一种asfv双基因重组prrsv活载体疫苗的制备方法
阅读说明：本技术 一种asfv双基因重组prrsv活载体疫苗的制备方法 (Preparation method of ASFV double-gene recombinant PRRSV live vector vaccine ) 是由 夏平安 陈静 张宜娜 李闻 崔志莹 陈雨 徐朋丽 赵士杰 苗信永 解金辉 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法,属于生物工程技术领域,该ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法包括下列步骤：ASFV P30和P72 cDNA的扩增；融合PCR引物的设计与合成；ASFV P30和P72重组PRRSV嵌合病毒的构建；ASFV P30和P72双基因重组PRRSV的拯救；ASFV P30和P72双基因重组PRRSV的生物学特性检测；ASFV P30和P72双基因重组PRRSV的免疫攻毒试验,检测重组病毒的免疫保护力；本发明建立了一种ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗毒的制备方法,该方法能够同时对PRRSV和ASFV产生一定的免疫保护作用。(The invention discloses a preparation method of an ASFV double-gene recombinant PRRSV live vector vaccine, belonging to the technical field of biological engineering, the preparation method of the ASFV double-gene recombinant PRRSV live vector vaccine comprises the following steps: amplification of ASFV P30 and P72 cDNAs; designing and synthesizing a fusion PCR primer; constructing ASFV P30 and P72 recombinant PRRSV chimeric virus; rescue of ASFV P30 and P72 double-gene recombinant PRRSV; biological characteristic detection of ASFV P30 and P72 double-gene recombinant PRRSV; an immune challenge test of ASFV P30 and P72 double-gene recombinant PRRSV detects the immune protective ability of the recombinant virus; the invention establishes a preparation method of ASFV double-gene recombinant PRRSV live vector vaccine virus, and the method can generate a certain immune protection effect on PRRSV and ASFV simultaneously.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus, ASFV)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病，急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血，发病率和病死率可高达100%。由于ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，使得研制有效的疫苗十分困难。ASFV 为有囊膜的双链 DNA病毒，是非洲猪瘟相关病毒科( Asfarviridae )非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员。基因组全长170-194 kb，编码150-200种蛋白。恢复期猪血清显示P72、P30和P54蛋白为感染过程中引起体液免疫应答最重要的３个抗原蛋白。针对P72和P54蛋白的抗体可以阻止病毒吸附，针对P30的抗体可以阻止病毒内吞。因此，这些蛋白作为重要的抗原蛋白可以用于ASF疫苗的研制。
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV）感染引起，并导致母猪生殖障碍和仔猪呼吸障碍为主要表现症状，严重影响全球养猪业30多年，目前，仍未研制出防控PRRS的有效疫苗。PRRSV是单股正链的RNA病毒，易变异，基因组全长约为15kb ，目前在其编码区已知的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）有10个，该病毒的基因组为多顺反子结构，复杂且紧凑，多个基因在末端相互重叠，在两个 ORF中进行编码。
ASFV和PRRSV均感染猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages, PAMs），目前已知ASFV在体外除PAMs尚无其它培养细胞系，而PRRSV在体外可感染Marc-145等传代细胞系，构建出能够表达ASFV蛋白的PRRSV重组活病毒，可极大地减少试验及生产成本。本发明利用反向遗传操作技术，确保不影响PRRSV结构的基础上，在PRRSV弱毒株感染性克隆骨架上插入ASFV的P30和P72的编码基因序列，获得能够表达ASFV P30和P72蛋白的PRRSV重组活病毒，并对重组病毒进行病毒生物学特性及免疫效果分析，旨在构建出能同时预防这两种疾病的重组PRRSV活载体疫苗。
现有技术中，中国专利CN104694561A公开了一种表达海肾荧光素酶和萤火
