阅读说明：本技术 替代性改良乙型流感病毒活疫苗的研制 (Development of alternative improved influenza B virus live vaccine ) 是由 杰弗逊·J·S·桑托斯 丹尼尔·R·佩雷斯 于 2018-03-21 设计创作，主要内容包括：公开了与减毒活乙型流感病毒相关的组合物和方法。(Compositions and methods related to live attenuated influenza b viruses are disclosed.)

替代性改良乙型流感病毒活疫苗的研制

本申请要求2017年3月21日提交的美国临时申请第62/474,604号的权益，其全部内容通过引用并入本文。本发明是在政府支持下完成的，其批准号HHSN266200700010C和HHSN272201400008C由美国国立卫生研究院授予。政府对这项发明持有一定的权利。

背景技术

乙型流感病毒(IBV)是正粘病毒科中的一种包膜病毒，其具有负向、分段的单链RNA基因组。IBV基因组中存在八个病毒RNA(vRNA)片段，编码至少11种蛋白质。IBV被认为是人类主要的呼吸道病原体，有大量文字记载其引发流行病的历史。虽然IBV感染所有年龄段的人，但对于年幼和年长的人群疾病影响更大。在美国，2004年至2011年的每个季节(不包括2009年的流行病)内，22-44％的儿童流感相关死亡与IBV感染有关。在美国和欧洲，近年来的流行病学证据显示，IBV的影响可能正在增加。系统发育研究表明了两个不同IBV谱系的出现，其在20世纪70年代出现了分化，而80年代的血清学证据显示，这些谱系在抗原性上已经有所不同。这两个谱系被称为山形(B/Yam)谱系和维多利亚(B/Vic)谱系，当通过血凝抑制(HI)试验进行评估时，彼此之间几乎没有血清交叉反应。尽管突变率低于用IAV观察到的突变率，但由于病毒聚合酶的易错特性和宿主介导的抗体压力，两个IBV谱系都持续经历抗原漂移。

针对季节性流感病毒的疫苗是为了抵御IAV和IBV病毒。为了达到保护目的，目前的疫苗主要依赖于对血凝素(HA)病毒表面蛋白的抗体反应。HA的抗原漂移要求流感疫苗定期更新，以在抗原上与当前传播的病毒株相匹配。季节性流感疫苗传统上有三种流感病毒株，包括两种IAV病毒株(A/H1N1和A/H3N2)和一种IBV病毒株，代表B/Yam或B/Vic谱系。然而，近年来，这两个IBV谱系不仅表现出季节性变化，而且在不同国家的流行率也有显著差异，因此极难预测哪个IBV谱系将在特定地区的某个季节流行。因此，世界各地都报告了季节性疫苗和传播中的IBV毒株之间的显著抗原错配。鉴于此，包含两种IAV病毒株以及两种IBV抗原谱系的四价疫苗已经获批并可以购买到。

在美国，获得许可的季节性流感疫苗以灭活流感疫苗(IIV)、重组流感疫苗(rIV)或减毒活流感疫苗(LAIV)上市。LAIV疫苗是使用主供体病毒(MDV)生产的，主供体病毒携带一系列限制病毒在上呼吸道复制的突变(下呼吸道复制缺失或减少，临床症状最少)。在美国，Maassab等人通过在逐渐降低的温度下分别连续传代B/安阿伯市/1/66(MDV-B)和AJ安阿伯市/6/60(H2N2)(MDV-A)病毒，生产针对IBV和IAV的MDV，获得在25℃下生长良好的冷适应(ca)、温度敏感(ts)、体内减毒(att)病毒。尽管MDV-B和MDV-A病毒株与其各自的亲代病毒相比都显示出许多突变，但那些赋予ca/ts/att表型的病毒主要位于聚合酶复合体(PB1、PB2、PA和NP)中。MDV-B的ca/ts/att突变被定位于PB2(S630R)、PA(V341M)、NP(VI 14A、P410H和A509T)和Ml(H159Q和Ml 83V)，而MDV-A的突变位于PB2(N265S)、PB1(K391E、D581G和A661T)和NP(D34G)内。这些病毒株在2003年获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准后，已在美国以商品名FLUMIST上市。然而，在过去三季(2013-2014年、2014-2015年和2015-2016年)中，FLUMIST在疫苗效力方面遇到了许多问题，这凸显了继续投资LAIV开发以获得更有效疫苗的至关重要性。

发明内容

公开了与减毒活乙型流感病毒相关的方法和组合物。

在一个方面，本文公开了减毒活乙型流感病毒，其包含病毒聚合酶PB1片段的残基580和/或660处的取代。

还公开了任何前述方面的减毒活乙型流感病毒，其中，残基580处的取代是E580G取代。

还公开了任何前述方面的减毒活乙型流感病毒，其中，残基660处的取代是S660A取代。

一方面，本文公开了减毒活乙型流感病毒，其包含在流感病毒聚合酶的PB1片段中的E580G取代和/或S660A取代。

还公开了任何前述方面的减毒活乙型流感病毒，其进一步包含HA标签。

在一个方面，任何前述方面的减毒活乙型流感病毒可以是疫苗中的组分。

在一个方面，本文公开了任何前述方面的减毒活流感疫苗，其中，疫苗是四价疫苗，进一步包含来自甲型流感病毒株H3N2和H1N1的基因片段。

本文还公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用任何前述方面的减毒活乙型流感病毒或包含所述减毒活乙型流感病毒的疫苗。

一方面，本文公开了减弱乙型流感病毒的方法，包括替换病毒聚合酶PB1片段的残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸。在一个方面，减毒可以通过用编码残基580处谷氨酸和/或残基660处丝氨酸的核酸代替编码其他氨基酸的核酸来发生。

还公开了减弱任何前述方面的乙型流感病毒的方法，其中，病毒聚合酶PB1片段残基580处的谷氨酸被非极性氨基酸取代，非极性氨基酸包括但不限于丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。

还公开了减弱任何前述方面的乙型流感病毒的方法，其中，病毒聚合酶PB1片段残基660处的丝氨酸被非极性氨基酸取代，非极性氨基酸包括但不限于丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。

附图说明

结合在本说明书中并构成其一部分的附图示出了几个实施例，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。

图1示出了IBV基因组组织的示意图，描述了测试IBV减毒的所有改性及其各自的结果。使用定点诱变和反向PCR将减毒改性结合到PB1(E391、G580、A660和HA标签)和PB2(S267、F359和Y406)基因片段中。PB1 E391改性不稳定。PB2 S267对病毒拯救有害，而PB2F359和PB2 Y406取代增加了IBV的毒性。G580、A660和HA标签在PB1片段中的改性是稳定的，足以实现减毒(PB1 att)。

图2A和2B示出了PB2的突变增加了IBV的毒性。PB2 F406Y和PB2 W359F突变通过定点诱变分别引入到B/布里斯班/60/2008病毒株的PB2片段中，并使用反向遗传学用于病毒拯救。雌性6周龄DBA/2J小鼠滴鼻接种10⁵EID50的WT RG-B/Bris、B/Bris-F406Y和B/BrisPB2-W359F病毒。模拟组接受PBS并作为阴性对照。每天监测滴鼻接种后体重变化的百分比(2A)和存活率(2B)。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。***,P<0.001。

图3A、3B和3C显示了体外IBV PB1改性的特征。图3A显示了携带嵌合PB1HA蛋白的IAV病毒和IBV病毒中HA标签的表达。MDCK细胞(1)模拟接种(PBS)或用下列菌株接种：(2)WTRG-B/Bris，(3)B/Bris ts，(4)B/Bris att或(5)IAV att对照(7attWF10:lmalH7)。示出了分子量(MW)>80KDa的PB1HA嵌合蛋白：IAV-PB1HA用黑色箭头表示(预测MW 88.66KDa)，IBV-PB1HA用空心箭头表示(预测MW 85.35KDa)。宿主细胞蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，38.5KDa)显示为凝胶负载对照。图3B显示了不同温度下病毒聚合酶的活性。用编码PB1(或PB1 att)、PB2、PA、NP和IBV vRNA流感病毒驱动的荧光素酶报告复制子的质粒转染293T细胞。此外，共转染在CMV启动子控制下编码分泌的碱性磷酸酶的质粒，以使转染效率的变化正常化。相对聚合酶活性计算为荧光素酶活性与碱性磷酸酶活性在24或(3C)48hpt的比值。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。**,P<0.01；****,P<0.0001。

图4A、4B、4C、4D和4E表明，在体外生长动力学中，B/Bris att病毒显示出ts表型。MDCK细胞的会合单层在0.01MOI接种WT RG-B/Bris或B/Bris att病毒，并在33(4A)、35(4B)、37(4C)、37.5(4D)和39℃(4E)培育。在指定的时间点，收集接种细胞的组织培养上清液，由TCID₅₀使用Reed-Mench法定量病毒滴度。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。

图5A、5B、5C、5D、5E、5F和5G显示了B/Bris att病毒的安全性和免疫原性。雌性6周龄DBA/2J小鼠滴鼻接种10⁶EID的WT RG-B/Bris或B/Bris att病毒。模拟接种组接受PBS并作为疫苗阴性对照。图5A显示了滴鼻接种B/Bris att病毒后每天监测小鼠体重变化的百分比。图5B显示了WT RG-B/Bris和B/Bris att病毒在小鼠呼吸道中的病毒复制和组织趋向性。在3和5dpi时，每组4只动物被安乐死，小鼠上呼吸道(鼻甲，NT)或(5C)下呼吸道(肺)的病毒滴度由MDCK细胞中的标准TCID₅₀测定。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。*,P<0.05；***,P<0.001。收集接种后5天实施安乐死的小鼠的肺，并保存在10％***中，通过H&E染色进行组织病理学检查。图像是以20倍的放大率拍摄的。来自(5D)模拟接种(PBS)小鼠，(5E)接种B/Bris att疫苗小鼠，(5F)接种WT RG-B/Bris小鼠的肺H&E染色。图5G显示了在21dpi下，通过针对同源(B/Bris)和异源(B/Wis)病毒的HI分析测定的小鼠血清中B/Bris att病毒的免疫原性。

