修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用其产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的l-氨基酸的方法

文档序号：1191666 发布日期：2020-08-28 浏览：14次 >En<

阅读说明：本技术 修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用其产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的l-氨基酸的方法 (Modified homoserine dehydrogenase and method for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid using the same ) 是由权秀渊李光雨许兰金径林 M·白孙承珠李在旼于 2019-04-10 设计创作，主要内容包括：本公开涉及修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用其产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法。(The present disclosure relates to modified homoserine dehydrogenase and a method of producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid using the same.)

修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用其产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及修饰的高丝氨酸脱氢酶，且具体地，涉及具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用修饰的高丝氨酸脱氢酶产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，所述多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用组氨酸取代氨基酸序列第407位的氨基酸。

背景技术

在L-氨基酸中，L-苏氨酸、L-异亮氨酸、和L-甲硫氨酸通常使用通过高丝氨酸脱氢酶(下文中，“Hom”；EC:1.1.1.3)由天冬氨酸-半醛(下文中，“ASA”)产生的高丝氨酸。因此，为通过发酵方法产生氨基酸，将生物合成途径中使用的酶的活性维持在一定水平或较高水平是必要的，并且已经对其进行了深入(intensive)研究。

具体地，已知作用于L-赖氨酸和L-苏氨酸的生物合成途径分支点(branch point)的高丝氨酸脱氢酶的活性由L-苏氨酸和L-异亮氨酸调节。最近，已有几篇关于Hom对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏和使用其产生L-苏氨酸的方法的报道。1991年，Eikmann等人在德国报道了通过用谷氨酸取代甘氨酸(其是Hom的第378位氨基酸残基)而使Hom脱敏(Eikmanns BJ等人，Appl.Microbial Biotechnol.34:617–622,1991)；且在1991年，Archer等人报道了当Hom的C端由于移码突变而损伤时发生脱敏作用(Archer JA等人，Gene 107:53–59,1991)。

发明内容

技术问题

本发明人已对苏氨酸反馈抑制的脱敏作用进行了研究，结果，他们已经分离出编码修饰的Hom的新基因，并确认在转导新基因的微生物中L-氨基酸产生能力得到改善，从而完成本公开。

技术方案

本发明的一个目的是提供修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，氨基酸序列第407位的氨基酸被组氨酸取代。

本发明的另一目的是提供编码修饰的脱氢酶的多核苷酸。

本发明的又一目的是提供棒状杆菌属(genus Corynebacterium)微生物，其包含修饰的高丝氨酸脱氢酶。

本发明的又一目的是提供用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基(cultured medium)中回收高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

本发明的又一目的是提供用于增加微生物中高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的产生的方法，该方法包括增强修饰的高丝氨酸脱氢酶的活性。

本发明的又一目的是提供用于增加高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的产生的修饰的高丝氨酸脱氢酶的应用。

有益效果

本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可广泛用于高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的有效批量产生(efficient mass production)，因为与天然或野生型相比，最终产物的反馈抑制被脱敏。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每种解释和示例性实施方式可应用于其它解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不应被下文提供的具体描述限制。

为实现以上目的，本公开的方面提供了具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，所述多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用另一种氨基酸取代氨基酸序列第407位的氨基酸。

具体地，本公开提供具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，所述多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用组氨酸取代氨基酸序列第407位的氨基酸。更具体地，本公开提供修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列第407位的氨基酸被组氨酸取代。

在本公开中，高丝氨酸脱氢酶(EC:1.1.1.3)指代催化高丝氨酸合成的酶，高丝氨酸是植物和微生物中甲硫氨酸、苏氨酸、和异亮氨酸的生物合成的常见中间体。在本公开中，只要其具有以上转化活性，就可包括高丝氨酸脱氢酶(无论其来源)，并且可使用源自任何有机体(植物、微生物等)的酶作为高丝氨酸脱氢酶。具体地，高丝氨酸脱氢酶可源自棒状杆菌属微生物，且更具体地可源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。例如，高丝氨酸脱氢酶可以是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质可与术语“具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质”或“由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质”互换使用。

在本公开中，可使用本领域公知的各种方法作为用于获得高丝氨酸脱氢酶的方法。这些方法的实例可包括：包括优化密码子以在棒状杆菌属微生物(常用于蛋白质表达)中高效获得蛋白质的基因合成技术和使用基于微生物的宏基因组(metagenomic)信息的生物信息学方法筛选有用酶资源的方法，但方法不限制于此。

在本公开中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质不排除可由于在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列)的上游或下游添加无义序列而发生的突变、或天然发生突变、或其中的沉默突变。另外，只要蛋白质具有与包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质相同或对应的活性，该蛋白质也对应于具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质。作为具体实例，具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、或至少97％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质。

另外，虽然在本公开中其被描述为“包括特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显而易见的是，只要蛋白质具有任一以上同源性的氨基酸序列并表现出对应于以上蛋白质的作用，在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的氨基酸序列的任何蛋白质就也可属于本公开的范围。例如，在本公开中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是源自谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸脱氢酶。更具体地，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)、源自谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)、或源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。由于具有以上序列的高丝氨酸脱氢酶显示出至少80％、至少90％、至少95％、或至少97％的同源性或彼此具有同源性，且由于这些高丝氨酸脱氢酶表现出对应于那些高丝氨酸脱氢酶的作用，显而易见的是，其被包含在具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质中。

如本文所用，术语“同源性”指代两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。同源性指代与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，且可表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的同源序列被表示为“％同源性”。从一个部分到另一部分的序列之间的同源性可通过本领域已知的技术确定。例如，可使用用于计算参数(例如，评分、同一性、和相似性)的标准软件(即，BLAST 2.0)或通过Southern杂交实验比较序列确认同源性。可通过本领域技术人员已知的方法确定待限定的适当的杂交条件(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2^ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。

如本文所用，术语“修饰”、“修饰的”、或“变体”指代在一种稳定表型中显示可遗传或不可遗传交替的培养物或个体。具体地，这些术语可指代其中因为与野生型、天然型、或非修饰型相比，与具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质对应的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸被修饰而有效增加其活性的变体；其中异亮氨酸、苏氨酸、或其类似物或衍生物的反馈抑制被释放的变体；或其中活性增加和反馈抑制释放均实现的变体。

