阅读说明：本技术 甲型流感通用型dna疫苗及其制备方法和应用 (Influenza A universal DNA vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 任志广 高玉伟 夏咸柱 窦悦 杨争艳 王铁成 陈明涛 赵永坤 李元果 冯娜 杨松 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用,本研究利用由流感病毒HA蛋白、M2e蛋白和NP蛋白高度保守性序列构建三种融合蛋白的基因,并将其克隆至pCDNA3.1(+)载体,构建出三种重组DNA疫苗pcDNA3.1-sHA,pcDNA3.1-mHA,pcDNA3.1-cHA。该DNA疫苗能用于预防哺乳类野生动物,如虎流感同源病毒和异源病毒等方面；本发明DNA疫苗的制备方法简单、成本低,免疫原性好、交叉保护性好,能满足大批量流感疫苗的制备需求,生物安全性、能激发机体对多种流感病毒的免疫。(The invention provides an influenza A universal DNA vaccine and a preparation method and application thereof, and the research utilizes influenza virus HA protein, M2e protein and NP protein highly conserved sequences to construct three fusion protein genes, and clones the three fusion protein genes to pCDNA3.1(+) vector to construct three recombinant DNA vaccines pcDNA3.1-sHA, pcDNA3.1-mHA and pcDNA3.1-cHA. The DNA vaccine can be used for preventing wild mammals, such as tiger influenza homologous virus and heterologous virus; the DNA vaccine of the invention has simple preparation method, low cost, good immunogenicity and cross protection, can meet the preparation requirement of mass influenza vaccines, has biological safety and can stimulate the immunity of organisms to various influenza viruses.)

甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，微生物领域及生物制药领域，特别涉及甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

流感病毒能引起人和动物的感染，流感大流行是给人类健康和社会经济带来大损失的灾难。它具有潜伏期短，发病急剧，传播速度快，并发症多等特点。在过去的一百年里，发生了四次的流感疫情大流行，有数亿人曾感染和数千万人因此丧命。自从1918年西班牙流感大流行后，英国科学家于1933年分离出第一株H1N1流感病毒株，这大大加快了人类对流感病毒的认识，在1940s首次出现了流感疫苗，这使人类防控流感病毒大流行成为了可能。

流感病毒根据内部核蛋白(NP)和外部基质蛋白(M)的抗原性差异，可将其分为甲(A)，乙(B)，丙(C)三种类型，其中甲型流感病毒根据血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)进一步分型，其中HA分为17种亚型，NA分为9种亚型，能互相组合成153个血清型甲型流感病毒。接种疫苗是防控流感流行的最佳手段。现有的疫苗能对同亚型的流感病毒感染起到良好的预防效果，但对不同亚型的流感病毒感染几乎无效。流感病毒具有高度变异性，想要有效防止流感大爆发，需要每年都更新流感疫苗候选株，世界卫生组织(WHO)会根据大数据分析去预测下一年的流感疫苗候选株，一般会预测3-4个候选株，其中包括一个H1N1亚型，一个H3N2亚型，B型流感的1或2个谱系，以此制备出三价或四价的流感灭活疫苗。能否预测成功会直接影响当季疫苗的保护效率。从确定候选株到商品化疫苗上市需要时间较长，如果预测失败，将会直接导致当季的流感大流行，无法快速重新制备出有效的流感疫苗。因此，研制出一种高效的具有广谱保护活性的通用型流感疫苗对于预防流感流行具有重要意义。

目前上市的疫苗结合其他防控措施在控制扩散和清除流感疫情方面有着良好的临床表现，疫苗接种仍是防控流感的保守措施之一。但仍存在负面影响和潜在威胁。为解决这些问题，新型的流感疫苗的应用有待继续深入探索和研发。

发明内容

为在现有技术的基础上更进一步，本发明的目的在于解决现有流感疫苗产生的免疫保护力为短效窄谱，提供一种由3种融合蛋白和真核表达载体组成的甲型流感通用型DNA疫苗。该疫苗可以对多季多亚型甲型流感疫苗提供保护，减少感染，对流感防控具有十分重要的意义。

本发明提供了一种甲型流感通用型DNA疫苗，所述疫苗包括血凝素融合蛋白过表达质粒。

进一步，所述血凝素基因来自H5N1流感病毒。

在本发明中用作对照的HA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，本发明的一种融合蛋白为sHA，其包括HA，M2e，NP的全部或部分抗原表位。优选地，sHA还包括HA蛋白的蜂毒信号肽和跨细胞膜区片段。

