一种浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法 (Iris virus inactivated vaccine for micropterus salmoides for immersion bath and preparation method thereof ) 是由 姚伦广 王阿辉 何健 邱礽 秦英惠 胡小敏 刘阳坤 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明对于分离得到的大口黑鲈虹彩病毒病毒液进行培养和灭活,而后与功能化单壁碳纳米管、壳聚糖佐剂混合制备得到浸浴用灭活疫苗,经试验表明,所述浸浴用疫苗能够刺激大口黑鲈产生较高滴度的中和抗体,在浸浴后第14天达到最高的抗体滴度1:240,而通过对大口黑鲈鱼苗进行浸浴免疫,而后进行采用病毒液进行浸浴攻毒,研究表明,本发明的灭活疫苗对于动物的保护率高达87%。(The iridovirus virus liquid of the micropterus salmoides obtained by separation is cultured and inactivated, and then the iridovirus virus liquid is mixed with the functionalized single-walled carbon nanotube and the chitosan adjuvant to prepare the bath-soaking inactivated vaccine, tests show that the bath-soaking vaccine can stimulate the micropterus salmoides to generate a neutralizing antibody with higher titer, the highest antibody titer is 1:240 in 14 days after bath soaking, bath soaking immunization is carried out on micropterus salmoides fry, and then bath soaking challenge is carried out by adopting the virus liquid, and researches show that the protective rate of the animal by the bath-soaking inactivated vaccine is up to 87%.)
技术领域
：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
：大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈、黑鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、肉质鲜美、价格高和容易捕捞等众多优点而深受渔民的喜爱。20世纪70年代，大口黑鲈首次引入中国台湾，繁殖了十几代后，于 1983年引入中国广东省，在深圳、佛山、惠州一带进行人工养殖，佛山顺德地区是大口黑鲈的主要养殖区。因为大口黑鲈大口黑鲈的养殖在国内具有较好的经济效益，在近十几年内已迅速发展成为我国主要的经济养殖鱼种，并被认定为名优品种之一，具有重要的经济价值。日渐增长的市场需求使得大口黑鲈的养殖规模逐渐变大，养殖密度也升高，与此同时，大口黑鲈在养殖过程中出现的病害概率也会增多，其中虹彩病毒病是大口黑鲈养殖中常见的病毒性疾病。
大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），该病毒最早于1991年在美国佛罗里达州被发现，大口黑鲈感染该病毒后，通常症状不明显，或体表有出血、眼球突出。2008年至2010年初，中国广东省佛山市顺德地区大口黑鲈养殖鱼塘大面积暴发疾病，造成重大经济损失。对濒死鱼剖检发现鱼鳔肿大，布满红色气腺。鱼鳔、肾脏研磨除菌后，接种鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）分离到致病性大口黑鲈虹彩病毒。一般认为健康鱼感染大口黑鲈虹彩病毒主要是通过在水体里接触病原或者食入带病鱼饵，人工感染实验和孵化场还未发现垂直传播的病例。大口黑鲈虹彩病毒不仅可以导致大面积鱼暴发疾病死亡引起鱼灾，也可以是不表现任何症状的隐性带毒，这给疾病诊断带来困难。