在本公开中，术语“修饰的高丝氨酸脱氢酶”可与“高丝氨酸脱氢酶变体”互换使用。同时，这种变体可以是非天然发生的。

具体地，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是具有多肽的修饰的蛋白质，所述多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用组氨酸取代氨基酸序列第407位的氨基酸。具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列如上所述，并且可以是，例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列。另外，“第407位氨基酸”可指代对应于从SEQ ID NO:1的氨基酸序列N端的第407位氨基酸的位置处的氨基酸，且具体地，可指代从SEQ ID NO:1的氨基酸序列N端的第407位的氨基酸。第407位的氨基酸可以是其中精氨酸被组氨酸取代的氨基酸。更具体地，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白质。另外，蛋白质不排除可由于在氨基酸序列的上游或下游添加无义序列而发生的突变、天然发生突变、或其中的沉默突变，且具有与修饰的高丝氨酸脱氢酶活性相同或对应的活性的任何蛋白质对应于具有本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质。作为具体实例，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的蛋白质，或由与以上氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％同源性的氨基酸序列组成，同时从SEQ ID NO:1的氨基酸序列N端第407位的氨基酸是固定的(fixed)蛋白质。

另外，与野生型或天然蛋白质、或具有高丝氨酸脱氢酶活性的非修饰蛋白不同，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是其中最终产物(即，异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、高丝氨酸、或其衍生物或类似物)的反馈抑制被释放或脱敏的修饰的高丝氨酸脱氢酶。如本文所用，术语“反馈抑制”是指代谢的最终产物阻止早期反应。因此，当释放或脱敏高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制时，与不释放或不脱敏反馈抑制时相比，可改善高丝氨酸和高丝氨酸衍生的L-氨基酸的生产能力。

高丝氨酸衍生的L-氨基酸指代可使用L-高丝氨酸作为前体被生物合成的L-氨基酸，并且只要其是可由L-高丝氨酸生物合成的物质，就没有限制。高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅可包括高丝氨酸衍生的L-氨基酸，还可包括其衍生物。例如，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、和/或甘氨酸，但高丝氨酸衍生的L-氨基酸不限制于此。更具体地，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、和/或L-甲硫氨酸，但高丝氨酸衍生的L-氨基酸不限制于此。

本公开的另一方面提供了编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸。

高丝氨酸脱氢酶和变体(修饰的高丝氨酸脱氢酶)如上所述。

如本文所用，术语“多核苷酸”指代由以长链(例如，具有预定或较长长度的DNA或RNA链)共价键合的核苷酸单体构成的核苷酸聚合物，且更具体地，其指代编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸片段。只要其具有编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的修饰蛋白的多核苷酸序列，就可没有限制地包括编码本公开的修饰蛋白的多核苷酸。

在本公开中，编码高丝氨酸脱氢酶变体的氨基酸序列的多核苷酸可具体地源自棒状杆菌属微生物，且更具体地源自谷氨酸棒状杆菌。然而，微生物不限制于此。

另外，由于密码子简并性或考虑到其中表达蛋白质的有机体中优选的密码子，在编码蛋白质的多核苷酸中，可在编码区中进行各种修饰而不改变蛋白质的氨基酸序列。具体地，多核苷酸可以是包括编码蛋白质的多核苷酸序列或与以上多核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、或至少97％同源性的多核苷酸序列的多核苷酸。另外，显而易见的是，只要其是编码具有以上同源性并表现出与以上蛋白质基本相同或对应作用的蛋白质的多核苷酸序列，在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的多核苷酸序列就也可属于本公开的范围。编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸可具有编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，多核苷酸可具有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，但不限制于此。另外，编码本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸可具有编码在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代的多肽的多核苷酸序列，且具体地，可具有编码SEQ ID NO:8的多核苷酸序列。例如，多核苷酸可具有SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，但不限制于此。

另外，也可没有限制地包括由已知基因序列——例如，在严格条件下与多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的任何序列——制备的探针。“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件具体地描述于文献(例如，J.Sambrook等人，同上)中。严格条件可包括，例如，具有高同源性，80％或更高同源性、具体地90％或更高同源性、更具体地95％或更高同源性、更具体地97％或更高同源性、仍然更具体地99％或更高同源性的基因彼此杂交，而同源性低于以上同源性的基因彼此不杂交的条件；或Southern杂交的普通洗涤条件(即，在盐浓度和温度对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS下，具体地，60℃、0.1×SSC、0.1％SDS下，且更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS下洗涤一次，具体地，洗涤两次或三次)。杂交需要两个多核苷酸含有互补序列，尽管根据杂交的严格性而可在碱基之间发生错配。术语“互补的”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可包括与整个序列以及与其基本相似的核苷酸序列互补的分离核苷酸片段。具体地，可使用杂交条件检测具有同源性的多核苷酸，所述杂交条件包括在上述条件下在55℃的T_m值下的杂交步骤。进一步，T_m值可以是60℃、63℃、或65℃，但不限制于此，并且可由本领域技术人员根据其目的而适当地调控。杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，且这些变量是本领域公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50–9.51,11.7–11.8)。

本公开的又一方面提供了包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。具体地，本公开提供了包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的棒状杆菌属微生物。

高丝氨酸脱氢酶和变体如上所述。

具体地，包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物指代天生具有产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸能力的微生物，或其中产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力被赋予其缺乏产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸能力的亲株的微生物。具体地，包含高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是能够表达修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列第407位的氨基酸被组氨酸取代，但微生物不限制于此。微生物可以是细胞或微生物，其包含编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸，或者是能够用包含编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸的载体转化来表达修饰的多肽。出于本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是包括修饰的多肽的能够产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的任何微生物。

与野生型或包括具有未修饰的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的微生物相比，包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物具有改善的产生高丝氨酸和高丝氨酸衍生的L-氨基酸能力。因此，可从包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物获得高产量的高丝氨酸和高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

在本公开中，包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物的类型没有特别限制，但可以是肠杆菌属(genus Enterobacter)微生物、埃希氏菌属(genus Escherichia)微生物、欧文氏菌属(genus Erwinia)微生物、沙雷氏菌属(genus Serratia)微生物、假单胞菌属(genusPseudomonas)微生物、普罗威登斯菌属(genus Providencia)微生物、棒状杆菌属(genusCorynebacterium)微生物、或短杆菌属(genus Brevibacterium)微生物。更具体地，微生物可以是棒状杆菌属微生物。

在本公开中，“棒状杆菌属微生物”可具体地是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但棒状杆菌属微生物不限制于此。更具体地，在本公开中，棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。

同时，包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是向其中引入包括编码高丝氨酸脱氢酶变体的多核苷酸的载体的微生物。具体地，引入可通过转化来进行，但引入的方法不限制于此。