图6A、6B、6C、6D和6E显示了B/Bris att病毒对抗B/Bris PB2-F406Y病毒攻击的保护效力。雌性6周龄DBA/2J小鼠滴鼻接种PBS(模拟接种阴性对照)或接种10⁶EID₅₀的B/Brisatt病毒。接种后三周，通过滴鼻途径，用PBS(模拟)或10⁷EID₅₀的B/Bris PB2-F406Y病毒对小鼠进行攻击。用B/Bris PB2-F406Y病毒攻击后，每日监测存活率(6A)和体重变化的百分比(6B)。图6C显示了攻击后，接种疫苗(B/Bris att)小鼠或阴性对照(模拟接种)小鼠呼吸道中B/Bris PB2-F406Y病毒的病毒复制和组织趋向性。在3和5dpc时，每组4只动物被安乐死，小鼠上呼吸道(鼻甲，NT)或(6D)下呼吸道(肺)的病毒滴度由MDCK细胞中的标准TCID₅₀测定。图6E显示了在21dpc下，通过针对同源(B/Bris)和异源(B/Wis)病毒的HI分析测定的小鼠血清抗体应答。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。**,P<0.01；****,P<0.0001。

图7A、7B、7C、7D和7E显示了B/Bris att病毒对抗抗原同源异源B/Wis PB2-F406Y病毒攻击的保护效力。雌性6周龄DBA/2J小鼠滴鼻接种PBS(模拟接种阴性对照)或接种10⁶EID₅₀的B/Bris att病毒。接种后三周，通过滴鼻途径用PBS(模拟)或10⁷EID₅₀的B/WisPB2-F406Y病毒对小鼠进行攻击。用B/Wis PB2-F406Y病毒攻击后，每日监测存活率(7A)和体重变化的百分比(7B)。图7C显示了攻击后，接种疫苗(B/Bris att)小鼠或阴性对照(模拟接种)小鼠呼吸道中B/Wis PB2-F406Y病毒的病毒复制和组织趋向性。在3和5dpc时，每组4只动物被安乐死，小鼠上呼吸道(鼻甲，NT)或(7D)下呼吸道(肺)的病毒滴度由MDCK细胞中的标准TCID₅₀测定。图7E显示了在21dpc下，通过针对同源(B/Bris)和异源(B/Wis)病毒的HI分析测定的小鼠血清抗体应答。绘制的数据代表平均值±标准误差(SD)。通过双向方差分析(ANOVA)来计算P值。*,P<0.05；**,P<0.01；****,P<0.0001。

图8A、8B、8C、8D和8E显示，在IBV攻击后，B/Bris att疫苗接种可减少肺部病理。收集在攻击后第5天实施安乐死的小鼠的肺，并保存在10％***中进行H&E染色。图像是以20倍的放大率拍摄的。(8A)模拟接种小鼠在用B/Bris PB2-F406Y攻击后，(8B)B/Brisatt接种小鼠在同源攻击后(B/Bris PB2-F406Y)，(8C)模拟接种、模拟攻击(PBS)对照小鼠，(8D)模拟接种小鼠在用B/Wis PB2-F406Y攻击后和(8E)B/Bris att接种小鼠在异源攻击后(B/Wis PB2-F406Y)的肺部H&E染色。

图9显示了QIV疫苗对甲型和乙型流感病毒的攻击是有效的。在用B/Bris PB2F406Y病毒或小鼠适应的Ca/04(H1N1)病毒攻击后，观察到QlV接种的小鼠100％存活。在所有小鼠实验中使用了5至6周龄的雌性DBA/2J小鼠(位于缅因州巴尔港的杰克逊实验室)。用异氟醚麻醉每只小鼠，随后用50μl的QIV制剂(n＝22)或模拟接种PBS对照(n＝33)滴鼻接种。QIV制剂含有减毒活甲型流感病毒和乙型流感病毒(Ty/04att H3N2、Ca/04att H1N1、B/Bris att和B/Wisc att)，剂量为每只小鼠10⁶TCID₅₀每种病毒/50μl。接种后20天(dpi)，从小鼠下颌下静脉采血，收集血清以测量中和抗体反应(4只小鼠/组)。在21dpi时，如上所述使用QIV增强小鼠。在攻击的前一天[增强后20天(dpb)]，对4只小鼠/组进行放血并收集血清以测量中和抗体反应。在21dpb时，用小鼠适应的Ca/04(ma-Ca/04)(QIV组n＝1l，模拟接种的PBS n＝11)以10⁷TCID₅₀/小鼠的剂量或B/Bris PB2-F406Y(QIV组n＝1l，模拟接种的PBS n＝11)以10⁷TCID₅₀/小鼠的剂量攻击小鼠。第三组以模拟PBS作为对照(n＝8)进行攻击。每天监测小鼠的体重减轻和存活情况。在攻击后第5天(dpc)，每组处死3只小鼠，收集肺和鼻甲样本用于病毒滴度的定量。在21dpc时，处死所有小鼠，收集血清、鼻洗液和支气管肺泡灌洗液(BALF)以评估抗体反应。

图10显示，在攻击后5天(dpc)，每组处死3只小鼠，收集肺和鼻甲样本，用于滴定病毒脱落。

图11显示使用WT Ty/04(H3N2)、ma Ca/04(H1N1)、WT B/Bris和WT B/Wis病毒(9)对在20dpi、20dpb和21dpc收集的血清样本进行血凝抑制(HI)测定，分析中和抗体的存在。简言之，用受体破坏酶在37℃过夜处理小鼠血清，然后在56℃加热灭活30分钟。然后，血清用PBS稀释1:10，随后连续稀释2倍，并在室温下与病毒的8-血凝单位(HAU)混合15分钟。通过向病毒抗体混合物中加入0.5％的火鸡红细胞来监测HI活性。室温下30分钟后读取平板。

图12A显示，(与没有IgA应答的ma Ca/04(H1N1)的PBS对照攻击相比)接种QIV疫苗的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗ma Ca/04(H1N1)病毒的IgA抗体。小鼠的IgA应答在攻击后至少维持3周。病毒特异性IgA抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，该试验使用在5dpc收集的肺和鼻甲样本，以及在21dpc收集的粪便、血清、鼻洗液和BALF样本。ELISA平板在4℃下用ma-Ca/04病毒包被过夜。平板在室温下用10％脱脂牛奶在PBS中封闭2小时，然后用含有0.05％吐温20(PBST)的PBS洗涤两次。平板与在2％脱脂牛奶中稀释的测试样本在室温下在PBS中孵育2小时。用PBST洗涤3次后，将平板与HRP结合的抗小鼠IgA抗体(Bethyl实验室)在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤3次。然后向每个孔中加入100μl的TMB溶液(赛默飞世尔),并在室温下孵育15分钟。通过加入3％H2SO4停止反应。显示OD450处的值。

图12B显示，(与没有IgA应答的B/Bris的PBS对照攻击相比)接种QIV疫苗的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗B/Bris病毒的IgA抗体。小鼠的IgA应答在攻击后至少维持3周。病毒特异性IgA抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，该试验使用在5dpc收集的肺和鼻甲样本，以及在21dpc收集的粪便、血清、鼻洗液和BALF样本。ELISA平板在4℃下用B/Bris包被过夜。平板在室温下用10％脱脂牛奶在PBS中封闭2小时，然后用含有0.05％吐温20(PBST)的PBS洗涤两次。平板与在2％脱脂牛奶中稀释的测试样本在室温下在PBS中孵育2小时。用PBST洗涤3次后，将平板与HRP结合的抗小鼠IgA抗体(Bethyl实验室)在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤3次。然后向每个孔中加入100μl的TMB溶液(赛默飞世尔),并在室温下孵育15分钟。通过加入3％H2SO4停止反应。显示OD450处的值。

图12C显示，(与没有IgG应答的ma Ca/04(H1N1)的PBS对照攻击相比)接种QIV疫苗的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗ma Ca/04(H1N1)病毒的IgG抗体。小鼠的IgG应答在攻击后至少维持3周。病毒特异性IgG抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，该试验使用在5dpc收集的肺和鼻甲样本，以及在21dpc收集的粪便、血清、鼻洗液和BALF样本。ELISA平板在4℃下用ma-Ca/04包被过夜。平板在室温下用10％脱脂牛奶在PBS中封闭2小时，然后用含有0.05％吐温20(PBST)的PBS洗涤两次。平板与在2％脱脂牛奶中稀释的测试样本在室温下在PBS中孵育2小时。用PBST洗涤3次后，将平板与HRP结合的抗小鼠IgG抗体(Bethyl实验室)在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤3次。然后向每个孔中加入100μl的TMB溶液(赛默飞世尔)，并在室温下孵育15分钟。用3％H2SO4停止反应，并读取OD450值。

图12D显示，(与没有IgG应答的B/Bris的PBS对照攻击相比)接种QIV疫苗的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗B/Bris病毒的IgG抗体。小鼠的IgG应答在攻击后至少维持3周。病毒特异性IgG抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，该试验使用在5dpc收集的肺和鼻甲样本，以及在21dpc收集的粪便、血清、鼻洗液和BALF样本。ELISA平板在4℃下用B/Bris包被过夜。平板在室温下用10％脱脂牛奶在PBS中封闭2小时，然后用含有0.05％吐温20(PBST)的PBS洗涤两次。平板与在2％脱脂牛奶中稀释的测试样本在室温下在PBS中孵育2小时。用PBST洗涤3次后，将平板与HRP结合的抗小鼠IgG抗体(Bethyl实验室)在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤3次。然后向每个孔中加入100μl的TMB溶液(赛默飞世尔)，并在室温下孵育15分钟。用3％H2SO4停止反应，并读取OD450值。

图12E显示，接种QIV疫苗的小鼠在21dpc用异源ma Ca/04(H1N1)或B/Bris病毒收集的鼻洗液、BALF和血清中显示出对Ty/04(H3N2)病毒的高水平IgA和IgG抗体应答。由于异源攻击后，针对Ty04(H3N2)病毒的HI应答没有改变(图11)，因此可以合理地推出：Ty04(H3N2)特异性IgA和IgG应答是由QIV制剂引起的。小鼠中抗H3N2 IgA和IgG应答在攻击后至少维持3周。在21dpc时，用异源ma Ca/04(H1N1)病毒攻击的QIV组和PBS/非攻击对照组之间，对B/Wisc的IgA应答没有差异。然而，在用异源B/Bris病毒攻击后，对B/Wisc病毒的IgA应答受到刺激，这很可能是由于某种水平的交叉反应。在21dpc时收集的血清表明，QIV制剂能够诱导B/Bris特异性的IgA和IgG应答，其在用异源B/Bris病毒攻击期间得到增强。病毒特异性IgA和IgG抗体用包被Ty04或B/Wisc病毒的ELISA板通过前面图12中描述的ELISA进行检测。示出了OD450值。

具体实施方式

在公开和描述本化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有说明，它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有说明，它们不限于特定的试剂，因为这些当然都可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。