由于大口黑鲈虹彩病毒在发病机理、流行病学方面的研究并不深入，再加上野生鱼类带毒情况的普遍性，目前对大口黑鲈虹彩病毒还没有采取有效的防控措施，且鉴于大口黑鲈虹彩病毒感染可以不显现任何症状，并且野生鱼带毒情况较为普遍，从传播途径尽可能切除感染机会也很有必要，因此，疫苗的研发和应用也就成了未来大口黑鲈虹彩病毒病防控的重要方向之一。专利申请CN202011348356.6公开了将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物添加至工厂化循环水养殖(RAS)系统中，柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物协同作用，抑制虹彩病毒的增殖，解决RAS养殖系统中虹彩病毒引起鱼类患病致死的技术问题；专利申请CN202010052797.5制备得到了一种大口黑鲈虹彩病毒病灭活疫苗；易婉盈等以表达LMBV外衣壳蛋白（MCP）的重组表达质粒pCDNA3.1（+）-MCP为材料，构建对LMBV有免疫作用的DNA疫苗，通过胸鳍基部注射的方法免疫大口黑鲈,在攻毒实验中DNA疫苗组的免疫保护率达62.5%，对大口黑鲈虹彩病毒的攻击起到了良好的保护作用。
目前国内对鱼苗免疫接种的方式主要有注射、浸浴和口服3种，其中注射免疫最好，保护率高达40～80%，其产业化的主要瓶颈一是只适应大规格鱼种，二是注射免疫方法不能满足大规模渔业生产，接种过程中易引起鱼体受伤，费时费力和不易操作，且在鱼苗阶段更难操作，受到较大的限制；口服免疫虽然是一种方便的途径，它不会受到时间、地点和水产动物的大小制约，也可减少劳动强度，但通常疫苗混合在一般饵料易损失，进入鱼体后疫苗的抗原性易受消化液破坏，疫苗用量大和免疫效果差，在应用上受到了限制；而浸浴免疫操作简单、成本低且适用于大规模的苗种免疫而受到格外关注，但由于生物的细胞屏障阻隔药物进入等原因导致免疫效果一般也限制它的应用。
目前在虹彩病毒的防治方面没有特效药物，我国也无商品化的虹彩病毒疫苗，因此，分离合适的疫苗毒株并开展相关的研究，推进疫苗的产业化生产以及开发方便使用的疫苗对于大口黑鲈的养殖产业具有积极的意义，也是目前亟需解决的产业问题。
发明内容
：为解决现有大口黑鲈虹彩病毒防控困难的问题，本发明旨在提供一种浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法，基于发明人分离得到的一株新的大口黑鲈虹彩病毒，将其灭活后得到灭活抗原，并将灭活抗原与碳纳米管进行组合，进一步添加壳聚糖作为佐剂，增强了灭活抗原的免疫保护能力，能够刺激大口黑鲈产生较高滴度的中和抗体，同时通过鱼苗免疫-攻毒试验表明，其对于鱼苗的保护率达到87%。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，其特征在于，所述注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗中包括灭活的大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907以及佐剂，所述大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心，所述佐剂为功能化碳纳米管和壳聚糖。
优选的，所述灭活疫苗中包含5×1010TCID50/ml的灭活大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907。
本发明还请求保护所述的浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
步骤一，EPC细胞的培养；
步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的增殖；
步骤三，病毒的收获；
步骤四，病毒滴度的测定；
步骤五，灭活处理；
步骤六，浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备：将灭活抗原与功能化单壁碳纳米管、壳聚糖混合制备得到所述浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗。
优选的，所述的浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一，EPC细胞的培养：将EPC细胞于含10％（V/V）胎牛血清的M199培养基中进行传代培养，25℃，5%CO2恒温培养至细胞汇合，长成单层，细胞数量>106/mL；
步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的增殖：吸出EPC细胞中的培养液，然后按1/10的培养基体积加入N-LBIV-201907的病毒悬（105TCID50/mL），在病毒吸附细胞1h后，补加含2％(V/V) 小牛血清的M199（pH7.2～7.5）维持液进行病毒增殖；
步骤三，病毒的收获：病毒连续培养4～7天，在显微镜下观察，待80% EPC细胞出现典型细胞病变效应时，置于-80℃冰箱冻存，冻结后取出置于37℃水浴加热溶解，如此反复冻融两次，将病毒感染的细胞悬液装入50ml无菌离心管里，在 4℃以 4400 g 离心 20min，去除细胞碎片，收集离心后上清液，即获得扩增病毒原液，-80℃保存备用，用于后续滴度实验以及灭活疫苗制备；
