化修饰的可逆去除。用Deadenylation Kit （NEB）恢复腺苷化的DNA（5’AppDNA）至初始状态（5’磷酸化修饰DNA），20 μL反应体系含有：50单位的去腺苷化酶5’-Deadenylase（NEB, 美国），2 μL 缓冲液（NEB Buffer1），50 ng腺苷化修饰的短链DNA底物，50 ng不含修饰的短链DNA底物，用水补足20 μL。30℃反应1h，70℃反应20 min灭活。反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后，利用Bioanalyzer（Agilent）Small RNA Chip分析。结果如图4所示：反应前，与磷酸化修饰的DNA等比例混合的腺苷化修饰DNA，在反应后，全部脱腺苷化成为磷酸化修饰DNA，从而实现了DNA腺苷化的可逆反应。

实施例2 腺苷化可逆保护及分离技术在鉴定DNA损伤位点中的应用

1. AP位点

（1）通过DNA合成公司（IDT公司, 美国）合成含有100 bp的DNA双链片段，正义链序列为：

ACTGGGGCCAGATGUGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG，下划线为DNA损伤（Uracil）位点；

（2）酶切DNA损伤位点：50 μL反应体系中含有：10单位的Uracil修复酶UDG和内切酶IV（NEB, 美国），5 μL缓冲液（NEB Cutsmart Buffer)，1 μg DNA底物，用水补足50 μL；37℃反应1 h后，75℃灭活20 min；

（3）DNA变性：将DNA样品置于PCR仪中，95℃热变性3min后迅速将样品放置于冰上；

（4）断点可逆标记：20μL×2体系中包含100 pmol Mth RNA Ligase（NEB,美国），2 μL 1mM ATP（NEB, 美国），2μL DNA Adenylation Buffer（NEB, 美国），2 μg 5’磷酸化DNA底物，用水补足20 μL；65℃反应1.5 h后，85℃灭活5 min；

（5）纯化标记DNA片段：利用Zymo DNA纯化试剂盒，向反应产物中加入100 μL结合液，400 μL无水乙醇，充分混合后过柱，750 μLwash buffer冲洗一次后，用20 μL洗脱液洗脱；

（6）模板消除：向纯化液中加入10单位的核酸外切酶T5 (NEB)或30单位的核酸外切酶RecJ_f (NEB)，37℃反应1.5 h，65℃灭活20 min；反应产物即为分离得到的腺苷化修饰的DNA，利用DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit （QIAGEN）纯化后用于第7步反应。

（7）断点标记去除：利用Deadenylation Kit (NEB)恢复腺苷化的DNA （5’App-DNA）至初始状态（5’p-DNA），20 μL反应体系含有：50单位的去腺苷化酶5’-Deadenylase（NEB,美国），2 μL 缓冲液（NEB Buffer1），步骤6中获得的短链DNA底物，用水补足20 μL；30℃反应1 h，70℃反应20 min灭活；

（8）步骤（7）所得产物送测序公司进行Sanger测序（Genewiz)。结果如图5所示，测序所得的5’端即为原损伤位点。

2. 大肠杆菌氧化损伤位点检测

（1）在10mL LB培养液中37℃培养大肠杆菌DH10B菌株至O.D₆₀₀=0.5,将培养液置于冰上20 min后，加入0.2 mM的过氧化氢处理30 min。收集处理后的1 mL菌体，用OMEGABacterial DNA Kit (OMEGA公司，美国）提取基因组DNA，方法按照产品说明进行；

（2）取5 μg提取的基因组DNA，补充超纯水至100 μL，利用超声破碎仪将DNA片段化为500 bp左右的片段；

（3）取26 μL的步骤（2）所得DNA进行去磷酸化处理：加入3 μL Cutsmart Buffer （NEB）以及1 μL Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP，NEB)，37℃反应30 min后，70℃灭活10min；

（4）酶切DNA损伤位点：50 μL反应体系中含有：10单位的Uracil修复酶UDG 和内切酶IV（NEB, 美国），5 μL缓冲液（NEB Cutsmart Buffer)，1 μg DNA底物，用水补足50 μL。37℃反应1 h后，75℃灭活20 min；反应产物经DyeEx DNA纯化试剂盒2.0 spin kit（QIAGEN）纯化；

（5）DNA变性：步骤（4）所得DNA样品置于PCR仪中，95℃热变性3 min后迅速将样品放置于冰上；

（6）断点可逆标记：使用5’ DNA腺苷化试剂盒（NEB，美国）对5’磷酸化修饰的末端转化为腺苷化修饰。反应体系：Mth RNA Ligase 2 μL，1mM ATP 2 μL，DNA Adenylation Buffer2 μL，步骤（5）所得的DNA底物，用水补足20 μL；65℃反应1.5h后，85℃灭活5min；

（7）模板消除：向纯化液中加入10单位的核酸外切酶T5 (NEB，美国)或30单位的核酸外切酶RecJ_f (NEB，美国)，37℃反应1.5 h，65℃灭活20 min；对照：未腺苷化的DNA以相同体系进行消化；

（8）纯化标记DNA片段：利用Zymo DNA纯化试剂盒，向反应产物中加入100 μL结合液，400 μL无水乙醇，充分混合后过柱，750 μL wash buffer冲洗一次后，用10 μL洗脱液洗脱；

（9）断点标记去除：利用Deadenylation Kit (NEB，美国)去腺苷化。反应体系：50单位的去腺苷化酶（NEB，美国），2 μL缓冲液（NEB Buffer1），步骤6所得的DNA底物，用水补足20μL。30℃反应1 h，70℃灭活20 min。反应产物按照步骤8进行纯化；

（10）构建Illumina文库：步骤9中洗脱所得DNA，利用Clontech SMART ChIP-seq试剂盒构建DNA文库，按照试剂盒说明书进行：加入1 mM接头DNA和MML病毒逆转录酶，50℃反应2h，70℃ 10 min终止反应；然后PCR扩增，95℃变性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸30 s；15个循环，产物送测序公司进行Illumina测序；

（11）Illumina测序数据分析：将测序所得的数据，对大肠杆菌基因组进行匹配，reads集中区的5’端如图6所示，即为DNA损伤位点。

序列表

<110> 曲阜师范大学

<120> 一种DNA可逆保护和分离的方法

<130> 20200603

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligo DNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

nncactcggg caccaaggac 20

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> damaged DNA

<400> 2

actggggcca gatgugtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 60

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 100