A.定义

如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，“药物载体”包括两种或更多种这种载体的混合物等。

范围在本文可以表示为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“大约”，将理解特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点是重要的，并且独立于另一个端点。还应当理解，本文公开了许多值，除了值本身之外，每个值也公开为“大约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，那么“大约10”也被公开。还应当理解，当公开一个值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及这些值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的那样。例如，如果值“10”被公开，则“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。还应当理解，在整个应用中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起始点以及数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，可以理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10和15之间都认为被公开。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语将被定义为具有以下含义：

“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。

在本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容通过引用结合到本申请中，以便更全面地描述其所属的技术状态。所公开的参考文献也通过引用单独地和具体地结合到本文中，作为提及参考文献的句子中所讨论的材料。

B.组成

公开了用于制备公开的组合物的组分以及在本文公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其他材料，应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每个不同的单独和集体组合和置换的具体参考，但是本文具体考虑和描述了其中的每一个。例如，如果公开和讨论了特定的乙型流感病毒PB1片段，并且讨论了可以对包括乙型流感病毒PB1片段在内的许多分子进行的许多改性，则特别考虑的是乙型流感病毒PB1片段的每一种组合和置换以及可能的改性，除非特别指出相反的情况。因此，如果公开了一类分子A、B和C，以及一类分子D、E和F和一个组合分子的示例，则公开了A-D，即使没有单独列举每一个，每一个都是单独和共同考虑的意思组合，也认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，也公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组被认为是公开的。这个概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种附加步骤可以执行，应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

在源于禽类或猪的IAV的背景下，来自MDV-A病毒株的单个PB2突变(N265S)和三个PB1突变(K391E、D581G和A661T)的结合(这些病毒中的大多数天然携带NP D34G突变)在体外导致具有ts表型的病毒。然而，体内充分的att表型只有在ts突变背景下，在由H3 HA基因片段(HA标签)衍生的9个氨基酸序列组成的PB1中掺入一个C端表位标签后才能实现。进一步的研究表明，如上所述改性的IAV att病毒(ts突变加HA标签)在小鼠、鸡和猪中作为LAIV是安全有效的；并且适于鼻内给药。在鸡中，IAV att疫苗也适用于卵内免疫。

尽管在病毒结构、基因组组织以及病毒复制和转录的调节方面有一些保守的特征，但IBV和IAV也表现出许多重要的独特特征，特别是在宿主范围、病毒流行和进化动力学方面。本文探讨了IAV att病毒株中的ts突变加上HA标签是否会在原型IBV病毒株中导致att表型。将与在IAV att替代活病毒疫苗中发现的那些相似的突变引入到一个原型B/Vic谱系菌株，B/布里斯班/60/2008(B/Bris)。具体而言，突变是在PB2 K267S和PB1(K391E、E580G和S660A)中进行的。此外，在存在或不存在温度敏感突变的情况下，用C端HA标签修饰PB1片段。试图在B/Bris中稳定地维持PB2 K267S和PB1 K39 IE突变失败。然而，稳定性研究表明突变E580G、S660A和C端HA标签在SPF卵中稳定地维持超过15代，在组织培养细胞中稳定地维持超过20代。安全性和疫苗接种研究表明，带有携带E580G和S660A突变和HA标签的PB1片段的B/Bris菌株(本文称为B/Bris att)是稳定的、体内减毒的和免疫原性的。在小鼠研究中，用B/Bris att鼻内免疫产生了针对同源攻击的灭菌免疫(B/Bris)，并且在用B/Yam谱系菌株异源攻击后实现了完全保护，B/威斯康星州/01/2010(B/Wis)。这些研究显示了IBV疫苗开发的另一个LAIV平台。

因此，在一个方面，本文公开了减毒活乙型流感病毒，其包含病毒聚合酶PB1片段的残基580和/或残基660处的取代。在一个方面，病毒聚合酶PB1片段的残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸的取代可以是用非极性氨基酸的取代。例如，取代可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在一个方面，病毒聚合酶的PB1片段的取代可以是E580G取代和/或S660A取代。例如，本文公开了减毒活乙型流感病毒，其包含流感病毒聚合酶PB1片段中的E580G突变、流感病毒聚合酶PB1片段中的S660A突变、或流感病毒聚合酶PB1片段中的E580G突变和S660A突变。

应当理解并可预期，所公开的减毒活乙型流感病毒可以来源于任何已知的乙型流感病毒。在一个方面，减毒活乙型病毒可以是维多利亚谱系的乙型流感病毒(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)或山形谱系的乙型流感病毒(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)。

在一个方面，减毒活乙型流感病毒可以进一步包含HA标签。这种标签可以位于PB1的C端的框架内。在一个方面，HA标签可以包括序列YPYDVPDY(SEQ ID NO：2)。

本文还公开了包含本文公开的任何减毒活乙型流感病毒的疫苗或包含本文公开的改性减毒活乙型流感病毒片段的合成病毒。例如，本文公开了包含减毒活乙型流感病毒的疫苗，其中，乙型流感病毒聚合酶的PB1片段包含E580G取代、S660A取代和/或HA标签。在一个方面，本文公开了减毒活乙型流感病毒或包含减毒活乙型流感病毒的疫苗，其中，乙型流感病毒聚合酶的PB1片段包含E580G取代和/或S660A取代，以及HA标签。

包含减毒活乙型流感病毒的疫苗可以是仅针对乙型流感病毒的单价或多价(即，双价、三价、四价或五价)疫苗，或者包含甲型流感病毒的附加价。例如，减毒活疫苗可以包含一种或多种维多利亚谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或一种或多种山形谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)，其中，如本文公开的，至少一种减毒活乙型流感病毒株在病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处包含取代。此外，包含所述病毒的疫苗可以包含甲型流感和乙型流感的化合价。因此，本文公开了包含一种或多种减毒活甲型流感病毒株和一种或多种减毒活乙型流感病毒株的疫苗，其中，至少一种乙型流感病毒株包含病毒聚合酶PB1片段的残基580和/或660处的取代(例如，疫苗可以是四价减毒活流感病毒疫苗，其包含两种减毒活甲型流感病毒株(减毒活H3N3病毒和减毒活H1N1病毒)和一种或多种减毒活乙型流感病毒；其中，至少一种减毒活乙型流感病毒包含病毒聚合酶PB1片段残基580和/或660处的取代(例如，E580G和/或S660A取代)；并且其中，一种或多种减毒活乙型流感病毒为维多利亚谱系(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或一种或多种减毒活乙型流感病毒为山形谱系(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)。例如，本文公开了多价疫苗(例如，四价疫苗)，其包含减毒活H3N3病毒、减毒活H1N1病毒、减毒活乙型流感/布里斯班病毒和减毒活乙型流感/威斯康星州病毒，其中，至少一种乙型流感病毒株在病毒聚合酶PB1片段的残基580和/或660处具有取代(例如，E580G取代和/或S660A取代)。

1.药物载体/药物产品的递送

如上所述，组合物也可以在药学上可接受的载体中体内给药。“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不适合的材料，即该材料可以与核酸或载体一起给药于受试者，而不会引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，载体将被自然选择以最小化活性成分的任何降解并最小化受试者中的任何副作用。

组合物可以口服、肠胃外(例如静脉内)、肌肉注射、腹膜内注射、透皮、体外、局部等给药，包括局部鼻内给药或吸入给药。如本文所用，“局部鼻内给药”是指通过一个或两个鼻孔将组合物递送到鼻子和鼻腔通道中，并且可以包括通过喷雾机构或液滴机构或通过核酸或载体的雾化来递送。通过吸入给药的组合物可以经由鼻或口，通过喷雾或液滴机制输送。也可以通过插管直接递送到呼吸系统的任何区域(例如肺部)。所需组合物的确切量因受试者而异，取决于受试者的种类、年龄、体重和一般状况、所治疗过敏性疾病的严重程度、所用的特定核酸或载体、其给药方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，根据本文的教导，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的量。

组合物的肠胃外给药，如果使用的话，通常以注射为特征。可注射物可以以常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液，或者是适于注射前悬浮液在液体中的溶液的固体形式，或者是乳液形式。最近修订的肠胃外给药方法包括使用缓释(slow release or sustainedrelease)系统，以保持恒定剂量。参见例如美国专利第3,610,795号，该专利通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可以通过抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人，Bioconjugate Chem杂志，2:447-451，(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer杂志，60:275-281，(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer杂志，58:700-703，(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem杂志，4:3-9，(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother杂志，35:421-425，(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog杂志评论，129:57-80，(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol杂志，42:2062-2065，(1991))。载体如“stealth”和其它抗体缀合脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物)、通过细胞特异性配体进行的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞导向的肿瘤靶向和体内鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，Cancer Research杂志，49:6214-6220，(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta杂志，1104:179-187，(1992)。一般来说，受体参与内吞途径，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白包被的凹坑中，通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞，通过酸化的核内体，受体在其中被分选，然后或者再循环到细胞表面而进一步储存在细胞内，或者在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，如营养吸收、活性蛋白质的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会进入、配体的解离和降解以及受体水平的调节。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价和配体浓度，许多受体具有多于一种的细胞内途径。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制已被综述(Brown和Greene，DNA and Cell Biolog杂志，10:6，399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

包括抗体在内的组合物可以与药学上可接受的载体结合使用。

《雷明顿:药学技术与实践》(第19版，编者A.R.Gennaro，宾夕法尼亚州伊斯顿麦克出版公司，1995年)中描述了合适的载体及其制剂。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐来使制剂等渗。药学上可接受的载体的示例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的酸碱度优选为约5至约8，并且更优选为约7至约7.5。进一步的载体包括缓释制剂，例如含有抗体的固体疏水聚合物半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，某些载体可能更合适，这取决于例如给药途径和给药组合物的浓度。

药物载体是本领域技术人员已知的。最典型的是用于对人类给药的标准载体，包括诸如无菌水、盐水和生理酸碱度下的缓冲溶液的溶液。该组合物可以肌内或皮下给药。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序给药。

除了选择的分子之外，药物组合物可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，例如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

药物组合物可以根据是局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域以多种方式给药。给药可以是局部给药(包括眼内、***、直肠、鼻内)、口服、吸入或胃肠外给药，例如静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮给药。

肠胃外给药制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部给药的制剂可以包括软膏、洗液、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或理想的。

用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、冲剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是理想的。