虫荧光素酶基因的蓝耳病病毒 (PRRSV) 重组质粒的构建方法及其应用。基于反向遗传操作平台，将海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因插入到 pHuN4-F112 基因组中，成功构建了 pA-Rluc 和pA-Fluc这两个重组质粒。转染 MARC-145细胞后，二者均成功拯救出了活病毒，并且发现重组病毒vA-Rluc、vA-Fluc 与亲本毒 vHuN4-F112 具有相似的病毒学特性。将其感染 MARC-145 细胞或者 PAMs细胞之后，获得的荧光素酶活性数值可以成为指征 PRRSV 在这两种细胞上复制水平的另外一种指标。
中国专利CN110628817A公开了一种表达非洲猪瘟病毒（African Swine FeverVirus ,ASFV）p30蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗及构建方法。对rPRRSV-p30感染孔进行间接免疫荧光，发现视野下出现了抗PRRSV N蛋白的特异性荧光及抗ASFV p30蛋白的特异性荧光。收取rPRRSV-p30感染孔的蛋白样品，对其进行
western blot检测，结果发现出现了预期大小的p30条带。说明该表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV可以保证外源蛋白ASFV的p30蛋白得到良好的高效的稳定的表达。而有研究表明p30是重要的抗原蛋白，能够用于ASF的疫苗研制。
中国专利CN110904153A公开了一种表达非洲猪瘟病毒（African Swine FeverVirus ,ASFV）p12蛋白或者p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗及构建方法。对rPRRSV-p12和rPRRSV-p17感染孔进行间接免疫荧光，视野下检测到抗PRRSV N蛋白的特异性荧光信号及抗ASFV p12蛋白或p17蛋白的特异性荧光信号。说明该表达非洲猪瘟病毒p12蛋白或p17蛋白的重组PRRSV可以保证外源蛋白ASFV的p12或p17蛋白得到良好的高效的稳定的表达。而有研究表明p12和p17都是重要的抗原蛋白，能够用于ASF的疫苗研制。
上述技术均采用外源基因插入，插入ASFV外源基因会改变PRRSV病毒的基因组，导致PRRSV在传代过程中逐渐丢失编码序列，呈现遗传不稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法，使用蛋白的优势抗原表位作为外源基因进行插入，减少非中和抗体的产生，同时减轻对PRRSV原有结构的影响程度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法，该ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法包括下列步骤：
①、SOE PCR引物设计：根据ASFV P30和P72蛋白编码基因的核苷酸序列以及PRRSV弱毒株HeN-3的基因序列设计SOE PCR引物；
②、插入ASFV P30和P72蛋白的编码基因序列：在HeN-3基因上插入ASFV P30和P72蛋白的编码基因序列；
③、获得嵌合重组质粒pPA-P30/P72：在外源基因3’端插入PRRSV的转录调控序列6（TRS6），从而获得嵌合重组质粒pPA-P30/P72；
④、转染Marc-145细胞；
⑤、基于上述重组质粒，转染Marc-145细胞后得到重组PRRSV：rPA-P30/P72。
本发明的有益效果是：本发明在确保不影响PRRSV结构的基础上，将ASFV的P30和P72的编码基因序列插入PRRSV弱毒株感染性克隆骨架中，获得PRRSV重组活病毒，该重组病毒vPA-P30/P72与亲本毒HeN-3具有相似的病毒学特性，且在至少连续20代次的传代过程中能够保持遗传稳定性，可同时预防ASFV和PRRSV两种疾病。
附图说明
图1为本发明所构建重组质粒的策略图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
请参考图1，下面将结合附图对本发明实施例的ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法作详细说明。
该ASFV双基因重组PRRSV活载体疫苗的制备方法包括下列步骤：
①、SOE PCR引物设计：根据ASFV P30和P72蛋白编码基因的核苷酸序列以及PRRSV弱毒株HeN-3的基因序列设计SOE PCR引物；
②、插入ASFV P30和P72蛋白的编码基因序列：在HeN-3基因上插入ASFV P30和P72蛋白的编码基因序列；
③、获得嵌合重组质粒pPA-P30/P72：在外源基因3’端下游插入PRRSV的转录调控序列6（TRS6），从而获得嵌合重组质粒pPA-P30/P72；
④、转染Marc-145细胞；
⑤、基于上述重组质粒，转染Marc-145细胞后得到重组PRRSV：rPA-P30/P72。
上述实施例中的重组PRRSV：rPA-P30/P72，以PRRSV为载体借助传代细胞系模拟ASFV感染，能与P30和P72的兔源多抗以及PRRSV的N蛋白的单抗发生抗原抗体反应，出现特异性的免疫荧光和预期大小的WB的条带。说明该重组病毒rPRRSV-P30/P72能够稳定高效的表达ASFV的P30和P72蛋白。表达ASFV P30和P72蛋白的重组PRRSV可能作为一种新型的病毒活载体疫苗用于ASF和PRRS的免疫保护
本发明利用反向遗传操作技术，确保不影响PRRSV结构的基础上，在PRRSV弱毒株感染性克隆骨架上插入ASFV的P30和P72的编码基因序列，获得能够表达ASFV P30和P72蛋白的PRRSV重组活病毒，并对重组病毒进行病毒生物学特性及免疫效果分析，旨在构建出能同时预防这两种疾病的重组PRRSV活载体疫苗。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。