更进一步，sHA从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+NP的两段保守序列+5×M2e(来自不同亚型，不同种属)+HA2，序列间用连接肽连接。

在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白sHA的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，本发明的一种融合蛋白为mHA，其包括HA的全部或部分抗原表位。优选地，mHA还包括HA蛋白的蜂毒信号肽和跨细胞膜区片段。

更进一步，mHA从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+HA的3段保守序列(HA1的E14-H37+HA1的N286-N319+HA2的T41-S113)，序列间用连接肽连接。

在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白mHA的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，本发明的一种融合蛋白为cHA，其包括HA，M2e，NP的全部或部分抗原表位。优选地，cHA还包括HA蛋白的蜂毒信号肽和跨细胞膜区片段。

更进一步，cHA从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+HA1的E14-H37间的保守序列+NP的2段保守序列+5×M2e(来自不同亚型，不同种属)+HA的两段保守序列(HA1的N286-N319+HA2的T41-S113)+HA跨膜区，序列间用连接肽连接。

在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白cHA的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述质粒包括但不限于pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pBJ。

在本发明的具体实施方案中，所述质粒是pcDNA3.1。

本发明提供了前面所述的疫苗的制备方法，所述制备方法包括将血凝素融合蛋白编码基因与质粒连接。

具体地，所述制备方法步骤如下：

(1)通过基因合成的方法获得融合蛋白sHA，mHA，cHA编码基因，将pCDNA3.1(+)载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶：EcoRI-HF和NotI-HF，利用内切酶处理获得目的基因片段与真核表达载体的线性形式；

(2)回收目的片段与载体片段，连接转化筛选阳性菌落后，提取质粒并进行酶切鉴定；

(3)将步骤(2)获得的阳性质粒表达获得甲型流感通用型DNA疫苗。

进一步，sHA编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，mHA的编码基因序列如SEQ IDNO.2所示，cHA的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了前面所述的DNA疫苗在制备预防或免疫治疗甲型流感的药物中的应用。优选地，所述甲型流感包括同源H5N1病毒和异源H1N1和H3N2病毒引起的甲型流感。

本发明提供了前面所述的血凝素在制备甲型流感通用型DNA疫苗中的应用，优选地，所述甲型流感包括同源H5N1病毒和异源H1N1和H3N2病毒引起的甲型流感。

本发明提供了前面所述的血凝素融合蛋白在制备甲型流感通用型DNA疫苗中的应用，优选地，所述甲型流感包括同源H5N1病毒和异源H1N1和H3N2病毒引起的甲型流感。

本发明提供了前面所述的血凝素融合蛋白过表达质粒在制备甲型流感通用型DNA疫苗中的应用，优选地，所述甲型流感包括同源H5N1病毒和异源H1N1和H3N2病毒引起的甲型流感。

在本发明的具体实施方案中，同源病毒是H5N1，异源病毒包括H1N1、H3N2。

本发明前面所述的DNA疫苗除了包含前面所述的血凝素融合蛋白过表达质粒，还可以包含佐剂。

进一步，可用于本发明的佐剂包括MF59、AS02、Montani-de ISA251和ISA2720、、聚乙交酯、(PLG)微粒、免疫刺激复合体(immune response-stimulating complexes,ISCOMs)及脂质DC-Chol、CpG-ODN、单磷脂A(MPLA)、OM2174、不耐热肠毒素(LT)及其突变体。

相对于现有技术，本发明的有益效果为DNA疫苗作为一种疫苗生产方式，可将编码目的抗原的基因直接接种于体内，与佐剂混合接种可诱导较强的细胞免疫与体液免疫，具有操作简单﹑安全性高﹑免疫应答持久﹑易于储存和运输等优点。小鼠实验证明对同源和异源病毒具有良好的免疫和预防效果。

附图说明

图1显示本发明的融合蛋白mHA、sHA和cHA构成示意图；

图2显示本发明的重组质粒的双酶切鉴定电泳图，其中A：pcDNA3.1-HA；B：pcDNA3.1-mHA；C：pcDNA3.1-cHA；D：pcDNA3.1-sHA；

图3显示鉴定本发明的融合蛋白表达的间接免疫荧光图，A：Mock组；B：pcDNA3.1-HA；C：pcDNA3.1-mHA；D：pcDNA3.1-cHA；E：pcDNA3.1-sHA；

