阅读说明：本技术 固态溶液形式的癸氧喹酯纳米粒子制剂 (Decoquinate nanoparticle formulations in solid solution form ) 是由 王洪星 梁双红 范银洲 黄振平 赵思婷 秦莉 陈小平 于 2019-01-02 设计创作，主要内容包括：公开了一种生产含癸氧喹酯纳米颗粒制剂的固态溶液的热熔挤出方法。包含热熔挤出产品的纳米颗粒的水相均匀且稳定。提供了包含癸氧喹酯固态溶液的组合物,和生产含有癸氧喹酯固体分散体的组合物的热熔挤出方法。此外,提供了包含纳米级癸氧喹酯制剂的固态溶液,其改善了癸氧喹酯的水溶性、增强了癸氧喹酯在消化道的释放,以便于吸收、提高生物利用度以及在肝脏阶段对抗疟疾的功效。(A hot melt extrusion process for producing a solid solution containing decoquinate nanoparticle formulation is disclosed. The aqueous phase comprising the nanoparticles of the hot-melt extruded product is homogeneous and stable. Compositions comprising a decoquinate solid solution, and hot melt extrusion processes for producing compositions containing decoquinate solid dispersions are provided. In addition, solid solutions comprising nanoscale decoquinate formulations are provided that improve the water solubility of decoquinate, enhance the release of decoquinate in the digestive tract for absorption, increase bioavailability, and efficacy against malaria during the hepatic stage.)

固态溶液形式的癸氧喹酯纳米粒子制剂

技术领域

本发明涉及双螺杆挤出机中的热加工过程，其产生的挤出物形式为固态溶液，其组成包含抗疟疾(抗寄生虫)药物癸氧喹酯(DQ)或其它治疗药物如其它抗寄生虫药。在一些实施例中，固态溶液以一种复合物的形式存在，它包含药物、一种可热熔挤出的赋形剂、以及基于该复合物的重量的较小百分比的增塑剂或增溶剂。热熔挤出辅料的实例包括羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物。这种固态溶液旨在作为固体口服制剂在体内释放药物活性成分(API)以达到预防或治疗疟疾感染或其他寄生虫疾病或疾患。

背景技术

疟疾是一种由疟原虫如间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)感染引起的蚊媒传染病。另有一种疟原虫，诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)可感染人和猴。疟疾通常是由已感染的雌性按蚊进行传播，寄生虫在蚊子吸人血时随其唾液进入人血(Malaria Fact Sheet.No.94.Updated March 2014,Retrieved28August 2014)，并在肝脏中发育成熟和繁殖。大多数疟疾患者的死亡是由恶性疟原虫引起的，而间日疟原虫,卵形疟原虫和三日疟原虫所引起的疟疾通常相对地比较温和。由恶性疟原虫引起的重症病例死亡率极高，其中70％以上是5岁以下的儿童。此外，前往疟疾流行地区的旅行者也容易受到寄生虫的感染。间日疟原虫和卵形疟原虫密切相关，两者均具有在肝脏阶段形成休眠子的独有的生物学特征。休眠子是肝脏中的一种隐匿形式，可导致人的疟疾复发。

疟原虫感染人类、灵长类和啮齿类后，起初的48h在肝脏中进行增殖(前红细胞阶段)，而后阶段中在红细胞中进行增殖。青蒿素是最常用的一线抗疟疾药物，用作青蒿素联合疗法(ACT)的核心药物。它和大多数经典的抗疟疾药物如氯喹和奎宁都是作用于红细胞阶段的疟原虫，但不抑制肝脏阶段寄生虫的生长。另外，全球范围内均出现了疟原虫对抗疟疾药物产生抗性的问题。例如，抗氯喹的恶性疟原虫已扩散到大多数疟疾地区，抗青蒿素的疟原虫也已成为东南亚部分地区的一个问题。("Malaria Fact sheet N°94".WHO.March2014.Retrieved 28August 2014)。疟原虫对氯喹和磺胺多辛/乙胺嘧啶的广泛抗药性以及对ACT的青蒿素组分呈现的抗药性已成为控制疟疾很关键的挑战(Ariel,F.et al.,Amolecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria,Nature 2014,505:50–55)。在静止的肝脏期由间日疟原虫和卵型疟原虫感染所产生的休眠子也使疟疾很难控制。伯氨喹啉是用于肝脏期的抗疟疾药物，但有严重的副作用。该药物会引起有葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症倾向(G6PDD)的患者发生急性溶血性贫血。马拉隆是阿托伐醌和氯胍的混合制剂，也是用于肝脏阶段的抗疟疾药物，但价格昂贵，多数病人难以负担。因此，需要研制新的、高效的并且价格合理的低毒抗疟疾药物，尤其是对肝脏阶段有效且无耐药性的抗疟疾药，以更好地保护易感人群。

已发现癸氧喹酯(DQ，CAS No.18507-89-6)在体内和体外实验中均表现出对疟原虫的强效抑制和杀灭作用(Meister,S.et al.,Imaging of Plasmodium liver stages todrive next-generation antimalarial drug discovery,Science 2011；334:1372-7)。其对肝脏阶段和血液阶段的疟原虫均有功效，故而在防治临床症状、减少传播、降低耐药可能性方面，DQ具有比现有抗疟疾药物更为明显的优势(da Cruz,FP.et al.,Drug ScreenTargeted at Plasmodium Liver Stages Identifies a Potent MultistageAntimalarial Drug.J Infect Dis 2012,205(8):1278-1286)。它作用于并且抑制疟原虫线粒体的细胞色素bc1复合物却不影响哺乳动物的呼吸链。癸氧喹酯作为一种兽药和纳米颗粒形式在动物毒理实验中已被证明是安全的(Wang,H.et al.,Nanoparticleformulations of decoquinate increase antimalarial efficacy against liverstage Plasmodium infections in mice,Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,Medicine 2014,10:57-65)。耐氯喹的疟原虫对其没有耐药性(CN104906044A[2015]:adecoquinate nano-formulation and its preparation and application；da Cruz,FP.Et al.,Drug Screen Targeted at Plasmodium Liver Stages Identifies a PotentMultistage Antimalarial Drug J Infect Dis(2012),205(8):1278-1286)。癸氧喹酯有很大的成为抗疟疾药物的潜力。但是，癸氧喹酯要发展成为用于临床的口服抗疟疾药物，关键是要解决溶解度的问题；同时，口服制剂需要使癸氧喹酯在体内被小肠有效吸收，从而使化合物在体内变为可利用的和有活性的。