如本文所用，术语“载体”指代包括编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中靶蛋白可操作地连接至合适的控制序列，使得靶蛋白可在适当的宿主中表达。控制序列可包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列、和控制转录和翻译终止的序列。转化进入合适的宿主细胞后，载体可与宿主基因组无关地复制或起作用，或者可被整合到宿主基因组本身中。

只要其能够在宿主细胞中复制，本公开中使用的载体就没有特别限制，且可使用本领域已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒、和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或黏粒载体；且pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等可用作质粒载体。具体地，可使用载体pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等，但载体不限制于此。

可用于本公开的载体没有特别限制，且可使用任何已知的表达载体。另外，可通过用于染色体***的载体将编码靶蛋白的多核苷酸***染色体中。可通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)将多核苷酸***染色体中，但方法不限制于此。载体可进一步包括选择标记(selection marker)，以确认将多核苷酸***染色体中。选择标记用于筛选用载体转化的细胞，即，用于确定是否***多核苷酸分子。可使用提供可选择的表型(例如，抗药性、辅源营养、对细胞毒性剂的抗性、或表面蛋白的表达)的标记。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞能够存活，或者细胞可显示不同的表型，因此可通过此方法选择转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”指代将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，以这样的一种方式在宿主细胞中表达多核苷酸编码的蛋白质。只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸无论是被整合到宿主细胞的染色体中并置于其中或是位于染色体外都是无关紧要的。进一步，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。只要其可被引入宿主细胞中并在其中表达，就可以任意形式引入多核苷酸。例如，可以表达盒的形式将多核苷酸引入宿主细胞中，所述表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒可包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止子、核糖体结合位点、或翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以原样引入宿主细胞中，并可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列，但多核苷酸的引入方法不限制于此。转化方法包括将多核苷酸引入细胞中的任何方法，且其可通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术来进行。方法的实例包括电穿孔、磷酸钙(Ca(H₂PO₄)₂、CaHPO₄、或Ca₃(PO₄)₂)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法、乙酸锂-DMSO方法等，但转化方法不限制于此。

另外，术语“可操作的连接”是指启动和介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸转录的启动子序列功能性地连接至多核苷酸序列。可使用本领域已知的基因重组技术制备可操作的连接，并且可使用已知的限制酶和连接酶制备位点特异性DNA切割和连接，但可操作的连接的方法不限制于此。

包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是已被转化以在棒状杆菌属微生物中包括修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。例如，棒状杆菌属微生物可包括对2-氨基-3-羟基-戊酸(AHV)抗性的菌株；通过用赖氨酸取代亮氨酸(即，天冬氨酸激酶(lysC)第377位的氨基酸)以解决lysC(即，作用于苏氨酸的生物合成途径的第一个重要的酶)的反馈抑制而产生L-苏氨酸的菌株；通过用丙氨酸取代ilvA基因第323位的氨基酸而产生L-异亮氨酸的菌株，所述ilvA基因在产生L-苏氨酸的菌株中编码L-苏氨酸脱水酶(即，作用于异亮氨酸的生物合成途径的第一个酶)(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345–4351)；通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶失活产生O-乙酰高丝氨酸的菌株，所述O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶参与O-乙酰高丝氨酸和胱硫醚γ-合酶的降解途径；或通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活而产生甲硫氨酸的菌株，但棒状杆菌属微生物的菌株不限制于此。

本公开的又一方面提供了用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，包括：在培养基中培养上述微生物。

用于产生L-氨基酸的方法可包括从培养的微生物或培养基中回收高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

如上所述，微生物可以是包含本公开的高丝氨酸脱氢酶变体的棒状杆菌属微生物，且更具体地可以是谷氨酸棒状杆菌。另外，棒状杆菌属微生物或谷氨酸棒状杆菌可以是产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的微生物。高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅可包括高丝氨酸衍生的L-氨基酸，还可包括其衍生物。例如，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、和/或甘氨酸，但高丝氨酸衍生的L-氨基酸不限制于此。更具体地，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、和/或L-甲硫氨酸，但高丝氨酸衍生的L-氨基酸不限制于此。

高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是由本公开中描述的微生物产生的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的培养基，或可以是纯化形式。对于本领域技术人员显而易见的是，高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅包括其本身，还包括其盐。

在本领域已知的优化培养条件和酶活性条件下，本领域技术人员可容易地确定用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法。

在以上方法中，可以本领域已知的分批方法(batch process)、连续方法、补料分批方法(fed-batch process)等培养微生物，但培养方法不特别限制于此。具体地，关于培养条件，可用适当的碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH 5至pH 9，具体地pH 6至pH 8，且最具体地pH 6.8)，可通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来维持培养物的需氧条件。培养温度通常可在20℃至45℃的范围内，且具体地25℃至40℃，持续约10至160小时，但培养条件不限制于此。通过培养过程产生的苏氨酸、异亮氨酸、或乙酰高丝氨酸可被分泌到培养物中或可保留在细胞中。

另外，作为培养基的碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如，大豆油、向日葵油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇类(例如，甘油和乙醇)；有机酸(例如乙酸)等可单独使用或组合使用，但碳源不限制于此。作为培养基的氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁(meat gravy)、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可单独使用或组合使用，但氮源不限制于此。作为培养基的磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、对应的含钠盐等可单独或组合使用，但磷源不限制于此。另外，培养基可含有是必需的生长促进物质的其它金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等。

在本公开中，用于回收培养过程中产生的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法可通过使用本领域中已知的适当方法从培养液(culture broth)中收集目标产物来进行。例如，可使用诸如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等方法，且可使用本领域已知的适当方法从培养基或培养的微生物中回收目标物质(其是高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸)。进一步，回收可包括另外的纯化过程，并且可使用本领域已知的适当方法进行。

本公开的又一方面提供了用于增加高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的产生的修饰的高丝氨酸脱氢酶的应用。

本公开的又一方面提供了用于增加微生物中高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的产生的方法，其包括增强修饰的高丝氨酸脱氢酶的活性。

如本文所用，术语“待表达/表达”指代其中将靶蛋白引入微生物中，或者在微生物中存在蛋白质的情况下，与其内源蛋白质活性或其修饰前的活性相比，蛋白质的活性增强的状态。

具体地，术语“蛋白质的引入”是指微生物表现出微生物中最初不具有的特定蛋白质的活性，或者微生物与其内源活性或修饰前的蛋白活性相比表现出增强的活性。例如，其可指将编码特定蛋白质的多核苷酸引入微生物的染色体中或将含有编码特定蛋白质的多核苷酸的载体引入微生物中，从而表现出其活性。另外，术语“活性增强”是指与其内源活性或修饰前的活性相比，特定蛋白质的活性得到改善。术语“内源蛋白质”指代微生物的亲株最初具有的特定蛋白质的活性，其中微生物的性状由于由天然或人工因子引起的遗传修饰而改变的情况。