一些组合物可以作为药学上可接受的酸或碱加成盐给药，通过与无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸以及有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应形成，或者通过与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱如单、二、三烷基和芳基胺以及取代的乙醇胺反应形成。

b)治疗用途

施用组合物的有效剂量和时间表可以凭经验确定，进行这样的确定在本领域的技术范围内。给药组合物的剂量范围是足以产生所需效果的剂量范围，所述效果即病症的症状受到影响。剂量不应太大而导致不良副作用，如不必要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病情、性别和疾病程度、给药途径或治疗方案中是否包括其他药物而变化，可以由本领域技术人员确定。如果出现任何违反用药的情况，个别医生可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天给药一次或多次，持续一天或几天。在文献中可以找到给定类别药品的剂量指南。例如，在关于抗体治疗用途的文献中可以找到选择抗体适当剂量的指南，例如《单克隆抗体手册》，Ferrone等人编辑，新泽西州帕克里奇市诺格斯出版社，1985，第22章，第303-357页；Smith等人，《人类诊断和治疗中的抗体》，Haber等人编辑，纽约雷文出版社，1977，第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型日剂量可以在每天约1μg/kg至高达100μg/kg体重或更高的范围内。

在施用公开的减毒活乙型流感病毒或包含所述减毒活乙型流感病毒的疫苗以治疗、抑制或预防乙型流感感染后，减毒病毒的效力可以以本领域从业者熟知的各种方式进行评估。例如，本领域普通技术人员将理解，通过观察到本文公开的组合物降低病毒载量，表明该组合物(例如减毒活乙型流感病毒)在治疗或抑制受试者乙型流感感染方面是有效的。

本文公开的抑制乙型流感感染的组合物可以预防性给药于有暴露于乙型流感病毒的风险或新暴露于乙型流感病毒的患者或受试者。

C.抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法

应当理解并在此预期本文公开的减毒活乙型流感病毒和包含所述病毒的疫苗可用于使受试者免于暴露和感染流感病毒，例如乙型流感病毒。在一个方面，本文公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用减毒活乙型流感病毒，所述减毒活乙型流感病毒包括在病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处的取代。在一个方面，病毒聚合酶PB1片段的取代可以是病毒聚合酶PB1片段残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸被非极性氨基酸(即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)取代，例如E580G和/或S660A取代。例如，本文公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用在流感病毒聚合酶的PB1片段中包含E580G和S660A突变的减毒活乙型流感病毒。

可以理解并在此预期，用于所公开方法的减毒活乙型流感病毒可以来源于任何乙型流感病毒，包括任何山形或维多利亚谱系乙型流感病毒，包括但不限于维多利亚谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或山形谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)。

在一个方面，在公开的方法中使用的减毒活乙型流感病毒可以进一步包含HA标签。这种标签可以位于PB1的C端的框架内。在一个方面，HA标签可以包括序列YPYDVPDY(SEQID NO：2)。因此，在一个方面，本文公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用减毒活乙型流感病毒，其中，乙型流感病毒聚合酶的PB1片段包含E580G取代、S660A取代和/或HA标签。

在一个方面，所公开的抑制和/或预防乙型流感感染的方法中的减毒活乙型流感病毒可以是组合物如疫苗的组分。因此，本文公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用包含一种或多种减毒活乙型流感病毒的疫苗，其中，减毒活乙型流感病毒包含流感病毒聚合酶的PB1片段中残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸的取代(例如，E580G取代和S660A取代)。本文还公开了抑制和/或预防乙型流感病毒感染的方法，包括给受试者施用包含减毒活乙型流感病毒的疫苗，其中，乙型流感病毒聚合酶的PB1片段包含E580G取代、S660A取代和HA标签。

在一个方面，给予受试者用于抑制乙型流感病毒感染的减毒活乙型病毒可以是多价疫苗(如二价、三价或四价疫苗)中的一种组分，该多价疫苗旨在抑制乙型流感病毒。例如，在公开的抑制乙型流感病毒的方法中使用的减毒活疫苗可以包括给受试者施用一种或多种维多利亚谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或一种或多种山形谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)，其中，如本文公开的，至少一种减毒活乙型流感病毒株在病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处包含取代(例如，E580G取代和S660A取代)。在一个方面，在所公开的方法中使用的多价疫苗可以包含2、3、4或5个维多利亚谱系乙型流感病毒，2、3、4或5个山形谱系乙型流感病毒，或2、3、4或5个维多利亚谱系和山形谱系病毒的任意组合，只要至少一种乙型流感病毒是减毒活乙型流感病毒，其包含流感病毒聚合酶的PB1片段中残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸的取代(例如，E580G取代和S660A取代)。

还应理解和预期，作为多价泛流感疫苗(例如，二价、三价、四价或五价疫苗)的一部分，本文公开的减毒活乙型流感病毒和包含所述病毒的疫苗可用于使受试者免于暴露和感染任何流感病毒感染，包括甲型流感感染和乙型流感感染。在一个方面，本文公开了抑制和/或预防流感病毒感染(包括甲型流感(例如H3N2和H1N1)和乙型流感)的方法，包括给受试者施用包含在病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处取代的减毒活乙型流感病毒，其中，减毒活乙型流感病毒是多价减毒活流感疫苗中的组分。在一个方面，在公开的方法中使用的多价流感活疫苗可以包含一种或多种减毒活甲型流感病毒株和一种或多种减毒活乙型流感病毒株，其中，至少一种乙型流感病毒株包含病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处的取代(例如，疫苗可以是四价减毒流感病毒活疫苗，其包含两种减毒活甲型流感病毒株(减毒活H3N3病毒和减毒活H1N1病毒)和一种或多种维多利亚谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或一种或多种山形谱系的减毒活乙型流感病毒(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)。因此，例如，本文公开了抑制和/或预防流感感染的方法，包括给受试者施用多价疫苗(例如，四价疫苗)，其包含减毒活H3N3病毒、减毒活H1N1病毒、减毒活乙型流感/布里斯班病毒和减毒活乙型流感/威斯康星州病毒，其中，至少一种乙型流感病毒株在病毒聚合酶PB1片段的残基580和/或660处具有取代(例如，E580G取代和/或S660A取代)。

D.减弱乙型流感病毒的方法

如本文所述，在乙型流感病毒的病毒聚合酶的PB1片段的残基580和/或660处的取代将减弱病毒。因此，在一个方面，本文公开了减弱乙型流感病毒(包括但不限于本文公开的任何维多利亚谱系(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)病毒和/或山形谱系(例如，乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)病毒)的方法，包括用非极性氨基酸替代病毒聚合酶PB1片段的残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸。例如，取代可以是为了甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在一个方面，本文公开了减弱乙型流感病毒的方法，包括用非极性氨基酸替代病毒聚合酶PB1片段的残基580处的谷氨酸和/或残基660处的丝氨酸，其中，病毒聚合酶PB1片段的取代包括E580G和/或S660A取代。

E.示例

提出以下示例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，纯粹是示例性的，而不是旨在限制本公开。虽然已尽量确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些错误和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，温度为摄氏度或环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.示例1减毒活乙型流感病毒

a)材料和方法

1)细胞系和病毒株。

马丁-达比犬肾(MDCK)细胞和人胚胎肾293T细胞保存在杜尔贝科改良的鹰培养基(DMEM)中，该培养基补充了10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素/抗真菌溶液(密苏里州圣路易斯西格玛-奥尔德里奇公司)。细胞在5％CO₂大气压下的湿度培养箱中于37℃繁殖。B/布里斯班/60/2008(WT B/Bris)和B/威斯康星州/01/2010(WT B/Wis)乙型流感病毒株由乔治亚州亚特兰大疾病控制和预防中心的Ruben Donis赠送。病毒悬液在特定的无病原体胚胎鸡蛋(SPF鸡蛋)(宾夕法尼亚州约克斯普林斯的B&E Eggs公司或康涅狄格州诺维奇的CharlesRiver实验室)中扩增，并储存在-80℃。本报告中使用的病毒总结在表1中。

表1本研究中使用的流感病毒

^a 野生型B/布里斯班/60/2008病毒

^b 反向遗传产生的野生型B/布里斯班/60/2008病毒

^c 野生型B/威斯康星州/01/2010病毒

^d PB1中携带温度敏感突变(E580G和S660A)的B/布里斯班/60/2008病毒

^e PB1中携带温度敏感突变(E580G和S660A)和HA标签的B/布里斯班/60/2008病毒

^f PB2中携带W359F突变的B/布里斯班/60/2008病毒

^g PB2中携带F406Y突变的B/布里斯班/60/2008病毒

^h 重组病毒，含有B/威斯康星州/01/2010的HA和NA基因以及B/布里斯班/60/2008F406Y病毒的相同内部基因群。

^I 重组病毒，含有A/野鸭/亚伯达/24/01(H7N3)的HA和减毒A/珍珠鸡/香港/WFlO/1999(H9N2)病毒(WFlOatt)的7个剩余基因。

2)动物使用和依从性。

在所有小鼠实验中使用了5至6周龄的雌性DBA/2J小鼠(马里兰州弗雷德里克的Charles River实验室或缅因州巴尔港的杰克逊实验室)。所有动物研究均在动物生物安全2级(ABSL-2)限制条件下进行，遵守乔治亚大学和马里兰大学帕克分校实验动物管理与使用委员会(IACUC)批准的协议。经历显著体重减轻(21-25％)或在疾病严重程度的四分等级中得分为3或更高的小鼠被人道安乐死。

(3)克隆和定点诱变。

WT B/Bris病毒株的反向遗传系统已在别处描述过。用标准克隆技术将WT B/Wis的HA和NA表面基因片段克隆到双向克隆载体pDP2002中。为了产生减毒的PB1片段(PB1att)，首先通过反向PCR在PB1的C端框架内克隆一个改性的HA标签。克隆策略是在HA标签克隆过程之后进行的，只是做了一些小的修改。引物的设计使得PB1中的原始终止密码子突变为丙氨酸(A)，并在改性的HA标签后引入新的终止密码子。此外，野生型PB1序列(异亮氨酸，I)中最后一个氨基酸的密码子在引入丙氨酸(A)密码子之前立即重复。因此，引入PB1的整个氨基酸序列是1AYPYDVPDY(SEQ ID NO:1)，最后8个氨基酸(斜体，下划线)对应于改性的HA标签。随后，通过使用PCR的定点诱变将突变K391E、E580G和S660A引入PB1。突变K267S、F406Y或W359F是通过用QuickChange II XL试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉市的安捷伦公司)进行定点诱变引入到B/布里斯班/60/2008基因组的PB2片段中的。PCR反应是用Pfu超DNA聚合酶AD(加利福尼亚州圣克拉拉市的安捷伦公司)或Phusion高保真DNA聚合酶(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)进行的。对所有构建的质粒进行测序，没有发现不需要的突变。图1示出了引入IBV基因组的所有改性及其各自结果的示意图。