热熔挤出(HME)方法通过运用各个螺旋杆区段可控制的温度、低熔点辅料、药物组分的物理相互作用的效率和加工过程的机械作用等，而在解决小分子化合物不溶性问题上具有明显的优越性。尽管如此，要获得使难溶性化合物在到达肠道并且被吸收前，能均匀分散并稳定存在于水相中的热熔挤出产品，选择适用于API的赋形剂和适合于该组合物配方的工艺参数是必不可少的要求。

当活性药学成分(API)以晶体或无定形颗粒状态均匀分散在另一种固体赋形剂中时，就获得了固体分散体。如果API以分子状态溶解在由赋形剂所组成的固态基质中，制剂就是真正的固态溶液。在真正的固态溶液的情况下，由于API和赋形剂完全混溶，而且是在整个组份范围内易于互溶，因此制剂具有热动力学上的稳定性。但是，在大多数情况下，API和赋形剂只在有限范围内混溶，产生其它形式的固态溶液和分散体，此时会遇到各种不稳定因素。因为没有溶解扩散到过饱和的固态溶液表面的API的驱动力，最初溶解在过饱和固态溶液中的API即可随着时间的推移而沉淀。API颗粒在固体分散体中的粒度分布随着时间的推移，大粒子会以消溶较小的粒子为代价而变得更大(奥斯特瓦尔德成熟)。悬浮液中API的小颗粒数逐渐减少，而大的颗粒持续增加。分散在无定形颗粒中的API也是热力学不稳定的，并且可能随着时间推移而结晶。

发明内容

本发明公开了一种高温加热工艺，用于制备一种固态溶液制剂，该制剂含有药理学活性剂，其步骤包含了将癸氧喹酯与一种可热熔挤出的赋形剂、一种增塑剂或增溶剂混合以形成混合物。加工所述混合物是在具有多个温度区段的双螺杆挤出机中进行，熔融温度均低于癸氧喹酯的降解温度。挤出所述混合物形成挤出物，其中所述挤出物中所述癸氧喹酯呈固态溶液状。固态溶液提供具有活性的治疗药物，并且可以进一步制成固体口服剂型，以在体内释放治疗药物用于预防或治疗疟疾感染或其他寄生虫疾病或疾患。

本发明提供了一种用于热熔挤出的组合物，其中，以干重计算，所述组合物包含了5％-30％癸氧喹酯、60％-90％可热熔挤出的赋形剂、和5％-10％增塑剂或增溶剂。

在一个具体方案中，可热熔挤出的赋形剂是羟丙基甲基纤维素(AFFINISOL^TM HPMCHME)、羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(AFFINISOL^TM HPMCAS)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物

EPO)、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物(VA 64)、聚乙二醇，或二种或更多种的组合。

在另一个具体方案中，AFFINISOL^TM HPMC HME是设计用于提高API的溶解性和抑制API重结晶的商业化产品，羟丙基甲基纤维素作为API固态溶液的载体，对比其它商品化用于热熔挤出的高分子载体，具有更小的吸湿性。AFFINISOL^TM HPMCAS是一种可溶性高分子聚合物，可通过维持固体分散体的稳定性和抑制API的结晶化，而帮助优化增强溶解性。丙烯酸甲酯聚合物(

EPO)平均摩尔质量约为47000g/mol，其可通过离子相互作用和聚合物侧链的多重疏水作用显著提高酸性药物的溶解性。侧链的疏水作用还可增强非酸性化合物的溶解性。是一种具有两亲性化学结构的基质共聚体，本文用于制备固态溶液，还用于增强难溶化合物在水性介质中的溶解性。VA 64是一种基质共聚体，由于其具有两亲性质和湿化作用而应用于固体分散体制备，并且可促进固体分散体复溶。

在另一个具体方案中，所述聚乙二醇为聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、或聚乙二醇4000。聚乙二醇作为增塑剂，在熔融过程中可降低熔融温度，从而降低癸氧喹酯发生分解的可能性。此外，聚乙二醇还可以提高活性成分癸氧喹酯的溶出速率(PCT150162PPC)。

在另一个具体方案中，增塑剂是泊洛沙姆188(P188)、聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH40)、硬脂酸聚乙二醇甘油酯(

50/13)、或月桂酸聚乙二醇甘油酯(44/14)中的一种，或二种或更多种的组合。增塑剂是可用作增溶剂或乳化剂以提高难溶化合物的水溶解性的药用制剂赋形剂，可使活性成分癸氧喹酯以分子或极细小颗粒状态分散于其中，促使癸氧喹酯水溶性的增强。增塑剂的熔点低，并且因此能在熔融组合物时降低熔融温度范围，使得制剂组分间在比没有增塑剂时更低的温度下进行相互粘合，促进形成均一密度的癸氧喹酯固态溶液。

此外，本发明所用的高分子材料可有热塑性行为、对高温度热稳定、无毒和增溶作用。本发明所选增溶剂是设计用于热熔挤出加工工艺的，在临床使用时一般被公认为安全(GRAS)的制剂赋形剂。

本发明提供了一种用于加工热熔挤出组合物的热熔挤出制备方法，其中，有癸氧喹酯固态溶液产生。

本发明还提供了一种癸氧喹酯固态溶液作为药物学的制剂在预防和/或治疗由疟原虫引起的疾病的应用。

优选地，所述疾病是指由间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫引起的疟原虫疟疾中的一种或多种。

所述的癸氧喹酯固态溶液可以根据需要加工制成口服制剂，如片剂、冲剂和胶囊。

附图说明

图1显示实施例8制备的热熔挤出物(F8)的热重分析图。癸氧喹酯在250℃以下几乎无变化，只是在250-350℃温度区间才开始逐步被降解。

图2为含有癸氧喹酯的热熔挤出物的差式扫描量热分析(DSC)图。样品制备如实施例8处方，只不过是3批不同的扩大制备的样品，与其对照的是实施例8的处方中癸氧喹酯与辅料在常温下的物理混合物。

图3显示热熔挤出组合物的X射线衍射分析。样品与图2(DSC)中相同(实施例8)，右边是纯原料药癸氧喹酯。注意Y坐标中，相对于实施例8处方中的物理混合物和原料药癸氧喹酯，3个不同批次放大制备的样品的峰值都很低。

图4显示实施例1和实施例2制备的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较。如溶出度实验方法中所述，实验使用的溶出介质含0.1N HCl和10mM SDS，除非另有说明，所有实验均使用该溶出介质。

图5显示热熔挤出技术制备的实施例3和实施例4处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质与图4所用的一致。