具体地，在本公开中，活性的增强可通过以下方法中的一种或多种来实现：增加编码蛋白质变体的基因的细胞内拷贝数的方法；将修饰引入编码蛋白质变体的基因的表达控制序列中的方法；用具有强活性的序列替代编码蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法；用编码蛋白质变体的基因替代编码具有高丝氨酸脱氢酶活性的染色体上的天然蛋白的基因的方法；将进一步修饰引入编码具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的基因中，以增强蛋白质变体的活性的方法；和将蛋白质变体引入微生物的方法，但方法不限制于此。

在上文中，基因的拷贝数可以将基因可操作地连接至载体的形式或通过将基因***宿主细胞的染色体中来增加，但方法不特别限制于此。具体地，基因的拷贝数可通过将载体引入宿主细胞来增加，其中载体与编码本公开的蛋白质的多核苷酸可操作地连接，并且无论宿主细胞如何都能够复制和起作用。可选地，基因的拷贝数可通过将可操作地连接多核苷酸的载体引入宿主细胞的染色体中来增加。可通过本领域已知的方法(例如，同源重组)实现多核苷酸向染色体的***。

然后，为了增加多核苷酸的表达，可通过缺失、***、非保守或保守取代、或其组合在其中诱导修饰以进一步增强表达控制序列的活性；或通过用具有较强活性的核算序列替代表达控制序列来修饰表达控制序列，但修饰的方法不特别限制于此。表达控制序列可包括启动子、操纵序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等，但表达控制序列不限制于此。

强启动子可连接至多核苷酸的表达单元的上游区域而不是原始启动子，但方法不限制于此。本领域已知的强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(KR专利号10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(KR专利号10-1783170)、O2启动子(KR专利号10-1632642)、tkt启动子、yccA启动子等，但启动子不限制于此。

进一步，染色体上多核苷酸序列的修饰可通过缺失、***、非保守或保守取代、或其组合在表达控制序列上诱导修饰以进一步增强多核苷酸序列的活性；或通过用被修饰为具有较强活性的多核苷酸序列替代多核苷酸序列来进行，但修饰的方法不特别限制于此。

基于野生型或未修饰微生物菌株中的蛋白质的活性或浓度，如上所述的蛋白质活性的引入和增强通常可将相应蛋白质的活性或浓度增加至少1％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％、和至多1,000％或2,000％，但范围不限制于此。

具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列、第407位的氨基酸、和微生物如上所述。

具体实施方式

下文中，将通过示例性实施方式详细描述本公开。然而，这些示例性实施方式仅用于示例性目的，而不意图限制本公开的范围。

实施例1：通过人工修饰筛选AHV抗性的微生物

在此实施例中，使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881(KR专利号0159812)作为亲株进行赋予对2-氨基-3-羟基-戊酸酯(下文中，“AHV”)(其是L-苏氨酸类似物)的抗性的实验，以释放高丝氨酸脱氢酶(下文中，“Hom”，EC:1.1.1.3)的L-苏氨酸的反馈抑制。

通过使用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(下文中，“NTG”)的人工修饰方法诱导修饰。将已在种子培养基(seed medium)中培养18小时的KFCC10881菌株接种到4mL的种子培养基中，然后培养直至OD₆₆₀达到约1.0。离心培养基以回收细胞，然后用50mM Tris-苹果酸盐缓冲液(pH 6.5)洗涤细胞两次，并悬浮在最终的4mL相同缓冲液中。将NTG溶液(在0.05MTris-苹果酸盐缓冲液(pH 6.5)中为2mg/mL)添加到细胞悬浮液中，以具有150mg/L的最终浓度，然后在室温下静置20分钟。此后，通过离心回收细胞，并用相同的缓冲液洗涤两次以除去NTG。将最终洗涤的细胞悬浮在4mL的20％甘油溶液中，然后在-70℃下储存直至使用。将NTG处理的菌株接种到含有3g/L的AHV基本培养基上，然后通过以上程序获得126种源自KFCC10881的AHV抗性菌株。

种子培养基(pH 7.0)

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄4g、K₂HPO₄8g、MgSO₄ 7H₂O0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)

基本培养基(pH 7.2)

葡萄糖5g、KH₂PO₄1g、(NH₄)₂SO₄5g、MgSO₄ 7H₂O 0.4g、NaCl 0.5g、生物素200μg、硫胺素HCl 100μg、泛酸钙100μg、烟酰胺0.03g、尿素2g、Na₂B₄O₇ 10H₂O 0.09mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₇4H₂O 0.04mg、ZnSO₄ 7H₂O 0.01mg、CuSO₄ 5H₂O、MnCl₂ 4H₂O 0.01mg、FeCl₃ 6H₂O 1mg、CaCl₂0.01mg(基于1L蒸馏水)

实施例2：源自KFCC10881的AHV抗性菌株的L-苏氨酸产生测试

对实施例1中获得的126种AHV抗性菌株进行L-苏氨酸产生能力的测试。将实施例1中获得的126种菌株各自(each)接种到含有种子培养基(25mL)的角挡板烧瓶(corner-baffled flask)(250mL)中，然后在30℃下、以200rpm振荡下培养20小时。将种子培养基(1mL)接种到以下含有L-苏氨酸产生培养基(24mL)的每个角挡板烧瓶(250mL)中，然后在30℃下、以200rpm振荡下培养48小时。

L-苏氨酸产生培养基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄40g、蛋白胨2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、亮氨酸400mg、CaCO₃20g(基于1L蒸馏水)

培养后，利用HPLC测量产生的各种氨基酸的量。表1中显示了前5种菌株(在实验的126种菌株中，这5种菌株显示出具有优异的L-苏氨酸产生能力)的培养基中的氨基酸浓度。通过以上程序确认的5种候选菌株被命名为KFCC10881-1至KFCC10881-5。

[表1]优异的AHV抗性菌株的L-苏氨酸产生的实验

	OD	Thr	Hse	Gly	Ile	Lys	Thr+Hse+Gly+Ile
								KFCC10881	60.1	0.0	0.1	0.2	0.0	12.3	0.3
KFCC10881-1	53.6	4.1	1.3	1.4	1.2	2.0	8.0
								KFCC10881-2	53.3	2.2	0.9	1.0	1.1	8.3	5.2
KFCC10881-3	68.5	1.5	1.2	1.1	0.2	10.8	4.0
								KFCC10881-4	59.1	1.2	0.9	1.0	0.7	1.9	3.8
KFCC10881-5	49.6	2.4	1.1	1.2	0.9	5.4	5.6