(4)通过反向遗传产生重组病毒。

使用293T/MDCK细胞的共培养物拯救病毒。为了产生B/Bris att、B/Bris PB2-F406Y和B/Bris PB2-W359F病毒，将各自的突变质粒与剩余的7个WT B/Bris质粒配对。B/Wis PB2-F406Y病毒是一种2:6重配体，携带WT B/Wis表面基因和B/Bris PB2-F406Y病毒内部基因群。转染后，转染细胞在35℃孵育。孵育24小时后，用含有1μg/mL的TPCK胰蛋白酶(新泽西州莱克伍德的Worthington Biochemicals公司)和抗生素/抗真菌溶液的Opti-MEM I(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)代替培养基。病毒拯救(第0代，P0)后，用组织培养上清液接种新鲜MDCK细胞，扩增病毒一次(P1)。P1中病毒被用于在MDCK细胞(P2)中进一步扩增，然后在SPF卵(E1)中进一步扩增。在E1中获得的病毒用于在SPF卵(E2)中培养病毒悬液。P1、P2、E1和E2病毒扩增在33℃下进行。病毒悬液通过组织培养感染剂量50(TCID₅₀)和卵感染剂量50(EID₅₀)进行滴定。病毒滴度用Reed-Mench法测定。

(5)减毒乙型流感病毒的稳定性。

通过桑格法和/或下一代测序(NGS)对所有病毒悬液进行测序，以评估获救病毒中***突变的存在。为了确定减毒标记的稳定性，在MDCK细胞中连续传代B/Bris att病毒(E2)20次或在SPF卵中传代15次。分别从组织培养上清液和尿囊液中提取的RNA，用RNeasy微型试剂盒(加利福尼亚巴伦西亚的Qiagen公司)纯化。分离的RNA作为模板，使用IlluminaMiSeq平台进行一步RT-PCR全IBV基因组扩增和NGS。此外，接种疫苗后(dpv)3天和5天从小鼠获得的混合鼻甲匀浆用于RNA分离。使用两步RT-PCR反应扩增PB1片段，并测序以验证免疫后B/Bris att病毒的稳定性。

(6)微型基因组分析。

为了评估病毒聚合酶活性，构建了高斯荧光素酶(GLuc)报告质粒(pBNPGLuc)。Gluc开放阅读框(ORF)通过PCR从pGLuc-Basic(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)扩增，并亚克隆到pDP2002。质粒被设计成使得GLuc ORF位于IBV NP片段的5’和3’非翻译区(UTR)的两侧。通过去除紧邻5’-UTR上游的pCMV启动子进一步改性该构建体。通过测序证实所得质粒没有不需要的改性。根据制造商的说明，使用TransIT-LT1转染试剂(威斯康星州麦迪逊的Mirus公司)在与pCMV-SEAP、pBNPGLuc、B/Bris PB2、PB1、PA和NP质粒共转染的293T细胞中重建vRNP微基因组分析。pCMV-SEAP质粒表达分泌的碱性磷酸酶，并用于转染效率的标准化。在指定的时间点，收集转染细胞的组织培养上清液，使用Victor x3多功能盘式分析仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司)测量报告活性。GLuc活性使用Biolux Gaussia萤光素酶分析试剂盒(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)进行评估，而磷酸酶活性使用磷酸酶-光SEAP报告基因分析系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)进行测定。实验至少独立进行两次，每次实验测试所有转染条件三次。

(7)免疫印迹。

融合的MDCK细胞在37℃下于1MOI接种流感病毒(WT RG-B/Bris、B/Bris ts、B/Bris att或7attWF10:1malH7)1小时。7attwf10:1malH7病毒是一种重配的IAV att对照病毒。接种后，将感染细胞在33℃孵育20小时。然后除去上清液，用150μl含有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液(加利福尼亚州伯克利的Bio-Rad)裂解细胞。细胞裂解物煮沸7分钟，然后短暂超声处理。蛋白质在4-20％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，并转移到硝酸纤维素膜(加利福尼亚州伯克利的Bio-Rad)上进行免疫印迹分析。将膜在室温下封闭在5％分子级无脂奶粉中(NFDM，加利福尼亚州伯克利的Bio-Rad)2小时，然后在室温下与抗GAPDH小鼠初级抗体(得克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotech公司)或小鼠抗HA标签初级抗体(马萨诸塞州丹佛斯的Cell Signaling Technologies公司)孵育2小时。洗涤后，将膜与偶联辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG抗体(亚拉巴马州伯明翰的SouthernBiotech公司)孵育。免疫反应性蛋白质通过放射自显影使用增强化学发光试剂(ClarityWestern ECL Substrate，加利福尼亚州伯克利的Bio-Rad)可视化。

(8)体外生长动力学。

比较了WT RG-B/Bris和B/Bris att病毒在不同温度下的生长动力学。MDCK细胞的会合单层以每种病毒0.01MOI接种。在指定的时间点，收集接种细胞的组织培养上清液用于病毒滴度定量。病毒滴度用Reed-Muench法通过TCID₅₀测定。实验至少独立进行两次，每个实验测试所有条件三次。

(9)B/Bris PB2突变病毒的安全性评价。

为了评估PB2 F406Y和W359F突变对IBV毒性增加的影响，将DBA/2J小鼠(马里兰州弗雷德里克的Charles River实验室)随机分为4组(n＝10/组)。用异氟醚麻醉每只小鼠，然后通过鼻内(I.N.)途径接种。第1组接受50μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并作为对照组。第2组、第3组和第4组的每只小鼠分别以10⁵EID₅₀接种50μl的B/Bris PB2-F406Y、B/Bris PB2-W359F或WT RG-B/Bris病毒的PBS。每天监测疾病的临床症状、体重变化和死亡率。

(10)疫苗接种和攻击研究。

为了评价B/Bris att的免疫应答和保护效果，将DBA/2J小鼠(马里兰州弗雷德里克的Charles River实验室或缅因州巴尔港的杰克逊实验室)随机分为5组(n＝24/组)。用异氟醚麻醉每只小鼠，然后鼻内接种。第1组、第2组和第3组接收50μl的PBS，作为模拟接种对照组。第4组和第5组中的每只小鼠以10⁶EID₅₀接种50μl的B/Bris att病毒的PBS。另一组中(n＝8)每只小鼠以10⁶EID₅₀接受WT RG-B/Bris病毒，并作为对照来体内评估B/Bris att的减毒表型。接种后(dpi)第3天和第5天，每组3或4只动物被人道安乐死以收集组织。收集鼻甲和肺进行病毒滴度定量和组织病理学检查。在攻击的前一天(20dpi)，从小鼠下颌下静脉采血，以测量中和抗体反应。在21dpi时，第1组未被攻击，而第2、3、4和5组(n＝16/组)的每只小鼠在50μl的B/Bris PB2-F406Y或B/Wis PB2-F406Y病毒的PBS中以10⁷EID₅₀进行了鼻内攻击。IBV自然分离物通常不会对小鼠致死，除非该病毒在该物种中连续适应，或者使用高剂量的病毒进行接种。由于在接种了B/Bris PB2-F406Y和B/Bris PB2-W359F病毒的小鼠中观察到毒性增加(图2A和B)，选择B/Bris PB2-F406Y病毒用于疫苗效力研究中的致死攻击。同样，B/Wis PB2-F406Y病毒是针对异源(抗原特异性)攻击而产生的。如上所述，在攻击后3天和5天(dpc)，每组4只小鼠被人道安乐死用于组织收集。在21dpc时，所有剩余的小鼠(n＝8/组)从下颌下静脉放血进行血清学检查。在整个研究过程中，每天监测疾病的临床症状、体重变化和死亡率。

(11)HI测定。

按照所述(WHO，2002年)，使用WT B/Bris病毒或WT B/Wis病毒作为抗原，对20dpi和21dpc收集的血清样本进行HI测定，检测中和抗体的存在。

(12)组织病理学。

在指定的时间点，收集接种后和攻击后实施安乐死的小鼠的肺，并保存在10％***中，通过苏木精-伊红(H&E)染色进行组织病理学检查。基于组织损伤和炎症水平的增加，对支气管/细支气管、肺脉管系统、肺泡的组织切片和肺损伤的总体程度进行0-4分评分。肺部组织病理学的代表性图像以20倍放大倍率拍摄。

(13)统计分析。

所有数据分析都是使用GraphPad Prism软件第7版(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Software公司)进行的。所有体外试验至少进行两次，一次三个平行样。为了进行多次比较，进行了双向ANOVA，随后进行post-hoc Bonferroni试验。使用对数秩检验分析存活曲线的差异。低于0.05(<0.05)的P值被认为是重要的。

b)结果

(1)乙型流感病毒中减毒标记的掺入和维持

与MDV-A病毒株ts表型相关的氨基酸取代已被定位于vRNP复合体，并显示可转移至其他IAV主链。实验室进行的早期工作表明，仅这些取代并不能在体内产生足够的减毒水平(即定义为下呼吸道复制没有或显著减少)。为了在体内实现充分的减毒，需要在IAV病毒(来自禽类或猪源)的PB1中额外框架内掺入一个C端标签。

在这项研究中，对是否发生乙型流感病毒的改性和由此产生的att表型进行了评估(图1)。具体而言，使用B/布里斯班/60/2008病毒株，评估PB2(K267S)、PB1(K391E、E580G和S660A)和携带C端HA标签的嵌合PB1(存在或不存在ts突变)中的突变。试图拯救携带PB2K267S突变的IBV病毒导致了该位置的不稳定性，因此努力方向重新定向以生产具有替代PB2突变的病毒。产生了携带PB2 F406Y或PB2 W359F突变的IBV病毒，因为这些突变中的任何一种都会影响蛋白质的帽结合和病毒的聚合酶活性。令人惊讶的是，在DBA/2J小鼠中，B/Bris PB2-F406Y和B/Bris PB2-W359F病毒表现出增强的毒性(图2)。因此，B/Bris基因组的进一步改性集中在PB1片段上。携带突变K391E、E580G和S660A的B/Bris突变病毒在有或没有C端HA标签的情况下产生(图3A)。独立的病毒拯救尝试表明，K391E突变在MDCK细胞的早期病毒传代(P2)中很容易检测到，但在SPF卵传代(E2)后很快丢失。虽然IAV主链的温度敏感表型主要由PB1 K391E和E581G突变决定，但以下数据表明K391E突变对IBV病毒的衰减并不重要。由于具有结合的E580G、S660A和HA标签改性的B/Bris突变病毒(本文称为B/Brisatt)在组织培养细胞或SPF卵中的几次传代中是稳定的，其进一步的特征在于确定其是否在体外包含ts表型和/或其是否在体内被减毒。