步骤四，病毒滴度的测定：将大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907疫苗毒株进行传代扩增，收集病变细胞和病毒裂解液后，进行TCID50测定，经测定，病毒接种细胞后第5天的TCID50可达到1010.55/ml以上，得到高滴度的病毒液；
步骤五，灭活处理：取保存于-80℃的高滴度的病毒液于室温融化，加入福尔马林溶液使其终浓度为0.2％ (V/V)，混合均匀后置于37℃条件下灭活48-72h，灭活结束后，添加终浓度为0.05％的亚硫酸钠中和残余福尔马林，即获得大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907灭活疫苗原液，并置于4℃冰箱保存备用；
步骤六，浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备：将灭活抗原与功能化单壁碳纳米管、壳聚糖混合制备得到所述浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗。
所述功能化单壁碳纳米管采用如下方法制备得到，包括如下步骤：
（1）将2.0g单壁碳纳米管样品放混酸（150mL浓H2SO4和50mL浓HNO3）中，60℃条件下置于磁力搅拌器100rpm搅拌24h；
（2）用循环水式真空泵进对获得的碳纳米管混酸的混合物行抽滤，用纯水洗至液体的pH=7.4，然后置于60℃条件下烘干，所得产物即为功能化单壁碳纳米管。
所述浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备的具体步骤如下：
（1）将功能化单壁碳纳米管中加入去离子水，具体比例为1mg氧化单壁碳纳米管对应10ml去离子水，在冰水浴条件下超声1h，得到功能化单壁碳纳米管溶液；
（2）将壳聚糖溶解于1%的醋酸溶液中，制备得到浓度为1%（W/V）的壳聚糖溶液；
（3）将制备得到的效价为1011TCID50/ml的抗原溶液与配置的功能化单壁碳纳米管溶液、壳聚糖溶液按照5:3:2的体积比例混合，冰浴超声处理2h后，8000rpm速度离心6min，取上层分散液，即为浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗；为了方便使用，可以进一步冻干，保存备用，待使用时稀释至效价为5×1010TCID50/ml即可用作浸浴用鱼苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
首先，本发明通过在南阳地区爆发大口黑鲈虹彩病毒感染的养殖场分离得到一株高致死率的虹彩病毒毒株，对其进行分离和鉴定得到虹彩病毒毒株，属于河南南阳地区首次分离得到该类虹彩病毒，经分析发现，该毒株与其他报道的毒株具有较高的同源性，但MCP的核酸序列也存在差异，该毒株的发现填补了南阳地区该毒株分离的空白，丰富了大口黑鲈虹彩病毒的研究。
其次，本发明对于分离得到的大口黑鲈虹彩病毒病毒液进行培养和灭活，而后与功能化单壁碳纳米管、壳聚糖佐剂混合制备得到浸浴用灭活疫苗，经试验表明，所述浸浴用疫苗能够刺激大口黑鲈产生较高滴度的中和抗体，在浸浴后第14天达到最高的抗体滴度，解决1:240，而通过对大口黑鲈鱼苗进行浸浴免疫，而后进行采用病毒液进行浸浴攻毒，研究表明，本发明的灭活疫苗对于动物的保护率高达87%。
第三，本发明采用浸浴的方式进行免疫，其弥补了现有的注射接种手段的多种不便利，且浸浴成本低，对鱼体产生的应激反应极小，几乎不会对鱼体产生不利影响，而且鱼类本身就拥有很大的粘膜表面（皮肤、鳃、肠道和鼻腔粘膜等），所以说浸浴免疫通过粘膜途径来接种疫苗更实用、更经济。本发明采用功能化单壁碳纳米管、壳聚糖佐剂，能够有效地提高疫苗的免疫效力。
附图说明
：图1 病毒分离时的细胞病变情况：A，正常的EPC细胞；B，感染病毒后病变的EPC细胞。
图2 分子鉴定结果：M，DL5000；1，分离的病毒液；2，阴性对照。
图3 动物回归试验结果，病死鱼表现出明显的体表溃疡症状。
图4部分病死实验鱼进行病毒检测结果，M，DL5000；1，第10代病毒液；2，阴性对照；3-6为病死实验鱼病毒检测结果。
图5 浸浴接种后的中和抗体滴度测定结果。
具体实施方式
：
实施例1. 大口黑鲈虹彩病毒的分离与鉴定
1. 大口黑鲈虹彩病毒感染样品的采集
2019年6-7月，河南省南阳市某养殖场爆发大规模的大口黑鲈病症，主要症状为病鱼体色发黑、无活力、腹部轻度膨大，死亡率高达70%，濒死鱼剖检后，表现为急性腹膜炎症状，肝脏、胃、肠道和脾脏表层部分出现坏死和炎性病变，但是深层部分表现正常，鱼鳔与腹腔接触表面有纤维蛋白渗出物，胃肠道的黏膜上皮层有局部坏死病灶，符合大口黑鲈虹彩病毒感染的相关病症指征。于该养殖场采集了20尾体表出现溃疡症状的大口黑鲈，采集的样本分别使用封口袋单独保存，-80℃冻存备用。