如表1所示，与对照组相比，由具有对AHV抗性的5种菌株产生的L-苏氨酸、L-高丝氨酸、甘氨酸、L-丙胺酸、和L-异亮氨酸的量增加，而产生的L-赖氨酸的量减少。

L-苏氨酸和L-赖氨酸的生物合成途径与天冬氨酸-半醛(下文中，“ASA”)作为分支点分离。即，随着产生的L-苏氨酸的量增加，产生的L-赖氨酸的量减少。因此，随着产生的L-苏氨酸的量增加，可增加可作为L-苏氨酸生物合成途径的副产物的高丝氨酸(Hse)、甘氨酸(Gly)、和L-异亮氨酸(Ile)的量，因此也确认了其产生的总量(Thr+Hse+Gly+Ile)。

因此，在以上AHV抗性菌株中，选择显示出减少的L-赖氨酸产生量、高L-苏氨酸产生量、和高(Thr+Hse+Gly+Ile)产生总量的KFCC10881-1菌株作为最优异的AHV抗性菌株。

实施例3：源自KFCC10881的具有优异的产生苏氨酸能力的菌株的核苷酸序列分析

为分析以上实施例2中选择的菌株的L-苏氨酸生物合成酶的核苷酸序列，进行以下实验。基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)提供的基因信息，获得了编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的高丝氨酸脱氢酶的hom(SEQ ID NO:2，NCgl1136)的核苷酸序列和编码高丝氨酸激酶的thrB(SEQ ID NO:3，Gene No.NCgl1137)的核苷酸序列中的每一个。已知hom和thrB基因均具有操纵子结构(Peoples等人，Mol.Biol.2(1):63–72,1988)。

为获得含有选择菌株的hom-thrB操纵子的DNA片段，使用该菌株的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物组进行PCR。PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：30个循环的变性(96℃下30秒)、退火(52℃下30秒)、和聚合(72℃下3分钟)。结果，扩增基因片段(2,778bp；SEQ ID NO:6)是可能的，其包括含有SEQ ID NO:2的起始密码子的上游启动子区的核苷酸序列(300bp)至SEQ IDNO:3的终止密码子的下游200bp。

通过ABI PRISM 3730XL分析仪(96毛细管型；Applied Biosystems)使用制备的引物确定核苷酸序列。在对应于KFCC10881-1菌株的hom-thrB操纵子的hom的核苷酸序列中，鸟嘌呤(即，SEQ ID NO:2的第1,220位的核苷酸)被修饰为腺嘌呤，因此编码精氨酸残基的CGT基因密码子被修饰为编码组氨酸残基的CAT基因密码子(下文中，“R407H修饰”；SEQ IDNO:7)。同时，在对应于SEQ ID NO:3的thrB基因中未发现修饰。

从以上核苷酸序列分析中可得出结论，通过将KFCC10881-1菌株中的Hom(SEQ IDNO:8)的精氨酸(即，第407位氨基酸残基)修饰为组氨酸(下文中，“R407H修饰”)而使L-苏氨酸的反馈抑制脱敏。

实施例4：引入高丝氨酸脱氢酶的新菌株的制备

制备SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物组，以制备其中实施例2鉴定的变体(R407H)被引入其野生型菌株的菌株。

为制备引入每种R407H hom修饰的菌株，使用从KFCC10811-1菌株提取的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物组进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：28个循环的变性(95℃下30秒)、退火(55℃下30秒)、和聚合(72℃下2分钟)。结果，获得了包括hom基因(1,338bp)的启动子区(约300bp)的基因片段(1,668bp)。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增产物，并将扩增产物用作用于载体制备的***DNA片段。同时，用限制酶SmaI处理后，在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(KR专利号10-0924065)与通过以上PCR扩增的***DNA片段的摩尔浓度(M)的比被设定为1:2，并根据制造商的手册使用输注克隆试剂盒(Infusion Cloning Kit)(TaKaRa)克隆载体，从而制备用于将R407H修饰引入染色体中的载体pDZ-R407H。

通过电穿孔将pDZ-R407H载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中并经历二次交换，从而获得其中将修饰的核苷酸的取代引入染色体的菌株。使用以下列出的引物组和突变等位基因特异性扩增(Mutant Allele Specific Amplification)(MASA)PCR技术(Takeda等人，Hum.Mutation,2,112–117(1993))，主要通过选择使用对应于修饰的序列(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)的引物组扩增的菌株来确定取代的适当性。另外，对选择菌株的hom序列进行分析，以使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13的引物组并通过以与实施例2相同的方式分析修饰的序列来二次确认取代的适当性。用修饰的核苷酸取代的菌株被命名为CA09-0900。

菌株CA09-0900于2018年12月14日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并被指定保藏号KCCM12418P。

实施例5：高丝氨酸脱氢酶活性的测量

在制备的菌株中测量酶Hom的活性。野生型菌株ATCC13032(对照组)和实施例4中制备的CA09-0900菌株各自被接种到25mL种子培养基中，并培养直至菌株达到对数期晚期(late log phase)。通过离心回收每种菌株的细胞，用0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.6)洗涤两次，并最后悬浮在2mL含有浓度为30％的甘油的相同缓冲液中。通过常规玻璃珠涡旋方法(glass bead vortexing method)将每种细胞悬浮液物理破碎10分钟，每种上清液通过两次离心(13,000rpm、4℃、30分钟)回收，并用作粗提取物，用于测量Hom的活性。为测量Hom的活性，将辅酶溶液(0.1mL)添加到用于测量酶活性的反应溶液(磷酸钾(pH 7.0)缓冲液、25mM NADPH、5mM天冬氨酸半醛)中并在30℃下反应。Hom酶活性U被定义为根据L-苏氨酸(0mM，10mM)的存在每分钟消耗的NADPHμmol的数量，并且酶活性的测量结果显示于下表2中。

[表2]

Hom活性(U)的测量和L-苏氨酸的脱敏作用

作为实验结果，确认了在包括R407H修饰的Hom中，与野生型Hom不同，在含有10mML-苏氨酸的条件下，活性的抑制降低，因此确认发生对L-苏氨酸的脱敏。

实施例6：具有L-苏氨酸产生能力的棒状杆菌属微生物菌株的制备和评价

从野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032开发产生L-苏氨酸的菌株。具体地，为解决天冬氨酸激酶(lysC)(即，首先在苏氨酸生物合成途径中起作用的重要酶)的反馈抑制，用赖氨酸(SEQ ID NO:14)取代亮氨酸(即，lysC的第377位的氨基酸)。