(2)B/Bris att显示温度敏感表型

B/Bris att候选疫苗的体外鉴定始于在vRNP微基因组分析中评估聚合酶活性(通过Gluc表达水平测量)(图3B和C)。IBV vRNP复合物的相应组分(包括PB2、PB1(或其突变体)、PA、NP和pBNPGLuc报告质粒，以及pCMV-SEAP质粒)在293T细胞中共转染。GLuc报告活性通过SEAP酶活性标准化，并作为病毒聚合酶复合物活性的替代物。转染后，细胞保持在33℃、35℃、37℃和39℃。在指定的时间点，收获转染细胞的上清液以测量报告活性。结果表明，在33℃时，转染后24小时(P＝ns)或48小时(P＝ns)(hpt)时，B/Bris att和WT RG-B/Bris vRNP复合物均显示相似水平的GLuc报告活性(分别见图3B和图3C)。在35℃时，两种vRNP复合物都达到聚合酶活性峰值，尽管与WT RG-B/Bris相比，B/Bris att聚合酶复合物显示荧光素酶活性降低(在24hpt时，P<0.0001)。温度升高到37℃进一步强调了在所分析的任一时间点，B/Bris att和WT RG-B/Bris聚合酶复合物之间荧光素酶活性水平的统计学显著差异(在24h时，P<0.001；在48h时，P<0.0001)，表明PB1的改性赋予B/Bris att ts表型。正如预期的那样，在39℃时，B/Bris att和WT RG-B/Bris聚合酶复合物都表现出荧光素酶活性的剩余水平。

为了进一步表征PB1改性对ts表型的影响，评估了B/Bris att和WT RG-B/Bris病毒的生长动力学。MDCK细胞的会合单层在0.01MOI被感染，病毒生长动力学在33℃、35℃、37℃、37.5℃和39℃被监测。总的来说，生长动力学结果显示出与用vRNP重组试验观察到的趋势相似。在33℃时，B/Bris att和WT RG-B/Bris病毒都生长到相似的滴度(图4A)(P＝ns不论测试的时间点)。与病毒聚合酶复合物分析结果相反，在35℃时，B/Bris att和WT RG-B/Bris病毒也生长到相似的滴度(图4B)(P＝ns在12、24、48和72hpi时)。在37℃时，WT RG-B/Bris病毒的生长水平与在33℃和35℃时观察到的水平相似(图4C)。相比之下，与WT RG-B/Bris病毒相比，在感染后(hpi)24小时(P<0.01)、48小时(P<0.0001)或72小时(P<0.001)，37℃下，B/Bris att显示病毒生长受损(图4C)。与WT RG-B/Bris相比，温度上升半度导致B/Bris att病毒生长进一步下降，在24hpi(<0.01)时病毒滴度下降约2个对数(图4D)。没有一种病毒在39℃生长到可检测的水平，这与vRNP重组分析数据一致(图4E)。综上所述，这些结果表明PB1中引入的改性在体外导致了具有ts表型的B/Bris att病毒。

(3)B/Bris att病毒能够安全地在小鼠体内给药，并具有免疫原性

为了研究体外观察到的ts表型是否会导致体内B/Bris att病毒的衰减，对其在小鼠中的安全性进行了评价。DBA/2J小鼠组随机分为实验组。每只小鼠滴鼻接种PBS(模拟)、10⁶EID₅₀的B/Bris att病毒，或10⁶EID₅₀的WT RG-B/Bris病毒。每天记录疾病的临床症状、体重变化和死亡率。体重监测显示接种候选B/Bris att疫苗后体重没有下降(图5A)。在3和5dpi对小鼠子集(n＝4/组/时间点)实施安乐死，以确定鼻甲(NT)和肺中以及上呼吸道和下呼吸道的病毒复制水平。B/Bris att和WT RG-B/Bris病毒在上呼吸道均复制良好，鼻甲中的病毒检测证明了这一点(P＝ns，图5B)。这些结果与在33℃下进行的vRNP重组分析和生长动力学实验一致。相反，只有接种了WT RG-B/Bris病毒的小鼠在下呼吸道中具有可检测的病毒复制水平，如3dpi(P<0.05)和5dpi(P＝0.001)时肺中的显著病毒水平所示(图5C)。在5dpi采集的肺样本的组织病理学发现进一步支持了这些结果。肺的评分为0-4分，其中四(4)分表示严重的肺病变。模拟接种或接种了B/Bris att病毒的小鼠肺在5dpi时的平均全肺评分为0(表2，图5D和5E)。相比之下，接种WT RG-B/Bris病毒的小鼠的肺在5dpi时的平均全肺评分为二(2)，其特征在于肺中存在轻度损伤和支气管腔中存在碎片(表2，图5F)。这些发现与vRNP重组分析和生长动力学实验相一致，其显示在37℃下，B/Bris att的聚合酶活性和病毒生长降低。

表2小鼠肺的组织病理学发现

为了评估中和抗体反应，所有小鼠在20dpi下放血，然后对同源WT B/Bris病毒和异源WT B/Wis病毒进行HI测定。几乎所有B/Bris att接种小鼠血清样本(n＝13/16)的HI抗体滴度等于或大于针对同源病毒的40(图5G)，表明在当前的保护替代物标准上有足够的和潜在的保护性抗体应答。有趣的是，两只(n＝2/16)B/Bris att接种的小鼠通过HI测定没有显示血清转化。正如预期的那样，没有一只B/Bris att接种的小鼠产生针对异源B/Wis病毒的HI抗体滴度(图5G)。

(4)B/Bris att病毒赋予对同源攻击的杀菌免疫力(B/Bris PB2-F406Y)

为了评估B/Bris att候选疫苗的效力，模拟接种或B/Bris att接种的小鼠(n＝16/组)在21dpi下通过滴鼻途径以每只小鼠10⁷EID₅₀用B/Bris PB2-F406Y病毒进行攻击。因为毒性更强，所以选择了B/Bris PB2-F406Y病毒而不是WT B/Bris(图2)。另一个对照组在整个研究过程中没有受到攻击(n＝16，模拟-模拟)。在B/Bris PB2-F406Y病毒攻击后，B/Bris att免疫小鼠没有显示明显的疾病迹象。免疫/攻击小鼠组的体重变化与未受攻击对照组的体重变化没有区别(图6B)。所有B/Bris att免疫小鼠在B/Bris PB2-F406Y病毒的攻击下存活(P<0.0001，图6A)。相比之下，用B/Bris PB2-F406Y病毒攻击的对照模拟接种小鼠经历了大规模的疾病和体重减轻的临床症状。除了一只小鼠之外，所有接受过B/Bris PB2-F406Y病毒攻击的模拟接种小鼠要么死于感染，要么在攻击后第8天必须接受人道安乐死(图6A)。在3和5dpc时，从所有组中收集肺和鼻甲用于病毒滴定。在3或5dpc时，在B/Brisatt免疫小鼠肺或鼻甲中未检测到病毒(图6C和D)。正如预期的那样，在模拟接种的、B/BrisPB2-F406Y攻击的小鼠中，在3和5dpc检测到包括肺和鼻甲在内的整个呼吸道中广泛的病毒复制(图6C和D)。此外，B/Bris att接种的小鼠，在21dpc时显示针对同源B/Bris病毒的HI抗体滴度增加(图6E)。总的来说，这些结果表明，候选B/Bris att疫苗赋予小鼠对同源病毒的杀菌免疫。

(5)B/Bris att病毒保护小鼠免受异源攻击(B/Wis PB2-F406Y)

与灭活疫苗相比，减毒活流感疫苗(LAIV)除了引起全身性的B细胞和T细胞介导的反应外，还能引起局部粘膜免疫，从而提供更多的交叉保护性免疫反应。为了评估交叉保护的程度，模拟或B/Bris att免疫小鼠在21dpi时用B/Wis PB2-F406Y病毒以每只小鼠10⁷EID₅₀进行攻击。所有B/Bris att免疫小鼠(n＝8)在异源B/Wis PB2-F406Y病毒的攻击中存活，而约40％的受攻击模拟接种小鼠(P<0.05)要么死于病毒感染，要么由于严重的临床疾病和/或体重减轻而被安乐死(图7A和图7B)。相比之下，B/Bris att免疫小鼠在异源攻击后仅经历了轻微的体重减轻(图7B)。在3和5dpc时，收集的肺组织(在3dpc时，P<0.05；在5dpc时，P<0.01)和鼻甲组织(在3dpc时，P<0.01；在5dpc时，P<0.0001)的分析显示，在B/Bris att免疫小鼠中病毒载量比在受攻击的模拟接种小鼠中降低(图7C和图7D)。正如所预料的那样，当在21dpc测量时，B/Bris att免疫小鼠经历了针对疫苗病毒的HI抗体滴度的提高和对异源B/Wis PB2-F406Y攻击病毒的有限应答(图7E)。异源B/Wis PB2-F406Y病毒攻击后，B/Bris att免疫不提供杀菌免疫。尽管如此，几乎所有B/Bris att免疫小鼠[n＝3/4(75％)]在5dpc时清除了攻击病毒感染(图7C和图7D)，表明由非中和抗体、T细胞和/或两者的组合介导的交叉保护反应。

(6)接种B/Bris att减少IBV攻击后肺部病理。

在5dpc采集的肺样本的组织病理学检查进一步证实了疫苗攻击研究。来自用B/Bris PB2-F406Y病毒攻击的模拟接种小鼠的肺，在存在局灶异常、支气管和细支气管碎片、轻度坏死、肺泡炎和血管炎的情况下，获得了2分(表2，图8A)。相比之下，来自被B/BrisPB2-F406Y病毒攻击的B/Bris att免疫小鼠的肺得到的总体组织病理学评分为零(0)，类似于来自模拟接种、模拟攻击小鼠的肺(表2，图8B和图8C)。在DBA/2J小鼠中，虽然B/Wis PB2-F406Y病毒的致死率低于B/Bris PB2-F406Y病毒，但组织病理学更为严重。在肺病理严重程度的0-4分尺度上，来自用B/Wis PB2-F406Y病毒攻击的模拟接种小鼠的肺获得了三(3)分的全肺评分，其中存在局灶异常、支气管中的大量碎片、细支气管中的坏死和包涵体、严重的局灶性肺泡炎和轻度血管炎(表2，图8D)。尽管来自用B/Wis PB2-F406Y攻击的B/Brisatt免疫小鼠的肺也获得了3分的全肺评分，但是与攻击的模拟接种组相比，组织病理学发现(支气管和细支气管中的碎片、中度局灶性肺泡炎和轻微血管炎)较轻(表2，图8E)。这些结果与B/Bris att刺激的免疫反应在减少病毒载量和促进快速病毒清除方面的保护作用一致。总的来说，这些结果表明B/Bris att候选疫苗诱导了强有力的保护性免疫应答，该应答可以减少小鼠在抗原同源或异源IBV攻击后的肺病理。