2. 大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的分离
将采集的大口黑鲈染病样品进行解剖后，无菌条件下取肝脏、脾脏、肾脏等样品，以质量体积比1:8加入无菌生理盐水，冰浴条件下研磨匀浆，将匀浆液分为两份，其中一份在BHI平板、血平板和RS培养基平板上进行划线，28℃培养24h分离细菌，经分离均未分离得到细菌，其表明大口黑鲈相关症状的出现并非细菌感染。
另一份转移至50mL离心管中，反复冻融3次后（-80℃和室温交替冻融），8000g、4℃离心20min，取上清，经灭菌的0.22μm滤器过滤后，将滤液于-80℃下冻存备用。将鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC，由南阳师范学院提供）进行传代培养，至细胞汇合度为85-90%时，弃去培养基，试验组取200μL滤液与800μL M199培养基混匀，对照组采用200μL无菌PBS与800μL M199培养基混匀，分别接种于健康的EPC细胞，25℃吸附1h，期间每隔20min轻轻晃动培养瓶一遍均匀吸附，吸附完成后添加4mL含有2%胎牛血清的M199培养基，置于25℃ 5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每日于显微镜下观察细胞状态至发现实验组细胞单层80%出现细胞病变时收获培养物（图1），反复冻融3次后（-80℃和室温交替冻融），在 4℃以 4400 g 离心 20 min，去除细胞碎片，即得到病毒原液。将上述病毒原液按照上述步骤感染新的健康EPC细胞，重复至收获第10代病毒液。
大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的分子鉴定
采用许峰（《海洋与湖泊》，2020年1月，Vol .51，No.1，第156-162页）报道的方法对第10代病毒液进行分子鉴定，以第10代病毒液为样品进行DNA的提取，以此为模板，采用报道的引物进行PCR检测，扩增产物经1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收试剂盒回收纯化后与pGEM-T Easy载体16℃连接3h，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后，涂布与含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取3个菌落进行扩大培养，提取质粒，PCR鉴定后（见图2）均扩增得到长度为1029bp的序列，选取阳性克隆进行测序，经序列分析表明。其与许峰分离得到的LMBIV-NB001（MN176304.1）的同源性为98.83%，经BLAST比对，其与现有报道的大口黑鲈虹彩病毒均存在较高的同源性，表明本发明从大口黑鲈中分离得到的病毒为大口黑鲈虹彩病毒。
大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的动物回归试验
健康大口黑鲈30尾随机分成3组，每组10尾鱼，置于26-28℃水箱中养殖。其中第1和2组作为感染组，腹腔注射上述制备的第10代病毒液0.2mL/尾；第3组作为对照组，腹腔注射无菌生理盐水 0.2 mL/尾。注射后每日观察实验鱼的状况并做好记录，持续观察并记录发病和死亡情况，取病死实验鱼的脾、肾等组织，提取 DNA 检测病毒。
第3组的对照组在此试验期间全部健活，第1和2组的感染组注射病毒液7天后全部发病，且在接毒10天后即达到90%死亡，感染12天后全部死亡，且病死鱼表现出明显的体表溃疡症状（见图3）。对部分病死实验鱼进行病毒检测，均能扩增得到MCP基因的特异性条带（见图4），以上试验表明，本发明所分离得到的毒株为大口黑鲈虹彩病毒，且该毒株具有较强的致死性。
5. 大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907病毒滴度的测定
1）将 EPC细胞传入 96 孔板中，置 25℃培养箱中培养；
2）将大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907第10代病毒液从 10-1到 10-12作10倍系列稀释；
3）将稀释好的病毒悬液加入 96 孔板中，每孔加 100 µl，每个稀释度加 3 孔；
4）对照组中加培养基；
5）将 96 孔板置于 25℃培养箱中培养，直至不再有新的 CPE 产生；
6）甲醛固定后用结晶紫染色，按照 Reed & Muench（1938）的方法计算病毒的TCID50值。
经测定，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907第10代病毒液的滴度为1010.25TCID50/mL。
病毒的保藏
2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
