具体实施方式

以下描述仅旨在举例说明本发明的多个实施方案。因此，本文中讨论的一些具体实施方案不应被解释为限制本发明的范围。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可进行多种改变或等同方案。

本公开内容的多个方面涉及抗体、其抗原结合部分及其药物组合物，以及用于制备这样的抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本文中提供了特异性结合黄热病病毒(YFV)和/或中和该病毒的抗体和/或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与黄热病病毒的E-DII表位结合，并阻止该病毒感染细胞。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与包含黄热病病毒E蛋白的第106位天冬酰胺、第93位赖氨酸和/或第104位赖氨酸的E-DII表位结合。在一些实施方案中，如本文中提供的抗体和抗原结合部分用于在对象中治疗或预防黄热病病毒感染。

如本文中使用的，抗体(可以以复数形式互换使用)广义上是指免疫球蛋白(Ig)分子或其任何功能性突变体、变体或衍生物。期望其功能性突变体、变体及衍生物以及抗原结合部分保留Ig分子的基本表位结合特征。

抗体能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点与靶标特异性结合。通常来说，完整的或全长抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链包含重链可变区(V_H)和第一、第二和第三恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)。每条轻链包含轻链可变区(V_L)和恒定区(CL)。VH和VL区还可细分为被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)的高变区，其间散布着被称为框架区(framework region，FR)的更保守的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。全长抗体可以是任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且不需要该抗体是任何特定类别。根据其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种还可分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。

术语“抗原结合部分”是指可与靶标特异性结合的完整或全长抗体分子的一部分或区域。优选地，本文中提供的抗原结合部分保留了与YFV特异性结合的能力。抗原结合部分可包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或二者。每个VH和VL通常包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

抗原结合部分的一些实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH链的单价片段；(2)F(ab’)2片段，其可以是具有两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段，即Fab的二聚体；(3)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是通过肽接头由VH结构域和VL结构域构成的单条多肽链；(5)(scFv)2，其可包含通过肽接头连接的两个VH结构域和通过二硫桥与两个VH结构域缔合的两个VL结构域；(6)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(7)dAb片段，其包含单个可变结构域；以及(8)分离的互补决定区(CDR)。

此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH可由不同的基因编码，但其可使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白链的合成接头连接，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也旨在包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体，例如双特异抗体。双特异抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而无法使同一条链上的两个结构域之间进行配对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并且形成两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。双特异抗体也包含在术语“抗原结合部分”内。

术语“人抗体”是指具有基本上对应于或来源于从人对象获得的抗体的可变区和恒定区的抗体，例如，由人种系免疫球蛋白序列或其变体编码的抗体。本文中所述的人抗体可包含一个或更多个不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。这样的突变可存在于一个或更多个CDR，特别是CDR3中，或者存在于一个或更多个框架区中。在一些实施方案中，人抗体可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基取代的位置。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被嫁接至人框架序列上的抗体。

如本文中使用的，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.，andHighsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.，and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.，and Chames P.(2000)ImmunologyToday 21：371-378)、从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor，L.D.，et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.，andGreen L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.et al(2000)Immunology Today 21：364-370)或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有如上所定义的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当在体内体细胞诱变时使用人Ig序列转基因的动物)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以是这样的序列，尽管来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但可能并不天然存在于体内人抗体种系储库内。

本公开内容的一些实施方案提供了能够结合黄热病病毒的E-DII表位的完全人抗体。在一些实施方案中，E-DII表位包含黄热病病毒E蛋白的第106位天冬酰胺、第93位赖氨酸和第104位赖氨酸。

表1和表2中分别示出了多个VH和VL区的蛋白质序列。

表1.可变重链的蛋白质序列

表2.可变轻链的蛋白质序列

“分离的”物质意指其已通过人工从自然状态改变。如果自然界中存在“分离的”物质，则其已被改变或从其原始环境中移除，或二者。例如，天然存在于活体对象中的多肽不是“分离的”，但是如果多肽已从其天然状态的共存材料基本上分离和/或以基本上纯的状态存在，则该多肽是分离的。

术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体或其抗原结合部分与抗原表位的结合。与靶标或表位“特异性结合”的抗体或其抗原结合部分是本领域中公知的术语，并且确定这样的特异性结合的方法也是本领域中公知的。如果分子与特定靶抗原或表位的反应或缔合比其具有替代靶位/表位的反应或缔合更频繁、更快速、具有更长的持续时间和/或具有更大的亲和力，则称为该分子显示出“特异性结合”。如果抗体或其抗原结合部分以比其与其他物质结合更大的亲和力、亲合力(aVidity)、更容易和/或更长的持续时间结合，则抗体或其抗原结合部分与靶抗原“特异性结合”。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，将其称为特异性结合抗原。