图6显示热熔挤出技术制备的实施例3和实施例4处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质为pH6.8的磷酸缓冲液。

图7显示热熔挤出技术制备的实施例7和实施例8处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质与图4所用的一致。

图8显示热熔挤出技术制备的实施例7和实施例8处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质为pH6.8的磷酸缓冲液。

图9显示热熔挤出技术制备的实施例9和实施例10处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质与图4所用的一致。

图10显示热熔挤出技术制备的实施例5、实施例6、实施例9、实施例12和实施例13处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质与图4所用的一致。

图11显示热熔挤出技术制备的实施例14和实施例15处方中的癸氧喹酯固态溶液的体外溶出度比较，溶出介质与图4所用的一致。

图12是实施例8(F8)的样品在斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)大鼠体内的药物代谢动力学研究。F8的热熔挤出纳米制剂通过灌胃给药，用LC-MS检测血液中癸氧喹酯的浓度；纵坐标表示血液中癸氧喹酯的浓度，横坐标表示采血时间。

图13实施例8(F8)制备的样品中癸氧喹酯的高效液相色谱图。该图表明，癸氧喹酯分子经过热熔挤出制备过程后依然完整，色谱图中的峰型和滞留时间均未发生变化。

图14癸氧喹酯标准品的高效液相色谱图。用无水乙醇溶解标准品并适当稀释到合适的浓度范围，再用已建立的高效液相色谱法检测癸氧喹酯峰型和滞留时间。

图15置于pH1.2溶液中2天后的癸氧喹酯标准品的高效液相色谱图。样品用蒸馏水透析，稀释、再用已建立的方法检测分析。经强酸性溶液处理后，纯癸氧喹酯主峰的峰型和滞留时间均发生了变化。

图16是热熔挤出技术制备实施例8(F8)的样品置于pH1.2溶液10天后的高效液相色谱图。样品经透析、稀释后用已建立的HPLC方法检测。HPLC图谱表明热熔挤出固态溶液经强酸性溶液处理后，HPLC并未检测到癸氧喹酯的峰型和滞留时间的变化。

图17是热熔挤出技术制备实施例8(F8)的样品置于pH9.0溶液10天后的高效液相色谱图。样品经透析、稀释后用已建立的HPLC方法检测。HPLC图谱表明热熔挤出固态溶液经碱性溶液处理后，HPLC并未检测到癸氧喹酯的峰型和滞留时间的变化。

图18显示用热熔挤出方法按实施例8(F8)和实施例15(F15)处方制备的样品的稳定性。热熔挤出机中出来的产品暴露于室温下后发生自动干燥，冷却成为固体，然后经碾碎成为粉末状，溶于水性溶液制成悬浮液。悬浮液于室温置放24h后，从各样品取样，并且用蒸馏水稀释后测试粒径，结果如表4；将样品F8和F15粉末分别溶于pH7.4 PBS溶液和生理盐水(弱酸性)中，置于室温储存12个月以上，定期观察溶液中粒子的稳定性。

具体实施方式

本发明公开了一种用于制备含有药理学活性剂的固态溶液的高温加热工艺，包括了将癸氧喹酯与一种能热熔挤出的赋形剂、一种增塑剂或增溶剂相混合制成混合剂的步骤。

癸氧喹酯和其它抗寄生虫药

本发明的口服制剂组合物包含抗寄生虫剂，例如癸氧喹酯或这些试剂的混合物。

癸氧喹酯(DQ)，是一种通过化学合成的(羟基)喹诺酮类化合物，命名为4-羟基喹啉(乙基-6-癸氧基-7-乙氧基-4-羟基喹啉-3-羧酸酯)，CAS号18507-89-6，分子量为418g/mol，分子式为C₂₅H₃₅NO₅。癸氧喹酯对应的化学结构式如下：

癸氧喹酯结构中具有一个仲胺功能基，它可以游离碱的形式加以使用或配成制剂，它也可以用来制成在药学上可接受的盐类。还有，无水或各种水合物形式的癸氧喹酯及其盐类也属于本发明的范围。

本发明提供了一种用于热熔挤出的组合物，其中，组合物基于干重，包含5％至30％的癸氧喹酯，60％至90％的可热熔挤出的赋形剂，5％至10％的增塑剂或增溶剂。

在一个实施方案中，聚合物载体材料是羟丙基甲基纤维素(AFFINISOL^TM HPMCHME)、羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(AFFINISOL^TM HPMCAS)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物(

EPO)、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物(VA 64)、聚乙二醇，或其中的两种或更多种的组合。

在另一个实施方案中，所述羟丙甲基纤维素(AFFINISOL^TM HPMC HME)是商业化产品，旨在提高API的溶解性和抑制API的重结晶，作为API固态溶液的载体，对比于其他用于热熔挤出的高分子载体，它具有更小的吸湿性；其三种亚型不管其热熔挤出产品的溶出度和溶出率如何，均可作为癸氧喹酯的固体分散剂。羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(AFFINISOL^TM HPMCAS)是一种可溶性高分子聚合物，可通过维持固体分散体的稳定性和抑制API的结晶化，帮助优化溶解性的提高；根据聚合物分子中乙酸酯和琥珀酸酯数目的不同，可分为三种亚型，不同国家的厂商均有生产(表3)。考察不同亚型的HPMCAS对癸氧喹酯固体分散体的溶解性和稳定性的作用并对此进行了比较。尽管在体外溶解度实验中，对固体分散体中药物溶出速率的影响是VA 64和

EPO快于HPMC，但在体内研究中，HPMC和

VA 64的平均AUC_0-12h和C_max却低于EPO；体内和体外数据不一致，可能是由于EPO依赖于pH值。在含0.05％SDS的0.1N盐酸溶液中，含

EPO的固体分散体溶解速率明显快于含其他成分的制剂(Zheng,X.,et al.,Part II:Bioavailability in beagle dogs of nimodipine solid dispersionsprepared by hot-melt extrusion.Drug Development&Industrial Pharmacy,2007,33,783–789)。

是一种具有两亲性化学结构的基质共聚体，本文用于固态溶液的制备并且起到增加难溶化合物在水性介质中的溶解性的作用；该高分子聚合物已经被证明是制备癸氧喹酯热熔挤出固体分散体的理想载体材料(CN2015/096689 12/08/2015)。VA64是一种应用于固体分散体的基质共聚物，具有两亲性和湿化作用，还有助于固体分散体复溶；其具有容纳热熔挤出制剂中癸氧喹酯的含量的物理特性，同时还能改善API的溶出速率，如先前的文件所述(CN2015/096689 12/08/2015)。