(7)B/Bris att病毒的稳定性

确定遗传稳定性仍然是候选LAIV研发的一个重要步骤。因此，在33℃下，E2悬液中的B/Bris att病毒在SPF卵(15次，从sEl到sE15)或MDCK细胞(20次，从sP1到sP20)中连续传代。连续传代后，从尿囊液和组织培养上清液中分离出的RNA进行全IBV基因组扩增和下一代测序。PB1片段的测序分析证实，在SPF卵和/或MDCK细胞中连续传代后，所有引入的改性(E580G、S660A和改性的HA标签)都得以稳定维持(表3)。在PB1中，sPl中出现一个氨基酸位置E48K(G163A)的突变，并通过sP20维持。有趣的是，sPl和sP20病毒都含有PB1 K391E突变，这种突变之前在制备E2悬液时丢失(或至少低于检测限)。在含有PB1 K391E突变的E2病毒悬液中可能残留有少量病毒群体。随着潜在补偿性PB1 E48K突变的获得，很容易推测E391在MDCK细胞传代病毒中变得稳定。sE15传代病毒在这两个位置(E48和K391)都显示出WTPB1序列；然而，它显示了在位置V474I(G1441A)处E2病毒悬液的一个变化(表3)。在3和5dpi时从B/Bris att免疫小鼠的混合鼻甲组织中提取的vRNA揭示了***的减毒标记(E580G、S660A和改性HA标签)的稳定性。更重要的是，在鼻甲样本的测序PB1片段中没有发现额外的突变。这些结果强调了B/Bris att病毒在体内的安全性和稳定性。

(c)讨论

本研究描述了一种IBV候选疫苗的开发，该疫苗具有一个改性PB1片段，B/Brisatt。PB2和PB1中突变的选择和PB1中HA表位标签的结合是基于IAV att病毒疫苗的经验和IBV的类似氨基酸与具有类似功能的区域重叠的假设。最初的目标是整合所有可能的类似突变；然而，其中有限的一组是耐受的、稳定的，或者提供了所需的减毒表型。PB2 K267S(IAV PB2中的N265S)对病毒拯救有害，但对聚合酶活性无害，在小基因组分析中，聚合酶活性在PB1 att改性的情况下降低。令人惊讶的是，与WT病毒株相比，PB2的替代突变(F406Y或W359F，先前已知会削弱帽结合活性)并没有减弱而是增加了小鼠中B/Bris毒性。众所周知，在小鼠身上，IBV病毒株通常不是致命的，除非病毒被强制适应这个物种。利用这些新发现，并在随后的疫苗效力研究中使用了B/Bris PB2-F406Y病毒进行致死性攻击。类似地，B/WisPB2-F406Y病毒是为异源攻击而产生的，其对小鼠的致死率比WT B/Wis病毒高，但比B/BrisPB2-F406Y病毒低。

桑格测序和下一代测序被用来更好地理解B/Bris att病毒在工程突变和HA标签添加内外的稳定性。将从SPF卵或组织培养细胞获得的B/Bris att病毒早期传代的全基因组序列与通过在SPF卵或MDCK细胞中多次传代获得的全基因组序列进行比较。这些序列进一步与从流感研究数据库(IRD)获得的IBV PB1序列进行比较。在IRD有超过4000个完整的IBV PB1序列，但只有793个在至少一个氨基酸上彼此不同，表明这一特定片段具有显著的稳定性。

PB1 K391E和E580G突变(与IAV PB1中相同)是可耐受的，并导致足够的聚合酶活性；然而，K391E并不总是稳定地保持在SPF卵中。K391E突变存在于在MDCK细胞中生长的病毒中(P1)，但在SPF卵(E2)中传代时丢失。PB1 E48K突变的出现起到了补偿作用，并有助于维持MDCK细胞的K391E突变。必须注意的是，PB1 E48K突变也出现在B/Bris ts(无HA标签)的另一种病毒拯救迭代中，该迭代在卵(sE9)中连续9次传代后也维持K391E突变。PB1 E48K突变是本报告中制备的重组病毒独有的，在自然界中没有其他IBV病毒PB1片段倾向于这种突变。

PB1 E580G在MDCK细胞、SPF卵中以及在小鼠中复制至少5天后被稳定维持。PB1E580G突变不是B/Bris att病毒独有的，尽管它在自然界中似乎并不常见：如果考虑到IRD现有的所有非重复的IBV PB1序列，所分析的793个独特的IBV PB1序列中只有4个包含G580，约0.5％。没有发现PB1 G580突变株与任何特定季节或位置的关联；其代表与更常见的PB1 E580(野生型)病毒株共同传播的分离株。

PB1 S660A突变(IAV PB1中的A661T)的设计是违反直觉的。在IAV，PB1 A661T突变中疏水至极性氨基酸的变化导致其衰减。简单地假设IBV PB1的相反变化(即极性至疏水性氨基酸S660A突变)是稳定的，并有助于病毒的衰减。事实上，S660A突变是B/Bris att病毒独有的，在SPF卵或MDCK细胞的多个连续传代中是稳定的，并对B/Bris的ts表型有贡献。

将C端HA标签掺入到B/Bris的PB1中也具有良好的耐受性，并且在SPF卵或MDCK细胞的多次连续传代中非常稳定。就像改性的IAV病毒一样，HA标签不会严重影响IBV的聚合酶活性，也不足以在体内减弱病毒。E580G和S660A突变与PB1中的C端HA标签的组合产生了体外具有ts表型和体内减毒的B/Bris att病毒。高温(≧37℃)下聚合酶复合物活性降低和病毒生长动力学降低，表明ts表型明显。B/Bris att病毒在小鼠肺中的复制缺陷表明该病毒在体内被减毒。PB1 E580G、S660A和HA标签不仅在多次传代后稳定地保持在SPF卵或MDCK细胞中，而且在从感染小鼠鼻甲分离的病毒中保持至少5天。

sE15传代B/Bris att病毒在PB1 V474I中显示了一个额外的氨基酸突变。PB1I474在野外IBV分离株中相当常见。在IBV PB1病毒群体中，V474和I474都不是固定的。PB1I474存在于1940年至2000年分离的100％病毒株中，包括冷适应的B/安阿伯市/1/66病毒株。因此，可以推测，V474I突变不太可能影响B/Bris att的体外或体内表型。V474I突变是否反映鸡蛋生长的适应性仍有待确定。此外，在sE15传代病毒中，在PA(K489Q)和NP(D377N)中发现了单个氨基酸突变。PA K489Q突变似乎是sE15 B/Bris att病毒独有的，而NP D377N在至少一个野外分离株中发现。这些突变对病毒衰减的影响尚不清楚。其他片段保持不变，与预测的野生型序列相比，sE15病毒中既没有观察到氨基酸也没有观察到核苷酸变化。同样，在sP20病毒中，与预测序列相比，PB2、PA、HA、NP、NB、M、BM和NEP开放阅读框没有观察到氨基酸变化。sP20病毒确实显示了相对于sPl病毒的两个氨基酸变化，一个在NA(K371E)中，一个在NS1(M106T)中。这两种突变并不是sP20病毒独有的，在IBV病毒株中NA K371E突变相当常见。下一代测序可以以前所未有的详细程度来检查活病毒疫苗的稳定性。尽管在连续传代中观察到氨基酸的变化，但是B/Bris att病毒在HA中没有变化，并且在PB1的工程位点具有很大的稳定性。其他变化似乎对改变病毒的减毒表型并不重要。

B/Bris att病毒的生长特性对于安全的LAIV疫苗来说是理想的。在10⁶EID₅₀的高病毒剂量接种后，小鼠体内的B/Bris att是安全的，不会导致体重减轻。病毒复制仅限于上呼吸道，鼻甲中的病毒检测证明了这一点，但肺部没有。在用同源的B/Bris PB2 F409Y病毒株进行攻击时，所有B/Bris att接种小鼠都表现出杀菌免疫，因为在所调查的任何一天在肺或鼻甲中都没有检测到攻击病毒。此外，任何接种疫苗的小鼠在攻击后均未出现体重减轻。相比之下，模拟接种组中受到攻击的小鼠死于感染；只有一只存活，它在攻击后经历了大约20％的体重减轻。

B/Bris att接种小鼠也在异源B/Wis PB2-F406Y病毒株的攻击中存活下来。尽管B/Bris att接种小鼠在用异源病毒攻击后经历了一些轻微的体重减轻，但与被攻击的模拟接种小鼠组形成鲜明对比，因后者显示出显著的体重减轻。B/Bris att保护性应答没有赋予对异源攻击的杀菌免疫。然而，大多数B/Bris att免疫小鼠产生了足够的免疫应答，以减少病毒复制和促进快速病毒清除。局部粘膜免疫可能参与保护机制，因为在抗原性不同的IBV HA谱系中HI抗体应答缺乏交叉反应性。最近，几项研究证实了流感感染后肺部组织驻留记忆(T_RM)细胞的发育，以及它们在增强外周进入部位感染防护中的关键作用。必须进行进一步的研究，以便更好地确定对有助于交叉保护的B/Bris att疫苗的体液和T细胞依赖性反应。

在过去的几年里，流感疫苗的开发已经转向寻找通用的疫苗方法，这种方法需要更少的更新和更持久的免疫。在很大程度上，这些努力忽视了围绕减毒活病毒概念开发通用疫苗的潜在好处，而主要侧重于引发对HA更保守区域的广泛中和抗体反应。虽然最近在抗原设计方面取得了进展，以打破HA头部的免疫优势，并诱导对HA柄部的广泛保护性反应，但正如最近的一项研究表明的那样，人类群体中连续暴露于传播的季节性流感毒株可能会削弱这些策略的长期可行性。由于体液(主要是IgG和IgA)和T细胞(病毒特异性CD4+和CD8+T细胞)介导的免疫应答的刺激，而不是单纯的与灭活和一些通用疫苗(54-56)相关的体液(IgG)应答，减毒活疫苗已显示出比灭活疫苗更好的保护作用。LAIV疫苗还显示出增强先天免疫反应和刺激对异源或抗原性差异病毒株的交叉保护反应。其他优势包括LAIV疫苗直接给药(无针输送)和LAIV疫苗生产和加工的基础设施容量较小。