图4显示利用Werstern Blot鉴定融合蛋白表达的免疫印迹图；

图5显示特异性IgG抗体产生情况的统计图，其中，A：H1N1攻毒；B：H3N2攻毒；C：H5N1攻毒；D：IgG亚型检测；

图6显示攻毒实验后小鼠体重和生存率的变化曲线图，其中A：H1N1攻毒组体重；B：H1N1攻毒组体重生存率；C：H3N2攻毒组体重；D：H3N2攻毒组生存率；E：H5N1攻毒组体重；F：H5N1攻毒组生存率；

图7显示攻毒后小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌情况统计图，其中，A：IFN-γ；B：IL-4；

图8显示攻毒后肺病毒滴度统计图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

H1N1流感病毒鼠适应株A/Changchun/01/2009(H1N1,group 1)，H3N2流感病毒鼠适应株A/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013(H3N2,group 2)，H5N1禽流感病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(H5N1,clade 2.3.2.1；group1)由军事医学科学院军事医学研究院军事兽医研究所病毒室提供。

实施例1 3种重组质粒的制备及鉴定

1、材料

主要试剂：E.coli XL10-Gold感受态细胞由本实验室制备与保存，基因合成由金唯智公司提供，重组质粒基因测序及引物合成等技术服务由金唯智公司提供。核酸内切酶购自Thermo公司，抗生素等购自索莱宝公司，HA兔多抗购自北京义翘神州生物公司，M2鼠单抗，NP鼠单抗购自abcam公司。

2、方法

2.1将H5N1病毒提取RNA后反转录为cDNA，分别用H5N1的HAF和HA R的引物以cDNA为模板，SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10为HA片段的扩增引物，进行PCR扩增(94℃5min后，94℃30s，55℃30s，72℃1分钟共30个循环)得到HA片段，并且用基因合成得到sHA，mHA，cHA的基因片段，sHA，mHA，cHA基因片段的结构示意图如图1所示。

2.2构建重组质粒

将得到的HA基因根据HindIII-HF和NotI-HF酶切位点克隆到pCDNA3.1(+)质粒中，转化到E.coli XL10-Gold感受态细胞中，涂板过夜培养，筛选阳性菌，提质粒PCR、测序和酶切鉴定，得到正确的pCDNA3.1-HA质粒。再将mHA，cHA，sHA基因根据EcoRI-HF和NotI-HF酶切位点克隆到pCDNA3.1(+)质粒中，得到pcDNA3.1-mHA，pcDNA3.1-cHA，pcDNA3.1-sHA 三种重组质粒。SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6为鉴定sHA片段的PCR上下游引物；SEQ ID NO.7，SEQ IDNO.8为鉴定mHA、cHA片段的PCR上下游引物。

2.3大量表达与纯化重组质粒

分别取15μl鉴定正确的pcDNA3.1-HA，pcDNA3.1-mHA，pcDNA3.1-cHA，pcDNA3.1-sHA阳性菌液加入5ml氨苄，四环素抗性的LB液体培养基中，于37℃，220rpm/min过夜培养。按照1：500的接菌量，每500ml含抗生素的LB液体培养基加入1ml的新鲜菌液于37℃，220rpm/min震荡培养16-20h。质粒提取步骤参见QIAGEN公司去内毒素的质粒大量提取试剂盒。

2.4间接免疫荧光鉴定

将鉴定阳性的4种重组质粒Lipofectamine 3000转染试剂转入293T细胞，37℃培养两天后，用4％的多聚甲醛，室温固定15min，细胞经PBS清洗后，将HA抗体按1：250稀释，4℃室温孵育4h后，用FITC标记的二抗对细胞用间接免疫荧光进行表达鉴定，发现4种重组质粒感染的293T细胞中均有强烈的绿色荧光表达，说明4种重组质粒有相应蛋白的表达。

2.5Western blot验证

重组质粒用10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进行蛋白印记鉴定。用封闭液室温封闭2h，分别用HA(1：500)兔多抗，NP(1：1000)鼠单抗，M2(1：1000)鼠单抗4℃一抗过夜。再用对应二抗室温孵育2h后显影。

3、结果

筛选阳性克隆酶切鉴定结果如图2所示，鉴定正确后大量表达。用间接免疫荧光进行表达鉴定，发现3种重组质粒感染的293T细胞中均有强烈的绿色荧光表达，说明3种重组质粒有相应蛋白的表达。用HA兔多抗作为一抗进行Westernblot验证，发现pcDNA3.1-HA在70KD左右有条带，pcDNA3.1-mHA在23KD左右有条带,pcDNA3.1-cHA和pcDNA3.1-sHA在50KD左右有条带，说明4种重组质粒的蛋白表达正确。