在另一个实施方案中，所述聚乙二醇为聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、或聚乙二醇4000。聚乙二醇作为增塑剂，在熔融过程中可降低熔融温度，从而降低癸氧喹酯发生降解的可能性。此外，聚乙二醇还可提高活性成分癸氧喹酯的溶出率，促进API在消化道中的释放和吸收。

在另一个实施方案中，增塑剂为泊洛沙姆188P188)、聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH40)、硬脂酸聚乙二醇甘油酯(50/13)、或月桂酸聚乙二醇甘油酯(

44/14)中的任意一种，或其中的两种或更多种的组合。此处增塑剂是一种药用制剂辅料，也是可提高难溶化合物水溶解性的增溶剂，可使活性成分癸氧喹酯以分子或极细小颗粒状态分散于其中从而提高其水溶性。在热熔挤出过程中，增溶剂可起到具有低熔点的增塑剂的作用，在处方熔融过程中使熔融温度范围朝着更低的方向移动，使得各组分可以比在没有增溶剂存在时更低的温度下进行相互粘合，有助于形成密度均一的癸氧喹酯固体分散体。

本发明提供了一种用于热熔挤出的组合物的制备方法，其中有癸氧喹酯固态溶液产生。

在具体的实施方案中，热熔挤出(HME)在热熔挤出机中进行，其中将如上所述的组合物在平行同向旋转双螺杆挤出机内混合碾压，其中组合物的各组分在水平分段的机筒中和在熔融状态下进行混合，其中每个设有螺杆的区段均有预设的温度，通过双螺杆挤出，并通过模具成型，挤出材料经室温自动冷却后得到条状或其他形状的(取决于模具)固态混合体；条状固体混合物经剪切、粉碎后即得粉末状癸氧喹酯固态溶液。

在优选的实施方案中，所述的热熔挤出温度为5-200℃，优选为120-180℃；所述热熔挤出机的螺旋旋转速度为15-300rpm，优选为25-150rpm。

在制备癸氧喹酯固态溶液过程中，需根据原料的成分来调节熔融温度，既使活性成分癸氧喹酯与辅料能在分子水平上有效混合，又避免了癸氧喹酯和辅料的热分解。

通常，固体材料可以具有晶体和非晶体形式，晶体开始融化时的温度称为熔点(Tm)。熔点是物质由固态转变为液态(熔化)时的温度，常用Tm表示。有机化合物通常都有固定的熔点，即在一定压力下，固-液两相之间的变化非常敏感。一个纯物质从固态转变为液态的熔点范围通常较窄，但当有机化合物与其它物质混合时，其熔点会下降，且熔点范围会变宽。癸氧喹酯的熔点为242-246℃。本发明设计了一种特定的组合物，使得当癸氧喹酯与辅料(例如可热熔挤出的赋形剂、增塑剂等)混合熔融时，它可在显著低于其自身熔点的温度下转变为液态，进而降低了癸氧喹酯发生热分解的可能性(图14)，因而有利于保留其原始结构和药效活性。

本发明在制备癸氧喹酯固态溶液的过程中，活性成分癸氧喹酯的化学结构保持不变，其药效活性完好无损；在一些实施例中，挤出的癸氧喹酯固态溶液产物均匀悬浮在含水介质中，悬浮液至少一周内保持稳定而不出现浑浊、漂浮和沉淀的物质；此外，配制在本发明的HME产品中的癸氧喹酯的释放速率和溶出度均明显提高，动物实验发现其生物利用度和抗疟疾活性也明显提高。

本发明提供了使用HME制备方法得到的癸氧喹酯的固态溶液作为药学制剂应用于预防和/或治疗疟原虫引起的疾病的用途。

优选地，所述疾病是由间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫引起的疟疾中的一种或多种。

所述的癸氧喹酯固态溶液可根据需要加工制成口服制剂，如片剂、冲剂和胶囊。

本发明所采用的热熔挤出技术可以将活性药物学成分制备成固态溶液，其中癸氧喹酯发生熔融，并且在可热熔挤出的赋形剂中组成配方，于是固体溶解状态的癸氧喹酯就产生了，并且稳定下来了；在本发明中，对于适合于癸氧喹酯的赋形剂以及适合于生产这种固态溶液的热熔挤出机操作参数进行了挑选，从而优化了条件，形成了稳定的固态溶液。

制造商美国陶氏化学生产的HPMCAS可根据分子中乙酸酯和琥珀酸酯数目的不同而分为912、716和126三种亚型，其他制造商(如日本信越化学和英国亚什兰特种添加剂有限公司)生产的相同的对应产品则名为L、M和H型。这些纤维素基聚合物被用于制备难溶化合物制剂的喷雾干燥技术，但其在与一些化合物热熔时在提高溶解性和制剂稳定性方面表现出不一致的物化性质，这些化合物包括伊曲康唑(弱碱性)、依替米贝(中性)、非洛地平(弱酸性)。HPMCAS中的亚型126或亚型H聚合物分子中含的乙酸酯取代最多，用于热熔挤出法制备癸氧喹酯固态溶液时，比其他两种亚型(HPMCAS 912或716或L型或M型)要好，因其在增溶性和稳定制剂作用方面效果最好(表3)。上述制备的癸氧喹酯固态溶液悬浮于水性介质中，形成的悬浮液呈均相且有光泽，至少24h内稳定无沉淀或聚集现象；将含不同亚型HPMCAS的癸氧喹酯固态溶液两两比较，发现型号AffiniSol^TM 126优于其它两个型号AffiniSol^TM 912和AffiniSol^TM 716。

表3显示了AffiniSol^TM HPMCAS的规格，对应的制造商类型以及在增强癸氧喹酯溶解度和稳定配方方面的作用。

表3用于增强癸氧喹酯(DQ)溶解度和稳定配方的各种HPMCAS亚型。

注：

HPMCAS＝AFFINISOL^TM羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯；

Tg℃＝玻璃化转化温度。

组合物的熔融组分通过一个成形的出口挤出，挤出物经快速冷却后，形成储存稳定的固态单相。同时，挤压加工设备后可以适当改装，以控制挤压物形状，使其修改为在下游可加工成剂型。通常，将这些挤出材料研磨成粉末，这样它们可以掺入传统的口服固体剂型，如片剂或胶囊，同时保持药物所需的释放曲线。