实施例2. 大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907灭活抗原的制备
步骤一，EPC细胞的培养：将EPC细胞于含10％（V/V）胎牛血清的M199培养基中进行传代培养，25℃，5%CO2恒温培养至细胞汇合，长成单层，细胞数量>106/mL
步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的增殖：吸出EPC细胞中的培养液，然后按1/10的培养基体积加入N-LBIV-201907的病毒悬（105TCID50/mL），在病毒吸附细胞1h后，补加含2％(V/V) 小牛血清的M199（pH7.2～7.5）维持液进行病毒增殖，
步骤三，病毒的收获：病毒连续培养4～7天，在显微镜下观察，待80% EPC细胞出现典型细胞病变效应时，置于-80℃冰箱冻存，冻结后取出置于37℃水浴加热溶解，如此反复冻融两次，将病毒感染的细胞悬液装入50ml无菌离心管里，在4℃以 4400 g 离心 20 min，去除细胞碎片，收集离心后上清液，即获得扩增病毒原液，-80℃保存备用，用于后续滴度实验以及灭活疫苗制备；
步骤四，病毒滴度的测定：将大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907疫苗毒株进行传代扩增，收集病变细胞和病毒裂解液后，进行TCID50测定，经测定，病毒接种细胞后第5天的TCID50可达到1010.55/ml以上，得到高滴度的病毒液；
步骤五，灭活处理：取保存于-80℃的高滴度的病毒液于室温融化，加入福尔马林溶液使其终浓度为0.2％ (V/V)，混合均匀后置于37℃条件下灭活48-72h，灭活结束后，添加终浓度为0.05％的亚硫酸钠中和残余福尔马林，即获得大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907灭活疫苗原液，并置于4℃冰箱保存备用。
步骤六，灭活抗原的制备：
将灭活好的疫苗原液进行浓缩，至效价为1011TCID50/ml，得到大口黑鲈虹彩病毒灭活抗原。
实施例3：浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备
3.1单壁碳纳米管功能化修饰
（1）将2.0g单壁碳纳米管样品放混酸（150mL浓H2SO4和50mL浓HNO3）中，60℃条件下置于磁力搅拌器100rpm搅拌24h；
（2）用循环水式真空泵进对获得的碳纳米管混酸的混合物行抽滤，用纯水洗至液体的pH=7.4，然后置于60℃条件下烘干，所得产物即为功能化单壁碳纳米管。
浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备
（1）将功能化单壁碳纳米管中加入去离子水，具体比例为1mg氧化单壁碳纳米管对应10ml去离子水，在冰水浴条件下超声1h，得到功能化单壁碳纳米管溶液；
（2）将壳聚糖溶解于1%的醋酸溶液中，制备得到浓度为1%（W/V）的壳聚糖溶液；
（3）将制备得到的效价为1011TCID50/ml的抗原溶液与配置的功能化单壁碳纳米管溶液、壳聚糖溶液按照5:3:2的体积比例混合，冰浴超声处理2h后，8000rpm速度离心6min，取上层分散液，即为浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗；为了方便使用，可以进一步冻干，保存备用，待使用时稀释至效价为5×1010TCID50/ml即可用作浸浴用鱼苗。
实施例4：浸浴用鱼苗的鱼体安全性检验
取上述制备好的疫苗，将其与水按照1:1000的比例混合，制备得到浸浴用鱼苗工作液。取50-80g健康的大口黑鲈鱼苗200尾，随机分为浸浴组和阴性对照组，浸浴组采用浸浴用鱼苗工作液进行浸浴处理，对照组采用0.6%生理盐水进行浸浴，浸浴过程中持续通入氧气，浸浴处理24h后捞出，分别饲养15天，若疫苗组出现死亡或临床症状，而阴性对照组未出现临床症状或死亡，表明疫苗不安全；若疫苗组和阴性对照组均未见死亡，则表明疫苗安全。
结果表明，疫苗浸浴接种后15天全部健活，未出现临床症状，表明该浸浴用灭活疫苗对大口黑鲈的临床症状、存活情况及生长情况不产生任何不良影响，本发明的灭活疫苗具有较好的安全性。
实施例5. 浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的免疫效力评价
（一）鱼苗的相对保护率试验
1.大口黑鲈鱼苗活体免疫
试验大口黑鲈鱼苗来源于南阳某大口黑鲈养殖场，体重为10g±5g，该养殖场大口黑鲈无虹彩病毒感染的临床症状，且随机取10尾大口黑鲈鱼苗进行PCR检测，均无虹彩病毒感染。
试验用大口黑鲈鱼苗饲养在室内塑料水族箱中，持续供给充足的氧气，室内温度保持在 27℃，饲养期间每天定期排污和换水，每天投喂一次饲料。购买回来的大口黑鲈鱼苗先室内喂养两周以适应环境后，再进行免疫试验。