更具体地，为制备其中引入lysC(L377K)修饰的菌株，使用ATCC13032的染色体作为模板以及SEQ ID NOS:15和16或SEQ ID NOS:17和18的引物组进行PCR。PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)用作用于PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：28个循环的变性(95℃下30秒)、退火(55℃下30秒)、和聚合(72℃下1分钟)。结果，以lysC基因的修饰位点为中心，各自获得5′上游区域中的DNA片段(515bp)和3′下游区域中的DNA片段(538bp)。用两个扩增的DNA片段作为模板以及SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18的引物组进行PCR。PCR如下进行：95℃下变性5分钟；28个循环的变性(95℃下30秒)、退火(55℃下30秒)、和聚合(72℃下2分钟)；并在72℃下聚合5分钟。结果，扩增了包括编码天冬氨酸激酶变体的lysC基因修饰的DNA片段(1,023bp)，在所述天冬氨酸激酶变体中，第377位的亮氨酸被赖氨酸取代。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增产物，并用作用于载体制备的***DNA片段。同时，用限制酶SmaI处理后，在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(KR专利号10-0924065)与通过以上PCR扩增的***DNA片段的摩尔浓度(M)的比被设定为1:2，并根据制造商的手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆载体，从而制备用于将L377K修饰引入染色体中的载体pDZ-L377K。

将制备的pDZ-L377K载体转化到ATCC13032菌株中并经历二次交换，从而获得其中修饰的核苷酸取代被引入染色体中的菌株。该菌株被命名为CJP1。CJP1菌株再次被命名为CA01-2307，其于2017年3月29日保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并被指定保藏号KCCM12000P。

为清楚地确认以上菌株的L-苏氨酸产生的变化，将实施例4中鉴定的修饰引入编码高丝氨酸脱氢酶的基因中。具体地，为将R407H修饰引入CJP1菌株中，通过电穿孔将实施例4中制备的pDZ-R407H载体转化到CJP1菌株中并经历二次交换，从而获得其中修饰的核苷酸被引入染色体中的菌株。用修饰的核苷酸取代的菌株被命名为CJP1-R407H。

[表3]

制备菌株的L-苏氨酸产生能力的确认

结果，在引入修饰的菌株中，与CJP1菌株(对照组)相比，产生的L-赖氨酸的量减少，而产生的L-苏氨酸的量增加1.14g/L，因此确认脱敏作用的显著改善。

实施例7：产生L-异亮氨酸的棒状杆菌属微生物菌株的制备和评价

为制备产生异亮氨酸的菌株，制备用于增强在实施例6中制备的菌株中编码已知的L-苏氨酸脱水酶(异亮氨酸生物合成途径的第一个酶)的修饰基因ilvA(V323A)的表达的载体(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345–4351)。

具体地，为制备用于引入靶向基因ilvA的修饰的载体，以修饰位点为中心设计用于扩增5′上游区域的引物(SEQ ID NOS:19和20)对和用于扩增3′下游区域的引物(SEQ IDNOS:21和22)对。将BamHI限制酶位点***SEQ ID NOS:19和22的引物的每一端，并设计SEQID NOS:20和21的引物，使得核苷酸取代的修饰可位于待诱导交换的区域。

使用SEQ ID NOS:19、20、21、和22的引物，以野生型菌株的染色体作为模板进行PCR。PCR如下进行：95℃下变性5分钟；30个循环的变性(95℃下30秒)、退火(55℃下30秒)、和聚合(72℃下30秒)；并在72℃下聚合7分钟。结果，以基因ilvA的修饰位点为中心，获得5′上游区域中的DNA片段(627bp)和3′下游区域中的DNA片段(608bp)。

使用两个扩增的DNA片段作为模板以及SEQ ID NOS:19和22的引物组进行PCR。PCR如下进行：95℃下变性5分钟；30个循环的变性(95℃下30秒)、退火(55℃下30秒)、和聚合(72℃下60秒)；并在72℃下聚合7分钟。结果，扩增了DNA片段(1,217bp)，其中DNA片段包括编码IlvA变体的基因ilvA的修饰，在IlvA变体中，第323位的缬氨酸被丙氨酸取代。用限制酶BamHI处理载体pECCG117(KR专利号10-0057684)和DNA片段(1,217bp)，使用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒。由此获得的质粒被命名为pECCG117-ilvA(V323A)。

通过电穿孔将pECCG117-ilvA(V323A)载体引入实施例6中制备的CJP1-R407H菌株，并平皿接种于含有卡那霉素(25mg/L)的选择性培养基上，以获得转化菌株。通过与实施例2相同的烧瓶培养方法培养由此获得的转化菌株，并分析培养基中L-异亮氨酸的浓度。其结果如下表4中所示。

[表4]

制备菌株的L-异亮氨酸生产能力的确认

菌株	L-异亮氨酸(g/L)
		CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)	0.7
CJP1-R407H/pECCG117-ilvA(V323A)	1.4

结果，确认与对照菌株相比，在包括hom(R407H)修饰的菌株中，L-异亮氨酸产生能力增加0.7g/L。

实施例8：被修饰的Hom取代的O-乙酰-高丝氨酸(OAH)产生菌株的制备和评价

8-1.被修饰的Hom取代的ATCC13032菌株的制备

以与实施例4相同的方式将R407H修饰引入ATCC13032菌株的hom基因中，且由此制备的菌株被命名为ATCC13032::Hom^FBR。

8-2.metB基因的缺失

在此实施例中，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板通过PCR获得在O-乙酰-高丝氨酸降解途径中编码胱硫醚γ合酶的metB基因。基于NationalInstitutes of Health的GenBank(NIH GenBank)，获得metB的核苷酸序列信息(NCBI注册号Ncgl2360；SEQ ID NO:23)。另外，基于此，合成含有metB基因的N端和连接体序列的引物(SEQ ID NOS:24和25)和含有metB基因的C端和连接体序列的引物(SEQ ID NOS:26和27)。使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS:24和25与SEQ IDNOS:26和27的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物组进行PCR。PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶。PCR如下进行：30个循环的变性(96℃下30秒)、退火(53℃下30秒)、和聚合(72℃下1分钟)；并在72℃下聚合7分钟。结果，获得了含有metB基因的N端和连接体的扩增基因(500bp)和含有metB基因的C端和连接体的扩增基因(500bp)。