这种存在于分散体中的癸氧喹酯可视为一种固态溶液。为进一步改善癸氧喹酯在水性介质中的分散状态，在热熔挤出工艺之前，还可将适当物质如增溶剂或增塑剂添加到共混物中。水溶性得到改善的纳米级别颗粒的癸氧喹酯，可以提高溶出速率，有助于肠道的吸收，并提高药物的生物利用度和体内生物活性。于是，癸氧喹酯水溶性的改善是通过化合物良好的分散状态的稳定性来实现的，当其混悬于水性介质中时，可以存在于水性介质中至少24h，甚至可以稳定存在于水相中达12个月以上。在一些固态溶液例子中，无需任何进一步的操作，如在没有高压均质化和超声波干预的情况下，其悬浮液中的纳米粒子可小至200nm或介于200-400nm之间。

本发明采用热熔挤出技术制备癸氧喹酯固态溶液。发明人通过选择特定的制剂辅料、特定的主药与辅料比例，使癸氧喹酯可在低于其自身熔点的温度下转变成液态，进而与赋形剂、增塑剂等辅料混熔，大幅度降低了活性成分癸氧喹酯热分解的可能性，有利于保持其原有的结构和药效活性。此外，通过优化机器运行参数，可使活性成分癸氧喹酯与各辅料有效熔融，得到质地均一的挤出物，其中的癸氧喹酯生物利用度和药效方面均优于有机溶剂法制备的相应产品；相对于有机溶剂法，本发明使用的热熔挤出法更易于提高生产效率，因此更便于将实验室成果扩展至中试水平和产业化水平，进而推进到临床应用。

为了便于理解本发明，本发明的实施例列举如下。本领域的技术人员应了解这些实施例仅是为了更好地阐述本发明，而不应理解为对本发明的具体限制。

以下实施例所用的原料及其来源

癸氧喹酯(批号：130802，分子量：417.53；浙江金伯士药业有限公司)；

***标准品(美国西格玛化学品公司(中国分公司))；

羟丙甲基纤维素(AFFINISOL^TM HPMC HME 15LV，HME 4M；陶氏化学公司，美国)；

羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(AFFINISOL^TM HPMCAS-716、AS-912、AS-126；陶氏化学公司，美国)；

甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物(

EPO，尤特奇，德国罗姆公司)；

聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(德国巴斯夫公司)；

乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物(VA 64，德国巴斯夫公司)；

泊洛沙姆188(

P188，德国巴斯夫公司)；

月桂酸聚乙二醇甘油酯(44/14，法国嘉法狮公司)；

硬脂酸聚乙二醇甘油酯(

50/13，法国嘉法狮公司)；

聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH40，德国巴斯夫公司)；

聚乙二醇6000(PEG 6000，美国西格玛奥德里奇公司)。

实施例1

本实施例通过热熔挤出技术从HME组合物制备癸氧喹酯固态溶液，组合物包含了作为活性成分的癸氧喹酯和HPMC HME 15LV、PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占10％。具体制备步骤如下：

当机器温度达到预设的温度后，将混合物料加入料斗并启动同向旋转双螺杆挤出机(Pharm 11)。双螺杆热熔挤出机的熔融温度设置为120-160℃；螺杆起始转速为50rpm，观察机器显示屏上的压力和扭矩力，若数字显示在正常范围内，则可将螺杆转速调至150rpm；物料经分段加热、混合、熔融和推挤过程后得到熔融物，经口模成形得条状挤出产品，室温下迅速冷却成固体，将其粉碎处理。

制备的产物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为1.01μm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图4所示。

实施例2

本实施例通过热熔挤出技术从HME组合物制备癸氧喹酯固态溶液，组合物包含了作为活性成分的癸氧喹酯和HPMC HME 15LV、PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出的产物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为1.097μm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图4所示。

实施例3

HME组合物包含了作为活性成分的癸氧喹酯和HPMC HME 4M、PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占10％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。设置热熔挤出机的熔融温度为120-180℃，其余参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出的产物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为4.385μm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图5和图6所示。

实施例4

HME组合物包含了癸氧喹酯、HPMC HME 4M和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。设置热熔挤出机的熔融温度为120-180℃，其余参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为2.232μm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图5和图6所示。

实施例5

HME组合物包含了癸氧喹酯、HPMC HME 15LV、

P188和RH40。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。挤出的产物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为898nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图10所示。

实施例6

HME组合物包含了癸氧喹酯、HPMC HME 15LV和RH40。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

HPMC HME 15LV 105g

RH 40 15g

癸氧喹酯 30g

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出的产物悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为762nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图10所示。

实施例7

HME组合物包含了癸氧喹酯、HPMCAS-912和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占25％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

本实施例制备的癸氧喹酯产物悬浮于水相后所测定的颗粒平均粒径为588nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图7和图8所示。

实施例8

HME组合物包含了癸氧喹酯、

HPMCAS-126和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占25％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物在悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。本实施例制备的癸氧喹酯固态溶液在水相中的平均颗粒尺寸小，且稳定，悬浮液在室温下存放24h后也不发生沉淀和聚集。经测定，颗粒平均粒径为472nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图7和图8所示。

实施例9

HME组合物包含了癸氧喹酯、VA 64、PGGS(聚乙二醇硬脂酸甘油酯或50/13)、P188(Poloxamer 188或

P188)。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占25％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物在悬浮于PBS(pH 7.4)缓冲液中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀。经测定，颗粒平均粒径为820nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图10所示。

实施例10

HME组合物包含了癸氧喹酯和EPO(甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物或EPO)。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

EPO 120g

癸氧喹酯 30g

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

本实施例挤出的产物悬浮于HCl溶液(pH 4.0)中呈均一相，悬浮于水相时也呈现出质地均匀；经测定，颗粒平均粒径为627nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图9所示。

实施例11

HME组合物包含了癸氧喹酯、

VA 64和EPO。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占25％。具体制备步骤如下：

VA 64 30g

EPO 120g

癸氧喹酯 50g

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

本实施例挤出的产物悬浮于HCl溶液(pH 4.0)中呈均一相，悬浮于水相时也呈现出质地均匀；经测定，颗粒平均粒径为891nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图9所示。

实施例12

HME组合物包含了癸氧喹酯、

VA 64和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占10％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

本实施例挤出的产物在悬浮于生理盐水(弱酸性)中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀；经测定，颗粒平均粒径为505nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图10所示。

实施例13

HME组合物包含了癸氧喹酯、VA 64和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物在悬浮于生理盐水(弱酸性)中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀；经测定，颗粒平均粒径为345nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图10所示。