“表位”是被抗体结合的抗原的区域。该术语包含能够与免疫球蛋白特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。

如本文中使用的，术语“中和”是指靶蛋白(例如，黄热病病毒E蛋白)的活性，例如生物学活性的中和。在一个实施方案中，中和抗体与黄热病病毒E蛋白的E-DII表位结合并导致抑制黄热病病毒的生物学活性和/或防止病毒感染细胞。

对象可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作针对人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗等。

术语“治疗”是指其中出于改善对象的病症的目的，对对象(包括人)进行直接或间接地医疗援助的行为、应用或治疗。特别地，在一些实施方案中，该术语是指降低发病率、或减轻一种或更多种症状、消除复发、预防复发、预防发病率、改善一种或更多种症状和/或改善预后，或其组合。技术人员将理解，治疗不一定导致症状的完全不存在或去除。例如，对于黄热病病毒，“治疗”可以是指降低由黄热病引起的急性病毒性出血疾病的严重程度或持续时间。

如本文中使用的，与药剂的施用有关的“有效量”或“有效剂量”或“治疗有效量”是指与未接受这样的量的相应对象相比，导致预期的药理学结果，或治疗、治愈、预防或改善疾病或疾病症状、障碍或副作用的作用，或者降低疾病或障碍或其任何症状的发展速度的药物或药剂(例如，抗体或其抗原结合片段或部分或者包含其的组合物)的量。药剂的有效量或有效剂量可根据所使用的特定活性成分、施用方式和/或待治疗对象的年龄、身材大小和病症而变化。

本公开内容还提供了包含与黄热病病毒E蛋白的E-DII表位特异性结合的抗体或其抗原结合部分的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，E-DII表位包含黄热病病毒E蛋白的第106位天冬酰胺、第93位赖氨酸和第104位赖氨酸。组合物可由本文中所述的任一种抗体或抗原结合部分制备。可将本文中所述的抗体或其抗原结合部分以及编码核酸或核酸集、包含这些的载体或包含该载体的宿主细胞与可药用载体(赋形剂)混合，例如形成用于治疗目标疾病的药物组合物。可药用赋形剂(载体)，包括缓冲剂是本领域中公知的。参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins，Ed.K.E.Hoover。

药物组合物可包含以冻干制剂或水溶液形式的可药用载体、赋形剂或稳定剂。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins，Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM(聚山梨酯)、PLURONICS^TM(泊洛沙姆)或聚乙二醇(PEG)。

结合本公开内容的组合物使用的短语“可药用”是指这样的组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的并且当施用于对象时通常不产生不良反应。优选地，如本文中使用的，术语“可药用”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于哺乳动物，并且更特别地用于人。“可接受的”意指载体与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)相容，并且不会负面影响施用组合物的对象。在本发明方法中使用的任何药物组合物可包含以冻干制剂或水溶液形式的可药用载体、赋形剂或稳定剂。

可药用载体(包括缓冲剂)在本领域中是公知的，并且可包含磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水性聚合物；单糖；二糖；以及其他碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见，例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy 20^th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins，Ed.K.E.Hoover。

药物组合物可以以单位剂量形式存在并且可通过任何合适的方法制备，其中许多是公知的。这样的方法可包括使抗YFV抗体与构成一种或更多种辅助成分的载体缔合的步骤。

本文中提供的组合物可以是无菌水性制剂，其优选在一些实施方案中与接受者的血液等渗。该水性制剂可根据已知方法使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂配制。无菌水性制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注可射溶液或混悬液。可使用的可接受的载剂和溶剂是水、林格液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。

如本文中使用的，术语“载体”旨在是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指其中可连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。此外，载体可以是能够指导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”或“表达载体”。

如本文中使用的，术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”旨在是指其中已引入外源DNA的细胞。应理解，这样的术语不仅旨在是指特定的对象细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能发生在随后的后代中，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。

实施例

使用YFV包膜蛋白表位的结构指导分析，集中于包膜结构域II融合环设计了抗YFV单克隆抗体。确定了黄热病病毒表面上的突变性限制的表位。然后确定了满足表位-互补位限制的合适抗体支架，并对靶向和中和该病毒的抗体进行改造。