实施例2甲型流感通用DNA疫苗实验免疫研究

1、材料

HPR标记山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a购自Southern Biotechnology公司，小鼠IFN-γ和IL-4的ELISApot检测试剂盒购自Mabtech公司，TMB购自Sigma公司。6-8周龄的BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华公司。

2、方法

2.1免疫和攻毒

为免疫攻毒设计，将180只健康的雌性Balb/c小鼠随机分为6个免疫组，每组30只老鼠，实验组分别免疫pcDNA 3.1-HA+佐剂(CpG+MPLA)，pcDNA3.1-mHA+佐剂(CpG+MPLA)，pcDNA 3.1-cHA+佐剂(CpG+MPLA)，pcDNA3.1-sHA+佐剂(CpG+MPLA)，对照组免疫pcDNA 3.1+佐剂组(CpG+MPLA)，空白组为PBS组。共免疫3次，均为小鼠双侧后腿胫前肌注射方法。每只小鼠注射质粒DNA 100μg/只/次，每间隔三周免疫一次，0周为初次免疫，3周，6周为加强免疫。首次免疫后第3周，6周，9周进行小鼠眼眶后静脉丛采血，每组至少采10只，分离血清，储存于-80℃备用。第9周攻毒，用异氟烷麻醉小鼠，分别用10倍MLD50的同源病毒(A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012,H5N1,clade2.3.2.1；group 1)和2种异源病毒(mouse-adapted A/Changchun/01/2009,H1N1,group 1)，(mouse-adapted A/baikal teal/Shanghai/SH-89/2013,H3N2,group 2)进行攻毒实验。每天同一时刻称量记录每只老鼠小鼠的体重和存活率。所有动物试验条件和试验程序都遵从国际疼痛研究协会的道德准则，并且该试验程序经过了中国人民解放军动物护理和实用委员会的批准，所有实验均在军事兽医研究所生物安全防护三级实验室(BSL-3)中进行操作。

2.2特异性IgG抗体检测

在小鼠免疫后0周，3周，6周，9周眼眶采血，采取的血液于室温放置2h后经3000rpm离心10min，分离出上层血清，储存于-80℃；

用ELISA试验检测血清中的流感病毒特定的IgG,IgG1和IgG2a。用灭活的H1N1流感病毒鼠适应株A/Changchun/01/2009(H1N1,group 1)，H3N2流感病毒鼠适应株A/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013(H3N2,group 2)，H5N1禽流感病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(H5N1,clade 2.3.2.1；group1)的病毒以5μg/ml在4℃过夜包被96孔板，用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，在96孔板中加入稀释好的血清样品37℃孵育1.5小时。用PBST清洗后再用HRP标记的羊抗鼠IgG，IgG1和IgG2a在37℃孵育1小时，用PBST清洗后加入TMB在25℃作用30分钟，之后加入50μl的0.5M的H₂SO₄终止反应。用分光光度计在450nm处检测结果。

2.3攻毒保护实验：攻毒后15天内观察各组小鼠体重变化和生存率变化

2.4ELISAPOT检测细胞因子

用ELISApot检测由病毒样颗粒诱导的病毒活化的抗原特异性T细胞。由IL-4单抗和IFN-γ单抗预包被的96孔板，每孔铺1×10⁶个攻毒后第4天分离的脾细胞,每组3只老鼠，每只老鼠6个复孔(其中3个复孔加刺激物，另外3个为对照孔)，刺激物为灭活的H5N1病毒样颗粒，刺激物终浓度为10μg/ml，用含有10％FBS的1640培养基37℃，5％CO₂培养48h，弃去孔中细胞，按照ELISApot检测试剂盒的步骤进行酶联斑点检测，最后用ELISApot阅读系统计算斑点形成单位。

2.5肺的病毒滴定

肺匀浆按1:10，1：10²，…10¹⁰稀释后接种鸡胚，每个稀释度接种3枚9日龄SPF级鸡胚，每枚鸡蛋接种100μl，封上不干胶后于37℃孵育48h，48h后检测尿囊液血凝结果，每枚鸡蛋取50μl尿囊液与50μl 1％的鸡红细胞悬液混合，15min后观察记录结果，并用Reed-Muench法计算每只老鼠肺脏研磨液的鸡胚半数感染量EID50。