实施例14

HME组合物包含了癸氧喹酯、

VA 64和

50/13。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占20％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物在悬浮于生理盐水(弱酸性)中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀；经测定，颗粒平均粒径为317nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图11所示。

实施例15

HME组合物包含了癸氧喹酯、

VA 64和PEG 6000。以占组合物总重量百分比计，癸氧喹酯占25％。具体制备步骤如下：

按上述质量称取各组分并充分混匀。热熔挤出机的运行参数设置和混合物料加入料斗后的操作步骤与实施例1相同。

挤出物在悬浮于生理盐水(弱酸性)中呈均一相；悬浮于水相时也呈现出质地均匀；本实施例中制备的癸氧喹酯在水相中的平均颗粒尺寸小，且稳定，悬浮液在室温下存放24h后也不发生沉淀和聚集。所测定的颗粒平均粒径为209nm；癸氧喹酯的累积溶出百分率如图11所示。

表1为实施例1至实施例8制备的热熔挤出癸氧喹酯组合物中各组分所占的百分比(以干重计算)。

表1

注：

＝聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物；

PEG 6000＝聚乙二醇6000；

HPMC＝羟丙甲基纤维素；

15LV＝HPMC HME 15LV；4M＝HPMC HME 4M；

AS-912＝HPMCAS-912；

AS-126＝HPMCAS-126；

P188＝泊洛沙姆188(P188)；

RH40＝聚氧乙烯40氢化蓖麻油；

DQ＝癸氧喹酯。

表2为实施例9至实施例15制备的热熔挤出癸氧喹酯组合物中各组分所占的百分比(以干重计算)。

表2

注：

＝PEG 6000/乙烯己内酰胺/醋酸乙烯酯共聚物

VA 64＝乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物；

PGGS＝硬脂酸聚乙二醇甘油酯(

50/13)；

P188＝泊洛沙姆188P188)；

RH40＝聚氧乙烯40氢化蓖麻油；

EPO＝甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物(

EPO)；

PEG 6000＝聚乙二醇6000；

DQ＝癸氧喹酯。

API进入身体后存在于溶液中是其吸收的必需条件，提高溶出速率可以改善难溶性API的口服生物利用度，如Noyes-Whitney方程所示：

方程式中，dW/dt表示给药的速率，A为固体药物的表面积，Cs是固体在溶出介质中的浓度，C是固体表面扩散层中的固体浓度，D是扩散系数，L是扩散层厚度。固体药物的表面积越大，扩散层中的固体浓度越低，扩散层厚度越小，则给药速度越快。固态溶液中，药物微粒被均匀分散于载体中，使其热力学上稳定，有利于促进溶出速度。

在水相中，药物微粒越小溶解越快，溶解度也更高，这一规律可用Ostwald-Freundlich方程表示：

式中，固体药物粒径越小则溶解度越大。一个著名的例子是Ostwald熟化，即因为界面张力，析出物中的小颗粒消溶而大颗粒长大。通常物质在室温储存3个月后均会出现Ostwald熟化现象，低温可延迟产生熟化而高温促进熟化。一些因素如冷冻干燥和喷雾干燥，会影响微小粒子的聚集，尤其是对具有大疏水表面积的物质，在解聚集时会***，因而通过干燥处理后就会是溶出率下降(Van Eerdenbrugh B,Froyen L,van Humbececk J,Mortens JA,Augustijns P,van den Mooter G.Drying of crystalline drugnanosuspensions-the importance of surface hydrophobicity on dissolutionbehavior upon redispersion.Eur J Pharm Sci,2008,35:127-35.)。

热重分析表明经过热熔挤出过程后，固态溶液中的癸氧喹酯分子没有被破坏(图1)。选择上述一些实施例中的制剂样品进行了差式扫描量热分析和X射线衍射分析。得到的资料表明，与癸氧喹酯标准品比较，发现由F8处方放大制备的三个批次固态溶液中的癸氧喹酯的原始峰消失，说明经过热熔挤出工艺过程后，API与辅料之间发生了融合(图2和图3)。高效液相色谱(HPLC，安捷伦1260)分析表明，与癸氧喹酯标准品比较，所有实施例产品中的癸氧喹酯的保留时间和峰型均没有发生变化；实施例产品混悬于水相再静置24h后，除了产品F11以外，其水相中的癸氧喹酯含量达90％以上(表4和图13)。

癸氧喹酯固态溶液的平均粒径和zeta电位是用动态光散射仪(DLS)，一种颗粒分布分析仪而检测的(Zetasizer Nano ZSE，马尔文，英国)。将每个样品的热熔挤出产出物溶于水或PBS中，超声处理2分钟(GT-2227QTS，固特，中国广东)，然后取约1毫升置于由粒度仪生产厂家提供的测量皿中用于检测；Zetasizer系统是用DLS通过测定样品中粒子的布朗运动速度来测定粒径的，表4所列的数据是基于光强度的粒度分布(PSD)得到的平均粒径和多分散系数(PDI)，除了F11和F12以外，其余样品的PDI均低于0.3(表4)。

表4显示实施例1-15的癸氧喹酯热熔挤出的制剂的一些物理化学特性。由HPLC分析所测得的水相中癸氧奎酯的含量在14个样品制剂中都超过了90％，而且是在热熔挤出物混悬于水溶液中并且静置至少24小时后。为了鉴定混悬于水相中24小时后的癸氧喹酯制剂的粒径和多分散系数(PDI)，从每个样品中取部分样品，然后稀释到合适的能够测量粒径的浓度。除了F8是用PBS(pH7.4)稀释外，其余样品均是用蒸馏水稀释。

表4

注：

PS＝平均粒径；PDI＝多分散系数；

载药量A(％)＝以干重计算，理论上癸氧喹酯(API)在组合物中所占的百分比；

B(％)＝将热熔挤出产品悬浮于水性介质中并于室温下静置24h后，测得HME产品中癸氧喹酯的含量占组合物总干重的百分比；

溶剂和pH：热熔挤出产品研磨成微粒粉末，悬浮于不同pH溶液中，以便检测其物化性质。

热重分析

将热熔挤出技术制备的一系列癸氧喹酯样品进行热重分析，图2为按实施例8(F8)所制备癸氧喹酯产物的热重分析图。由图可知，癸氧喹酯在250℃以下几乎没有变化，温度升高至250-350℃时开始发生热分解。任何250℃以下的重量丢失可能是水分子的损失。因此，在所有癸氧喹酯的热熔挤出产物中，所用的热熔挤出工艺的温度均会显著低于可能使癸氧喹酯发生热分解的温度，因而是在安全范围。