使用已知方法克隆、表达和纯化抗YFV抗体，并筛选表达和生物物理特性。将计算机(in silico)设计的抗体克隆到哺乳动物表达载体中并进行纯化以用于进一步分析。评价表达以及指示纯度和稳定性的多种分析参数二者。使用体外和体内感染模型评价针对黄热病病毒的抗体的效力。

使用蚀斑减少中和测试(plaque reduction neutralization test，PRNT)，针对黄热病病毒的YF17D-204疫苗菌株评估了经改造抗体的体外中和效力。对于所选择的抗体，使用YFV感染的鼠模型进行效力的另外的评价。抗YF mAb的合理设计

有前景的抗YFV单克隆抗体必须中和广泛的菌株并靶向与强效保护相关的区域。表位在治疗性抗体的效力方面发挥关键作用。在YFV感染中，包膜(E)蛋白是中和抗体的主要靶标。为了定义有前景的表位，对整个YFV组装体进行结构指导分析以确定空间聚集的、溶剂可及的和序列保守的残基。这是通过将序列保守性得分(根据YFV包膜蛋白序列的比对计算)映射到整个YFV E蛋白组装体的同源性模型上来完成的。认为序列保守性大于70％和溶剂可及表面积＞40％的残基是假定的表位残基。根据该分析，结构域II(E-DII)疏水性融合环附近的区域在YFV菌株中表现出高度的可及性和保守性。

为了改造针对E-DII表位的抗体，对识别高度同源表位表面的Fv支架进行结构指导检索。将有前景的支架对接至表位(使用软件ZRANK)，并基于形状互补性(＞0.6)、掩埋的表面积(1,000Sq.A°)和与关键E-DII表位残基(E蛋白的N106、K93和K104；编号对应于17DYF疫苗株的一级序列)接触的潜力进行排序。然后，通过Rosetta抗体设计重新设计排名靠前的支架的CDR环，使其与表位进行最佳接触。针对YFV的体外中和筛选经改造的抗体。

将表1和2中提供的编码VH和VL结构域的合成DNA序列在框内与IgG1恒定区一起克隆到哺乳动物表达载体中，并将重链和轻链的多种组合组合成至少110个YFV抗体。这样的组合的实例在下表3中示出。

表3.YF抗体组合

表达水平和生物物理特性的说明性实例

从Expi293细胞的大规模转染中纯化YFV抗体的子集。使用HiTrap蛋白A柱从细胞培养物上清液中纯化蛋白质。透析之后，使用理论消光系数通过nanodrop估算蛋白质浓度。表4中总结了多种抗体的产率。

表4.在Expi293细胞中表达的YF mAb的产率

另外，分别通过(1)UV光谱法、(2)尺寸排阻色谱法、(3)微流控毛细管电泳和(4)热移染料解离测定来确定多种抗体的纯度和稳定性。下表5中总结了这种分析性生物物理参数的说明性实例。

表5.选择的YF抗体的纯度和稳定性

通过普鲁卡因酰胺标记辅助的LC-FLD-MS测定了多种抗体的糖型的另一些特征。观察到的糖基化谱的说明性实例如下(表6)。

表6.糖基化谱

经改造的抗体针对YF-17D的中和效力的说明性实例

进行蚀斑减少中和试验(PRNT)以确定YFV抗体针对YFV(17D-204)的中和效力。将Vero细胞用以下病毒进行感染：单独的病毒、没有病毒、或者与多种稀释的YFV抗体预孵育的病毒。将板孵育7天，固定并用结晶紫染色以可视化蚀斑形成。使用Prism软件生成中和曲线(图1)，并使用可变斜率通过非线性回归计算50％有效浓度(EC50)值(表6)。抗体的中和效力与蚀斑减少成正比，并将效力描述为在50％的病毒颗粒被中和时的浓度。该抗体在中和病毒方面高度强效并且说明性实例在下表7中示出。

表7.YF mAb的EC50值的总结

体内效力的说明性实例

图1提供了在小鼠感染模型中经改造的抗体针对YF-17D-204的体内效力的说明性实例。在AG129小鼠的黄热病感染致死模型中测试了所设计抗体的效力。如图1中所示，以预防或作为治疗测试抗体的保护效力。

图2中所示的说明性实例，与对照组相比，抗体的施用导致完全的保护(图2A)。在感染之后第4天和第6天，抗体的施用还导致病毒血症的降低大于2Log₁₀(图2B)。