3、结果

3.1甲型流感通用DNA疫苗在小鼠体内激发的免疫应答

分别检测免疫第0，3，5，9周的小鼠血清中的针对同源病毒和异源病毒的特异性抗体水平。同源病毒(A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012,H5N1,clade，3种异源病毒(mouse-adapted A/Changchun/01/2009,H1N1,group 1),(mouse-adaptedA/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013,H3N2,group 2)。结果如图5A B,C所示，各组特异性IgG抗体水平随着免疫次数的增加而增长，表明有特异性抗体的产生。如图5A所示，针对H1N1抗原，在三免后，pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA组与pcDNA3.1-sHA+CpG+MPLA组产生的抗体滴度最高可达到1：16000和1：8000。如图5B所示，针对H3N2抗原，与对照组pcDNA 3.1-HA+CpG+MPLA相比，第9周，pcDNA 3.1-mHA+CpG+MPLA组产生的IgG水平仍显著提升，表明pcDNA3.1-mHA+CpG+MPLA组可刺激宿主细胞产生针对H3N2高水平的特异性IgG抗体。如图5C所示，针对H5N1抗原，与对照组pcDNA 3.1-HA+CpG+MPLA相比，三免后，pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA组和pcDNA 3.1-sHA+CpG+MPLA组可刺激宿主细胞产生针对H5N1高水平的特异性IgG抗体。在三个攻毒组中，单独佐剂组pcDNA 3.1+CpG+MPLA均能发生一定的免疫反应，但随着免疫次数的增加，佐剂组只出现轻微的抗体水平增加，表明宿主细胞产生高水平的特异性IgG抗体主要是由免疫的DNA疫苗产生。四种构建的DNA疫苗相比较，pcDNA3.1-cHA+CpG+MPLA可针对一种同源病毒和两种异源病毒产生更高水平的血清IgG抗体滴度。在第9周，我们计算了所有免疫组的IgG1与IgG2a的滴度水平，然后进行了比较。如图5D所示，所有免疫组针对H5N1抗原的IgG2a的滴度比IgG1的滴度高，说明病毒产生特异性免疫反应的抗体以IgG2a为主。

3.2甲型流感通用DNA疫苗的攻毒保护研究

攻毒后15天观察小鼠的体重变化和生存率变化，结果见图6。在同源H5N1攻毒组，Mock组和佐剂组在14天内全部死亡，对照组pCDNA3.1-HA+CpG+MPLA存活率为40％，实验组pcDNA3.1-mHA+CpG+MPLA存活率为20％，pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA，pcDNA3.1-sHA+CpG+MPLA存活率均为80％；在异源H1N1攻毒组，对照组pCDNA3.1-HA+CpG+MPLA存活率为60％，实验组pcDNA3.1-mHA+CpG+MPLA存活率为60％，pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA，pcDNA3.1-sHA+CpG+MPLA存活率均为80％，Mock组和佐剂组无存活，与H5N1组相比，各个免疫组呈现出更好的保护效率和体重损失。在异源H3N2攻毒组，Mock组和佐剂组无存活，对照组pCDNA3.1-HA+CpG+MPLA存活率为40％，实验组pcDNA 3.1-mHA+CpG+MPLA存活率为80％，pcDNA3.1-cHA+CpG+MPLA存活率为60％，pcDNA 3.1-sHA+CpG+MPLA存活率为20％，其中pcDNA 3.1-mHA+CpG+MPLA组有小于15％的体重损失，对异源H3N2病毒提供更好的保护。通过结果看pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA组和pcDNA3.1-sHA+CpG+MPLA组针对同源和异源流感病毒的拥有更好的交叉保护活性。

3.3甲型流感通用型DNA疫苗能激活特异的T淋巴细胞

取攻毒四天后的小鼠脾淋巴细胞，用灭活的H5N1抗原刺激。结果表明，与对照组相比，各个免疫组均显示高水平的IFN-γ和IL-4分泌，其中pcDNA3.1-sHA+CpG+MPLA组最为明显。如图7，小鼠脾细胞IFN-γ产生的SFCs数量明显优于IL-4组，上述结果表明，6个免疫组均能诱导抗原特异性细胞免疫的产生，以Th1型免疫反应为主。