使用两个由此获得的扩增基因作为模板以及SEQ ID NOS:24和27的引物组在以下条件下进行PCR：30个循环的变性(96℃下60秒)、退火(50℃下60秒)、和聚合(72℃下1分钟)；并在72℃下聚合7分钟。结果，获得扩增的ΔmetB基因(1,000bp)，其是含有metB基因的N端-连接体-C端的metB失活盒。通过PCR获得的metB基因用包括在末端的限制酶XbaI和SalI处理，然后经由连接克隆到预先用限制酶XbaI和SalI处理的pDZ载体中。此后，制备其中metB失活盒被最终克隆的重组pDZ-ΔmetB载体。

将制备的pDZ-ΔmetB载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和ATCC13032::Hom^FBR菌株中。在二次交换后，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔmetB和ATCC13032::Hom^FBRΔmetB菌株，其中染色体上的metB基因失活。最后通过使用SEQ ID NOS:24和27的引物组进行PCR，然后通过将该序列与其中metB基因未失活的ATCC13032菌株进行比较来确认失活的metB基因。

8-3.metY基因的缺失

在此实施例中，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板通过PCR获得在O-乙酰-高丝氨酸降解途径中编码O-乙酰高丝氨酸(硫醇)裂解酶的metY基因。基于National Institutes of Health的GenBank(NIH GenBank)，获得metY基因的核苷酸序列信息(NCBI注册号Ncgl0625；SEQ ID NO:28)。另外，基于此，合成含有metY基因的N端和连接体序列的引物(SEQ ID NOS:29和30)和含有metY基因的C端和连接体序列的引物(SEQ IDNOS:31和32)。

利用SEQ ID NOS:29和30与SEQ ID NOS:31和32的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物组，用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶。PCR如下进行：30个循环的变性(96℃下30秒)、退火(53℃下30秒)、和聚合(72℃下1分钟)；并在72℃下聚合7分钟。结果，获得含有metY基因的N端和连接体的扩增基因(500bp)和含有metY基因的C端和连接体的扩增基因(500bp)。使用两个由此获得的扩增基因作为模板以及SEQ ID NOS:29和32的引物组在以下条件下进行PCR：10个循环的变性(96℃下60秒)、退火(50℃下60秒)、和聚合(72℃下1分钟)；并在72℃下聚合7分钟。结果，获得扩增的ΔmetY基因(1,000bp)，其是含有metY基因的N端-连接体-C端的metY失活盒。

通过PCR获得的metY基因用包括在末端的限制酶XbaI和SalI处理，然后经由连接克隆到预先用限制酶XbaI和SalI处理的pDZ载体中。此后，制备了其中metY失活盒被最终克隆的重组pDZ-ΔmetY载体。

将制备的pDZ-ΔmetY载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、ATCC13032::Hom^FBR、ATCC13032ΔmetB、和ATCC13032::Hom^FBRΔmetB菌株中。在二次交换后，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔmetY、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY、ATCC13032ΔmetBΔmetY、和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY，其中染色体上的metY基因失活。最终通过使用SEQ ID NOS:29和32的引物组进行PCR，然后通过将该序列与其中metY基因未失活的ATCC13032进行比较来确认失活的metY基因。

8-4.产生O-乙酰-高丝氨酸的菌株的制备和评价

在实施例8-1至8-3中制备的ATCC13032、ATCC13032ΔmetB、ATCC13032ΔmetY、ATCC13032ΔmetBΔmetY、ATCC13032::Hom^FBR、ATCC13032::Hom^FBRΔmetB、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY、和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY菌株的O-乙酰-高丝氨酸产生能力之间进行了比较，其中缺失metB、metY、和metBY基因，并且其中修饰的hom基因被取代。

具体地，将单菌落在32℃培养箱中于固体LB培养基中培养过夜，并将每个单菌落的一个菌环量接种到O-乙酰-高丝氨酸滴度培养基(25mL)中，然后将所得物在32℃下、以250rpm培养42至64小时。通过HPLC分析来自每种培养物的O-乙酰-高丝氨酸，且其结果显示于下表5中。

O-乙酰-L-高丝氨酸产生培养基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄40g、蛋白胨2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄·7H₂O 0.5g、甲硫氨酸400mg、亮氨酸400mg、CaCO₃20g(基于1L蒸馏水)。

[表5]O-乙酰-高丝氨酸产生的评价

结果，如上表5所示，当培养对照菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032时，未积累O-乙酰-L-高丝氨酸；而对于ATCC13032ΔmetB、ATCC13032ΔmetY、和ATCC13032ΔmetBΔmetY菌株中的每一种，O-乙酰-L-高丝氨酸分别以0.3g/L、0.3g/L、和0.5g/L的量累积，其中metB、metY、和metBY基因失活。

另外，在其中hom基因以R407H的形式被取代的ATCC13032::Hom^FBR菌株，和其中metB、metY、和metBY基因分别失活的ATCC13032::Hom^FBRΔmetB、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY、和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY菌株的情况下，确认这些菌株中的每一种的O-乙酰-L-高丝氨酸以1.3g/L、1.5g/L、和3.7g/L量累积。

因此，从以上结果确认使用本公开的修饰的hom可显著增加高丝氨酸是其前体的目标氨基酸的产生量。

实施例9：产生L-甲硫氨酸的菌株的制备和评价

实施例9-1：用于mcbR基因缺失的重组载体的制备

在此实施例中，为制备产生甲硫氨酸的菌株，制备使mcbR基因失活的载体(J.Biotechnol.103:51–65,2003)，mcbR基因编码实施例6中制备的菌株中的已知甲硫氨酸和半胱氨酸转录调节蛋白。

具体地，使用以下方法制备重组质粒载体，以缺失棒状杆菌ATCC13032染色体上的mcbR基因。基于National Institutes of Health的GenBank(NIH GenBank)中报道的核苷酸序列，获得谷氨酸棒状杆菌的mcbR基因及其周围序列(SEQ ID NO:33)。

出于mcbR-缺失的目的，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NOS:34和35与SEQ ID NOS:36和37的引物组在以下条件下进行PCR：95℃下变性5分钟；30个循环的变性(95℃下30秒)；退火(53℃下30秒)、和聚合(72℃下30秒)；并在72℃下聚合7分钟。结果，获得DNA片段(700bp)。

用限制酶SmaI处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体和扩增的mcbR基因片段，用于染色体***。此后，使用DNA连接酶将它们连接，转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α中，并平皿接种于含有卡那霉素(25mg/L)的相同固体LB培养基上。选择用载体(其中通过PCR***目标基因的缺失片段)转化的菌落，并使用质粒提取方法获得质粒。由此获得的质粒被命名为pDZ-ΔmcbR。