将1200尾左右的大口黑鲈鱼苗随机分成3组：疫苗组、灭活抗原组和生理盐水组，其中灭活疫苗组采用实施例3制备得到的浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗稀释（1:1000）后浸浴24h；灭活抗原组采用实施例2制备得到的灭活抗原采用0.6%生理盐水稀释至滴度为5×107TCID50/ml后，浸浴24h；生理盐水组采用0.6%生理盐水浸浴24h。浸浴处理后，捞出，进行后续试验。
免疫保护率的测定
在疫苗免疫鱼体后的第30 天分别从各组随机取100尾进行攻毒实验，第80d从各组剩下的大口黑鲈中随机取100尾进行攻毒实验，分别采用病毒浓度为 5×108TCID50/mL的大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907稀释液进行浸浴24h进行攻毒，浸浴24h。攻毒后的30内观察鱼体的死亡情况，计算攻毒后第30天的免疫保护率。结果如下表1所示。
表1免疫保护率的测定
基于表2的结果可知，采用本发明的疫苗进行浸浴接种后，其30天后的保护率达到68%，而接种80天后的保护率达到87%，而采用仅包含灭活病毒液的灭活抗原液进行浸浴后，其保护率不及本发明的疫苗。以上试验表明，本发明的疫苗具有很好的保护率，且相对注射疫苗方便使用。
（二）成鱼免疫保护试验
1. 大口黑鲈成鱼活体免疫
试验大口黑鲈来源于南阳某大口黑鲈养殖场，体重为500g±50g，该养殖场大口黑鲈无虹彩病毒感染的临床症状，且随机取10尾大口黑鲈进行PCR检测，均无虹彩病毒感染。
试验用大口黑鲈饲养在室内塑料水族箱中，持续供给充足的氧气，室内温度保持在 27℃，饲养期间每天定期排污和换水，每天投喂一次饲料。购买回来的大口黑鲈先室内喂养两周以适应环境后，再进行免疫试验。
将120尾左右的大口黑鲈随机分成4组：疫苗组、对照疫苗组、灭活抗原组和生理盐水组，每组30尾。其中灭活疫苗组采用实施例3制备得到的浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗稀释（1:1000）后浸浴24h；对照疫苗组采用实施例3制备得到的浸浴用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗稀释（1:1000）后浸浴24h；灭活抗原组采用实施例2制备得到的灭活抗原采用0.6%生理盐水稀释至滴度为5×107TCID50/ml后，浸浴24h；生理盐水组采用0.6%生理盐水浸浴24h。浸浴处理后，捞出，进行后续试验。
其中对照疫苗组所浸浴的对照疫苗采用如下方法制备得到：
（1）将功能化单壁碳纳米管中加入去离子水，具体比例为1mg氧化单壁碳纳米管对应10ml去离子水，在冰水浴条件下超声1h，得到功能化单壁碳纳米管溶液；（2）将制备得到的效价为1011TCID50/ml的灭活抗原溶液与配置的功能化单壁碳纳米管溶液以及0.6%生理盐水溶液按照5:3:2的体积比例混合，冰浴超声处理2h后，8000rpm速度离心6min，取上层分散液，即为对照疫苗。
血清中和抗体效价的测定
分别在免疫后的第 1、7、14、21、28 d 随机从各组中抽取5尾大口黑鲈，进行静脉抽血，加入抗凝剂后，4℃条件下3000×g 离心15min，取上层血清，-80℃保存，用于抗体中和效价的测定。
血清中和抗体效价的测定方法
1）将生长良好的EPC 细胞铺在96孔板中，接种密度为6×104/孔，放置在 26℃
培养箱中培养过夜；
2）从-80℃冰箱取出血清样品，冰上溶解后，在 56℃水浴锅中水浴 30 min；
3）采用无血清的M199培养基对血清进行从 1:5 倍比稀释至 1:640；
4）往不同稀释度的血清中加入等量体积的 100TCID50/0.1 mL 的大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907，置于 26℃培养箱中和 1 h，每隔 20 min 上下颠倒混匀；
5）用排枪吸走 96 孔板中的旧培养基，随后往每排中加入100μL /孔的上述梯度稀释混合液，26℃培养箱中孵育 1 h；
6）用排枪吸走混合液，随后往每孔中加入 100μL M199（含双抗及2% FBS）。设置阴性和阳性对照，26℃培养箱中继续培养；
7）培养72h后观察结果，以不产生 CPE的最高血清稀释度数为该血清的中和抗体滴度。
血清中和抗体效价的测定结果
在免疫后的1、7、14、21、28d分别对各组大口黑鲈进行血清中和抗体效价测定，结果如图5所示，大口黑鲈在浸浴免疫后，各剂量组均产生特异性抗体，在免疫后的第1d即能检测到抗体的产生，在第14d达到最高值，其中疫苗组最高超过1:240，而为添加壳聚糖佐剂的对照组疫苗的滴度低于本发明的疫苗，仅采用灭活抗原浸浴的大口黑鲈产生的抗体滴度更低，在免疫后第14天达到最高水平后，随后效价逐渐降低。
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