差式扫描量热(DSC)分析

称取适量的各实施例中的癸氧喹酯热熔挤出产物分别进行DSC测定。实施例8(F8)中样品处方放大后制备了三批热熔挤出产品，每批含API公斤级。图2展示对F8处方中3个不同批次的放大了的样品与F8各组分的物理混合物样品所作的DSC分析。由图可知，癸氧喹酯热熔挤出产品中各个组分已完全互为交织，这与F8的物理混合物的峰形大不相同，后者的各组分的峰形没有发生改变。所用仪器为万分之一天平(Sartorius，购于赛多利科学仪器有限公司，型号BSA124S)和差式扫描量热仪(德国NEYZSCH公司DSC21400A-0211-L)。

检测条件N2：40mL/min设置为扫描程序：从20℃升至150℃，保持5min，然后以20℃/min的速率降至-20℃，保持5min，再次由-20℃升至150℃，记录温度升高时的第二条曲线。样品的玻璃化转化温度(T_g)可由图2的曲线特征获得。

测定所用方法是《塑性差式扫描量热法(第二部分)：玻璃化转变温度的测定》GB/T19466.2-2004。实施例8(F8)的含癸氧喹酯的热熔挤出物的T_g约为30℃，而含癸氧喹酯的相同处方的物理混合物中的T_g约为125℃。

X射线衍射分析

X射线衍射分析采用中国广州的中山大学实验中心的X射线衍射仪(Empyrean)。所用靶向物质为CuKα辐射源，40kV电压，40mA电流，发射狭缝1/32°，防散射狭缝1/16°，防散射狭缝7.5mm，2θ范围3°-60°，步长0.02°，每步时间40s。图3是实施例8中样品(F8)处方放大制备所得的三批热熔挤出产品、F8处方中各组分的物理混合物和原料药癸氧喹酯的X射线衍射图。相对于F8处方中各组分的物理混合物和原料药癸氧喹酯的衍射峰强度，Y坐标上三个热熔挤出癸氧喹酯产品的衍射峰值都很低。

体外溶出实验

除非另有注明,溶出介质是含0.1N盐酸(HCl)和10mM十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液,仪器为RC-6溶出度测定仪(天津)，测量用过去已描述的标准方法(PCT150162PPC)。用HPLC(Agilent,1260)测定溶出介质中的癸氧喹酯，流动相组成为80％乙醇(含0.1％甲酸)，20％水(含0.1％甲酸)的等度液相。测定波长260nm。

实施例3、4、7、8制备的样品(F3、F4、F7、F8)的溶出实验中还用了溶出介质为pH6.8磷酸缓冲溶液。

药物代谢动力学实验

MS2旋转振荡器(广州仪科实验室技术有限公司，中国)和5415R台式高速离心机(Eppendorf AG，德国)用于样品处理。液相色谱分析是由HPLC液质连用系统完成，该系统由LC-10ADvp泵(SHIMADZU，日本)，MPS3C自动进样器(Gerstel Autosampler，德国)和质谱仪API3000三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)组成。所有的化学试剂和溶剂均为分析级，所用水均经Millipore(AK，美国)实验室超纯水系统(0.2μm滤膜)进行纯化。

标准曲线的制定是将癸氧喹酯以50μg/mL溶于乙醇中，再用乙醇稀释成8个不同的梯度浓度为0.5-500ng/ml，每个浓度取20μl标液，各加入100μL空白血，置于1.5mL离心管中混合。

涡旋3min(Scilogex，US)，加入400μl含内标物(***1000ng/mL)的乙醇/乙腈液(1:1)，再次涡旋5min后，于4℃以16000g×速度离心60min；取100μL上清液置入96微孔板，并进行LC/MS/MS(API3000质谱的Applied Biosystems-Sciex模式)分析。为了测定动物血样中的药物浓度，将100μl待测血样替代100μl空白血，其余处理方法同上。用于质量控制的样品分别为低、中、高三个不同浓度的癸氧喹酯。色谱柱为Agilent ZORBAX EclipsePlus C8(2.1X 50mm,3.5-Micron)，流动相为含0.1％甲酸的甲醇：含0.1％甲酸的水溶液(90:10，v/v)，流速为600μL/min，柱温为30℃，进样器温度为15℃。

药代动力学研究中评估癸氧喹酯的HME制剂所用动物为200-250g的Sprague-Dawley雄性大鼠(来自南方医科大学)。所有大鼠给药前称重，给药剂量是20mg/kg(以癸氧喹酯计)；癸氧喹酯固态溶液溶于生理盐水中，制成癸氧喹酯浓度为2mg/mL的悬浮液，通过灌胃给药；单次给药后，于5min、15min、30min、1h、3h、5h、8h、12h、24h、48h(图12)从尾静脉采200μl全血,置于含肝素的离心管中；使用蛋白沉淀法处理血样。乙醇/乙腈(1:1)的混合液为蛋白沉淀剂。蛋白沉淀是先将20μl乙醇与100μl血样置于1.5ml离心管，涡旋震荡3min，再加入400μl含内标物的沉淀剂，涡旋震荡5min，室温静置8h后再次涡旋震荡5min，然后在4℃以16000g×速度离心60min。上清液中提取样品中活性物进行分析。其分析步骤与上述癸氧喹酯标准曲线制备的方法相同。

图12是实施例8制备的样品(F8)的药物代谢动力学研究，其中纵坐标表示血液中癸氧喹酯的浓度，横坐标表示采血时间。

癸氧喹酯固态溶液的体外抗疟活性

对于实施例中所描述制备的15个不同的癸氧喹酯固态溶液用细胞培养的检测方法进行了测试。血液期疟原虫生长的抑制的检测是采用新鲜分离的人血细胞，肝脏阶段的疟原虫生长的抑制的检测是采用HepG2细胞的培养。疟疾的SYBR荧光检测分析用以检测处于后期环状体和早期滋养体时期的恶性疟原虫的DNA。将感染率为0.5％的虫血、红细胞压积为2％的感染人的恶性疟原虫置于96微孔板中，在37℃、5％CO₂条件下与不同浓度的测试药物共孵育72h后，往每个孔加入含SYBR Green I染料的细胞裂解液，终止细胞培养，检测在宿主人血红细胞中恶性疟原虫的生长抑制。SYBR Green I染料与恶性疟原虫DNA结合产生的荧光强度与疟原虫的数量成正比。详细的方法的描述参考发明人的SOP。