实施例9-2：产生L-甲硫氨酸的棒状杆菌属微生物菌株的制备和评价

将通过染色体上的同源重组在实施例9-1中制备的pDZ-ΔmcbR载体转化到已经通过电穿孔在实施例6中制备的CJP1-R407H和CJP1菌株中的每一个中(van der Rest等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.52:541–545,1999)。此后，在含有X-gal的固体培养基上进行二次重组。使用SEQ ID NOS:38和39的引物组，通过PCR方法用转化的谷氨酸棒状杆菌菌株(其中已完成二次重组)确认其中缺失mcbR基因的菌株。这些重组菌株分别被命名为“CJP1-R407HΔmcbR”和“CJP1ΔmcbR”。

为分析制备的CJP1-R407HΔmcbR菌株的L-甲硫氨酸产生能力，将菌株与CJP1ΔmcbR菌株一起以下列方式培养。

将谷氨酸棒状杆菌CJP1/ΔmcbR和本发明的菌株(谷氨酸棒状杆菌CJP1-R407HΔmcbR)接种到含有以下种子培养基(25mL)的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下、以200rpm振荡培养20小时。此后，将种子培养基(1mL)接种到含有以下生产培养基(24mL)的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下、以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH 7.0)>

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)。

<生产培养基(pH 8.0)>

葡萄糖50g、(NH₄)₂S₂O₃ 12g、酵母提取物5g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 1.2g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)。

使用以上培养方法培养后，分析各培养基中的L-甲硫氨酸的浓度，结果如表6中所示。

[表6]制备菌株的L-甲硫氨酸产生能力的评价

结果，确认在包括R407H hom修饰的菌株中，与对照菌株相比，L-甲硫氨酸产生能力增加0.18g/L。

基于以上结果，确认使用本公开的修饰的hom可显著增加产生的L-甲硫氨酸的量。

综上所述，本公开涉及的技术领域的技术人员将能够理解，在不修改本公开的技术概念或本质特征的情况下，可以其它具体形式体现本公开。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于示例性目的，而不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方式，还涵盖可包括在由随附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替换、修改、等同物和其它实施方式。

关于用于专利步骤的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约

国际形式

CJ第一制糖株式会社由本页底部确定的国际保藏

CJ第一制糖中心，330，机构依照第7.1条发布的原

DONGHO-RO，JUNG-GU，始保藏收据

首尔100-400，

大韩民国

¹第6.4(d)条适用时，该日期是获得国际保藏机构状态的日期；于布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏机构状态后转变为布达佩斯条约下的保藏时，该日期是国际保藏机构收到该微生物的日期。

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DONGHO-RO，JUNG-GU，始保藏收据

首尔100-400，

大韩民国

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 修饰的高丝氨酸脱氢酶和使用其产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法

<130> OPA19096

<150> KR 10-2018-0167599

<151> 2018-12-21

<160> 41

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶

<400> 1

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 2

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hom基因

<400> 2

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> thrB基因

<400> 3

atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca 60

aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120

gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180

cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240

gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300

ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360

ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420

gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480

aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540

gcgctggttc ctaatttcca cgcatccacc gaagctgtgc gccgagtcct tcccactgaa 600

gtcactcaca tcgatgcgcg atttaacgtg tcccgcgttg cagtgatgat cgttgcgttg 660

cagcagcgtc ctgatttgct gtgggagggt actcgtgacc gtctgcacca gccttatcgt 720

gcagaagtgt tgcctattac ctctgagtgg gtaaaccgcc tgcgcaaccg tggctacgcg 780

gcataccttt ccggtgccgg cccaaccgcc atggtgctgt ccactgagcc aattccagac 840

aaggttttgg aagatgctcg tgagtctggc attaaggtgc ttgagcttga ggttgcggga 900

ccagtcaagg ttgaagttaa ccaaccttag 930

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ctgcgacagc atggaact 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

caacgacaaa cgcccatc 18

<210> 6

<211> 2778

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因片段

<400> 6

ctgcgacagc atggaactca gtgcaatggc tgtaaggcct gcaccaacaa tgattgagcg 60

aagctccaaa atgtcctccc cgggttgata ttagatttca taaatatact aaaaatcttg 120

agagtttttc cgttgaaaac taaaaagctg ggaaggtgaa tcgaatttcg gggctttaaa 180

gcaaaaatga acagcttggt ctatagtggc taggtaccct ttttgttttg gacacatgta 240

gggtggccga aacaaagtaa taggacaaca acgctcgacc gcgattattt ttggagaatc 300

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 360

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 420

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 480

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 540

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 600

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 660

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 720

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 780

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 840

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 900

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 960

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 1020

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 1080

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 1140

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 1200

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 1260

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1320

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1380

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1440

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1500

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1560

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1620

cgcctcgaaa gggactaatt ttactgacat ggcaattgaa ctgaacgtcg gtcgtaaggt 1680

taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct ggctttgaca ctttaggttt 1740

ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt ccatctggct tggaagtgga 1800

agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc tcccacctgg tggttaaagc 1860

tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct ggattgcgag tggtgtgcca 1920

caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct gcagcggcgg ttgctggtgt 1980

tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa gagcagattg ttcagttgtc 2040

ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct gtgctgggtg gagcagtggt 2100

gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca cagtatgctg ctgtaccact 2160

tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct aatttccacg catccaccga 2220

agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc gatgcgcgat ttaacgtgtc 2280

ccgcgttgca gtgatgatcg ttgcgttgca gcagcgtcct gatttgctgt gggagggtac 2340

tcgtgaccgt ctgcaccagc cttatcgtgc agaagtgttg cctattacct ctgagtgggt 2400

aaaccgcctg cgcaaccgtg gctacgcggc atacctttcc ggtgccggcc caaccgccat 2460

ggtgctgtcc actgagccaa ttccagacaa ggttttggaa gatgctcgtg agtctggcat 2520

taaggtgctt gagcttgagg ttgcgggacc agtcaaggtt gaagttaacc aaccttaggc 2580

ccaacaagga aggccccctt cgaatcaaga agggggcctt attagtgcag caattattcg 2640

ctgaacacgt gaaccttaca ggtgcccggc gcgttgagtg gtttgagttc cagctggatg 2700

cggttgtttt caccgaggct ttcttggatg aatccggcgt ggatggcgca gacgaaggct 2760

gatgggcgtt tgtcgttg 2778

<210> 7

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R407H

<400> 7