3.4甲型流感通用DNA疫苗能抑制流感病毒的复制

取各组攻毒后四天的小鼠肺脏，将肺脏研磨液接种于9日龄SPF鸡胚中，48h后进行各型流感病毒的病毒滴定测定。结果如图8所示，在H1N1病毒组中，虽然没有统计学差异，但与对照组pcDNA 3.1-HA+CpG+MPLA相比，实验组均有不同程度的病毒滴度下降，与攻毒保护实验结果一致。在H3N2病毒组中，pcDNA 3.1-cHA+CpG+MPLA组病毒滴度比对照组有显著下降。在H5N1病毒组中，pcDNA 3.1-sHA+CpG+MPLA组病毒滴度比对照组有显著下降。表明与对照组相比，实验组能够抑制流感病毒在小鼠肺脏中的复制。

在联合佐剂时pcDNA 3.1-cHA与pcDNA 3.1-sHA能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫，并产生了较高的针对不同亚型流感病毒的免疫保护活性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 河南大学，军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggaattca tgaaattcct ggtcaacgtg gctctggtgt tcatggtcgt ctacatctcc 60

tatatctacg ccgctgctgg tggtggtggt tccgacctga tcttcctggc ccgcagcgct 120

ctgattctgc gtggttccgt ggctcacaag tcctgtgctg ccgctcctgg tatcgctgac 180

atcgaggacc tgaccctgct ggctcgctcc atggtggtgg tgcgtcctgc tgccgcttcc 240

ctgctgactg aagtcgaaac ccccatccgt aacgagtggg gcagccgctc caatgattcc 300

tccgatgctg ctgctagcct cctgactgag gtggaaaccc ccattcgcaa cgagtggggt 360

tgccgctgca acggttcctc cgatgctgct gctagcctgc tgaccgaagt ggaaacccct 420

actcgtagcg aatgggagtc ccgcagctcc gactccagcg atgccgctgc tagcctgctg 480

accgaagtcg agacccccac ccgcaacggt tgggagtgca agtgttccga cagcagcgat 540

gctgccgctt ccctgctgac cgaggtcgaa accctgaccc gcaatggttg gggttgccgt 600

tgcagcgact cctccgacgc tgccgctggc tgtaacaaca acaacgctgc tgccggttgt 660

aataataata acgctgccgc cggctgcaac aataacaacg gtggcggcgg ctccggtctg 720

ttcggtgcca ttgctggttt catcgaaggc ggctggcagg gtatggtgga cggctggtac 780

ggctatcacc actccaacga gcagggttcc ggctacgccg ctgacaagga gtccacccag 840

aaagctatcg acggcgtcac caacaaggtc aactccatca ttgacaagat gaacactcaa 900

ttcgaagccg tcggccgcga gttcaacaac ctggagcgcc gtatcgagaa cctgaacaag 960

aagatggagg atggcttcct cgatgtctgg acttacaacg ccgagctgct ggtgctgatg 1020

gagaatggtc gcaccctgga cttccacgac agcaacgtga agaacctgta cgataaggtc 1080

cgcctgcagc tgaaggacaa cgccaaagag ctgggtaacg gctgcttcga gttttaccac 1140

aagtgcaata acgagtgcat ggagtccgtc cgcaacggca cctatgacta tccccagtac 1200

tccgaagagg cccgcctgaa gcgcgaggaa atcagcggcg tgaagctgga gagcatcggc 1260

atctaccaga ttctgagcat ttactccact gtcgcctcca gcctggtcct ggccatcatg 1320

atggccggtc tgtccctgtg gatgtgctcc aacggcagcc tgcagtgccg catctgcatc 1380

taagcggccg ctaaactatt 1400

<210> 2

<211> 791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaattca tgaagttttt agtgaacgtg gctttagtgt tcatggtggt gtacatctcc 60

tacatctacg ccgctgctgg tggtggtggt tccatgggtt cctcctcctc cggtctggtg 120

cctcgcggtt cccacatgga gcaagttgac accatcatgg agaagaacgt gaccgtgacc 180

cacgctcaag atattttaga gaagacccac ggctccgcca acagcagcat gcccttccac 240

aacatccacc ctttaaccat cggtgagtgc cccaagtacg tgaagagcaa caagctggtg 300

ctggccaccg gcctccgtaa tggttccgct ggctccgcca cccagaaggc tatcgacggt 360

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cgcgagttca acaatttaga gcgtcgcatc gagaatttaa acaagaagat ggaggacggc 480

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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