对肝脏阶段疟原虫发育的抑制作用的检测(ILSDA)是将肝脏细胞HepG2与表达萤火虫荧光素酶的伯氏疟原虫子孢子在系列梯度稀释的测试化合物共同培养。如果是制剂，则需要用HPLC检测测试化合物的浓度。试验方法采用修饰了的Ploemen等所描述的方法(PLoS One 2009,4:e7881)。伯氏疟原虫子孢子入侵肝脏细胞HepG2后，将微孔板培养48h，使其在细胞胞内增殖。测试化合物或与赋形剂连接在一起的测试化合物对肝脏阶段疟原虫生长的抑制是通过测量荧光素酶催化底物的过程中所产生的荧光强度来测定的。底物是在终止细胞培养时加入的。

表5癸氧喹酯对肝脏期伯氏疟原虫P.berghei ANKA 868的抑制作用。实验中，用HepG2细胞与从感染按蚊的唾液腺分离得到的子孢子共同孵育；被测样品F8和F15为实施例8和实施例15中制备所得，制成悬浮液后4℃储存，并于第64、70、79天取出适量溶液用于抑制疟原虫作用的实验；被测样品中的癸氧喹酯含量用高效液相色谱测定；抑制实验的结果以最大抑制的半数浓度(IC50)表示。

表5癸氧喹酯热熔挤出制剂(F8和F15)对肝期阶段的表达荧光素酶的伯氏疟原虫(Plasmodium.berghei ANKA 868)的抑制作用。

表6归纳了实施例8和实施例15制备的样品F8和F15的体外药效实验。癸氧喹酯对不同类型和不同来源的血液期P.falciparum疟原虫的抑制作用，氯喹和青蒿素作为对照，实验结果以最大抑制的半数浓度(IC50)表示

表7说明了实施例8中样品F8处方3个放大批次(公斤级)制备所得热熔挤出产品的稳定性。热熔挤出固态溶液分别在碱性(pH 9)、高温(60℃)、高湿(92％)条件下存放5天或10天后，取样检测癸氧喹酯在体外对血液期疟原虫的抑制作用；实验用新鲜制备的然后被恶性疟原虫803或B12D9感染的血红细胞，所用癸氧喹酯样品在与细胞孵育前用透析法将其pH调节至中性。

表7通过检测样品F8固态溶液对两个类型的恶性疟原虫的抑制作用以观察样品的稳定性。

注：

F8是实施例8用热熔挤出制备的固态溶液；

LB：实施例8中样品F8处方放大制备的批次(API kg/批次)；

SB：强碱(pH 9)处理F8固态溶液；

HH1：高湿(92％)条件下存放F8固态溶液5天；

HH2：高湿(92％)条件下存放F8固态溶液10天；

HT1：高温(60℃)条件下存放F8固态溶液5天；

HT2：高温(60℃)条件下存放F8固态溶液10天。

体内药效实验

用于实验的NIH瑞士雌性小鼠在到达后至少养7天。实验开始时，小鼠年龄为7周。每个笼子只养一只小鼠，室温维持在18-26℃范围，相对湿度34％-68％，每天交替进行12小时光照和12小时黑暗；试验前和试验中自由进食标准饲料和水。此实验严格按照相关动物实验法规进行(实验动物管理条例，中国国务院批准，2017.3修订版)。实验所用的癸氧喹酯固态溶液是实施例2、8、9、11、12、15制备的样品F2、F8、F9、F11、F12、F15，将其溶于生理盐水中，超声5分钟，制成悬浮液。每次动物实验至少重复3次，每次每组5只小鼠，因此每组至少测试15只小鼠。小鼠的疟原虫感染方法是每只小鼠尾静脉注射50000个伯氏疟原虫子孢子(P.berghei ANKA 868)。将测试化合物或制剂化合物灌胃(口服)给药，分别为疟原虫感染的前一天、当天和后一天。在给动物给药之前，通过HPLC方法对悬浮在盐水中的制剂化合物进行定量。阳性对照是作用于肝脏期疟原虫的抗疟疾药伯氨喹啉；载体空白是制备癸氧喹酯固态溶液所用的组分，但是不含癸氧喹酯。载体空白中的任一组分均无抗疟活性，其结果与以生理盐水为阴性对照组所得的结果一致。虫血率的检测方法如下：用传统的方法计数每mm³血液中的红细胞数；制备薄血膜并用3％Giemsa染色20min；然后在显微镜油镜下计数每1000个红细胞中被感染的红细胞数，计算红细胞感染率(EIR，‰)。若在薄血膜上没有观察到疟原虫，则需制备厚血膜进行观察，并以每100个白细胞(WBC)中的疟原虫数量来表示结果。在小鼠注射子孢子后的第60天统计生存率。

表8显示所列的一些实施例中制备的产物在NIH-瑞士小鼠对抗伯氏疟原虫感染的药效。测试热熔挤出产品的给药剂量按癸氧喹酯计算，为5mg/kg体重，阴性对照组用生理盐水，阳性对照组是伯氨喹啉，给药剂量为30mg/kg体重。结果显示在第12天时通过显微镜观察小鼠血液的薄血膜或厚血膜检测到疟原虫的被感染小鼠的数量。结果还列出了第12天的保护率和第60天的生存率。实施例8、9、11、15的产品F8、F9、F11、F15对小鼠的保护率达100％，而伯氨喹啉和产品F2、F12的保护率均为80％；实验结果表明，与生理盐水组的保护率和生存率均为零对比，本发明用热熔挤出物具有抗疟疾活性的组分可有效预防疟原虫子孢子对小鼠的感染。

表8一些实施例中以固态溶液形式制备的癸氧喹酯对疟疾的防治作用。伯氏疟原虫(P.berghei ANKA)子孢子通过尾静脉注射给NIH-瑞士雌性小鼠，而癸氧喹酯通过灌胃给药。

注：PQ，伯氨喹啉；DQ，癸氧喹酯。

表9显示实施例8和实施例15制备的样品F8和F15的平均粒径和多分散指数(PDI)的小结，其数据与图18相对应。数据表明两处方制备的样品中的颗粒相对稳定，分布均匀,如PDI所示，时间超过12个月。

表9

注：PS，平均粒径；PDI，多分散系数。

申请人声明，本申请通过上述实施例阐明了产品、用途及其应用模式，但是本发明并不局限于上述的详细用途和应用模式，也就是说，本发明并非必须依赖上述的详细用途和应用模式才能实施。所属技术领域的技术人员应该知道，对本发明的任何改进和对本发明产品各组分的等效替换、添加辅助成分、选择具体方式等类似的做法，均属于本发明的保护范围和公开范围。