在过去三季(2013-2014年、2014-2015年和2015-2016年)，美国许可的LAIV疫苗(FluMist)在疫苗效力方面遇到了许多问题。虽然疫苗诱导的免疫应答的鲁棒性有限的原因仍有争议，而且仍在调查中，但可能的原因包括HlNl组分的性能不佳、包含第二个IBV株以及由于多年来相继暴露于相同的LAIV疫苗主链而可能降低免疫原性。基于A/安阿伯市/6/60(H2N2)和B/安阿伯市/1/66冷适应(ca)主链的当前许可的LAIV疫苗的这些可感知的局限性突出了在LAIV开发中持续投资的重要性，并为改进当前策略以开发更有效的疫苗提供了机会。已经采取了多种策略来开发替代实验性LAIV流感疫苗。这些策略包括但不限于全部和部分基因敲除、外源序列的***和HA切割位点的操纵。在NS、M、NA和PB2部分和完全敲除疫苗方面已经做了大量的工作，虽然这种疫苗已被证明是有效的，但也有缺点。例如，为了达到疫苗株所需的生长水平，全敲除疫苗必须生长在未经FDA批准的稳定表达缺失基因的细胞系中。将病毒生长限制在弹性蛋白酶存在下的操纵HA切割位点策略，在经批准的细胞系中生长到高滴度，但在体外显示出一些不稳定的迹象。最后，虽然这些策略中的一些被证明对于IBV是有效的，但是这些策略中的大多数仅在IAV的情况下进行了测试。

实验室开发了一种替代的IAV策略，该策略结合了在A/安阿伯市冷适应主链中发现的PB2突变和PB1突变。此外，该策略还包括在PB1的C端框内引入一个源自H3 HA的9氨基酸HA标签。该策略的安全性和有效性已在卵内以及小鼠、鸡和猪模型中得到证实。此外，它在已建立的细胞系和SPF蛋中生长到高滴度。目前的研究表明，在小鼠模型中，2个突变(而不是在许可的B/安阿伯市ca主链中发现的7个突变)加上在PB1的C端的改性HA标签，足以减弱IBV。值得注意的是，掺入减毒IBV病毒(E580G和S660A)中的2个突变类似于A/安阿伯市ca主链中存在的突变子集。当代衰减IAV和IBV(本研究)主链的可用性为LAIV的开发提供了一个替代平台，可以克服当前的局限性。

F.示例2：减毒活流感病毒四价疫苗

为了在与流感病毒保护更相关的制剂中检测减毒活乙型流感病毒，制备了四价以提供甲型流感保护和乙型流感保护。四价流感病毒(QIV)制剂包含Ty/04att(H3N2)、ma Ca/04att(H1N1)、B/Bris att和B/Wisc [email protected]⁶TCID₅₀每种病毒/50μl。

1.方法

a)QIV疫苗配方

用Ty/04att(H3N2)、ma Ca/04att(H1N1)、B/Bris att和B/Wisc [email protected]⁶TCID₅₀每种病毒/50μl免疫小鼠。Ty/04att(H3N2)病毒株含有来自野生型A/turkey/OH/313053/2004(H3N2)病毒的6个基因片段和PB2att和PB1att基因片段。ma Ca/04(H1N1)att病毒株含有来自小鼠适应的A/加利福尼亚州/04/09(H1N1)的6个基因片段和来自Ty/04att(H3N2)的PB2att和PB1att基因片段。B/Bris att包含来自野生型B/布里斯班/60/2008的7个基因片段和PB1att片段(病毒聚合酶PB1片段在残基580和/或660处衰减)。B/Wis att包含B/威斯康星州01/2010在B/Bris att背景下的表面基因片段。

b)攻击病毒

小鼠攻击中使用的病毒是ma Ca/04(H1N1)病毒株和B/Bris PB2 F406Y病毒株。maCa/04(H1N1)病毒株是Ye等人在PLoS Path杂志2010中描述的小鼠适应型A/加利福尼亚州/04/09(H1N1)病毒株，其在野生型Ca/04(H1N1)病毒在DBA/J2小鼠中单次传代后获得。B/Bris PB2 F406Y是来源于B/布里斯班/60/2008的病毒株，其携带PB2(F406Y)突变，该突变增加了其在小鼠中的毒性，如Santos等人在JVI杂志2017中所述。

(c)免疫和攻击

小鼠在第0天用鼻内递送的方式进行初始免疫接种QIV，然后在第21天通过鼻内接种QIV进行增强免疫接种。初次免疫后42天，通过鼻内接种ma Ca/04(H1N1)病毒株(甲型流感)或B/Bris PB2 F406Y病毒株(乙型流感)，以10⁷TCID_5O/病毒/小鼠攻击小鼠。小鼠在用QIV增强前的第20天放血，在攻击前的第41天再次放血。攻击后，在攻击后第4天(初始免疫后第47天)和攻击后第21天(初始免疫后第63天)处死小鼠。在整个免疫和攻击过程中测量体重减轻和存活率。

2.结果

a)QIV保护小鼠免受甲型和乙型流感病毒感染

为了测试QIV疫苗对甲型和乙型流感病毒的攻击是否有效，DBA/2J小鼠接种了QIV或模拟接种了PBS。在21dpi时，如上所述使用QIV增强小鼠。在攻击的前一天[增强后20天(dpb)]，对4只小鼠/组进行放血并收集血清以测量中和抗体反应。在21dpb时，用小鼠适应的Ca/04(ma-Ca/04)(QIV组n＝1l，模拟接种的PBS n＝11)以10⁷TCID₅₀/小鼠的剂量或B/Bris PB2-F406Y(QIV组n＝1l，模拟接种的PBS n＝11)以10⁷TCID₅₀/小鼠的剂量攻击小鼠。第三组以模拟PBS作为对照(n＝8)进行攻击。每天监测小鼠的体重减轻和存活情况。在攻击后第5天(dpc)，每组处死3只小鼠，收集肺和鼻甲样本用于病毒滴度的定量。在21dpc时，处死所有小鼠，收集血清、鼻洗液和支气管肺泡灌洗液(BALF)以评估抗体反应。如图9所示，与模拟免疫/模拟感染阴性对照组相比，接受QIV的小鼠在攻击后没有任何明显的体重减轻，并且在整个攻击期间都有100％的存活率。相比之下，接受攻击的模拟免疫小鼠显示出显著的体重减轻，甲型流感攻击组没有存活者，乙型流感攻击组只有20％的存活者。

b)QIV防止攻击病毒在小鼠体内复制

采集肺和鼻甲样本，用于攻击后5天病毒脱落的滴定(图10)。QIV接种小鼠在检测限以下显示出攻击病毒，而PBS对照接种小鼠在攻击后的肺和鼻甲中显示出显著的病毒滴度。

c)QIV在增强后引发明显的HI反应

在20dpi、20dpb和21dpc收集的血清样本通过血凝抑制(HI)测定分析中和抗体的存在，该测定使用WT Ty/04(H3N2)、ma Ca/04(HlNl)、WT B/Bris和WT B/Wis病毒(图11)。初次接种疫苗后，HI反应高于背景水平，其水平与使用替代性减毒活流感病毒疫苗的文献中报道的水平相似或更高。增强后HI滴度增加，大多数反应在1:40或更高，表明为保护性反应。攻击后的HI活性显示了对攻击病毒(B/Bris或ma Ca/04(HlNl)，对异源病毒H3N2或B/Wis无显著变化)的增强反应的预期模式。请注意，有一个单独的PBS控制组用于启动和增强，还有一个单独的PBS-PBS攻击控制组，它们已包含在每个相应的图表中，仅供说明之用。

D)QIV促进病毒特异性IgA和IgG反应

用来自午餐和鼻甲的样本以及来自粪便、血清、鼻洗液和收集的BALF的样本，通过ELISA检测受攻击小鼠的HlNl特异性IgA反应(图12A)。(与没有IgA应答的ma Ca/04(H1N1)的PBS对照攻击相比)接种QIV的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗ma Ca/04(H1N1)病毒的IgA抗体。小鼠的IgA应答在攻击后至少维持3周。类似地，当从B/Bris特异性IgA应答进行分析时，(与没有IgA应答的B/Bris的PBS对照攻击相比)接种QIV的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗B/Bris病毒的IgA抗体(图12B)。小鼠的IgA应答在攻击后至少维持3周。

此外，当检测病毒特异性IgG抗体时，ELISA显示QIV促进H1N1特异性IgG应答(图12C)。(与没有IgG应答的ma Ca/04(H1N1)的PBS对照攻击相比)接种QIV的小鼠在5dpc时表现出明显的高水平抗ma Ca/04(H1N1)病毒的IgG抗体。小鼠的IgG应答在攻击后至少维持3周。(与没有IgG应答的B/Bris的PBS对照攻击相比)接种QIV的小鼠在5dpc时也表现出明显的高水平抗B/Bris病毒的IgG抗体(图12D)。小鼠的IgG应答在攻击后至少维持3周。

为了查看非攻击性H3N2和B/威斯康星州病毒是否也存在病毒特异性IgA和IgG抗体，进行ELISA测定并检查病毒特异性抗体(图12E)。接种QIV的小鼠在21dpc用异源ma Ca/04(H1N1)或B/Bris病毒收集的鼻洗液、BALF和血清中显示出对Ty/04(H3N2)病毒的高水平IgA和IgG抗体应答。由于异源攻击后，针对Ty04(H3N2)病毒的HI应答没有改变(图11)，因此可以合理地推出：Ty04(H3N2)特异性IgA和IgG应答是由QIV制剂引起的。小鼠抗H3N2 IgA和IgG应答在攻击后至少维持3周。在21dpc时，用异源ma Ca/04(H1N1)病毒攻击的QIV组和PBS/非攻击对照组之间，对B/Wisc的IgA应答没有差异。然而，在用异源B/Bris病毒攻击后，对B/Wisc病毒的IgA应答受到刺激，这很可能是由于某种水平的交叉反应。在21dpc时收集的血清表明，QIV制剂能够诱导B/Bris特异性的IgA和IgG应答，其在用异源B/Bris病毒攻击期间得到增强。

3.讨论

如本文所示，处于初始/增强状态的QIV制剂是安全和免疫原性的，并且在接种的小鼠中产生针对四种相应同源病毒(H3N2、H1N1和两种B病毒株)的HI反应。此外，QIV对ma-Ca/04H1N1或B/Bris病毒的攻击产生了保护性反应。病毒特异性IgA和IgG应答早在5dpc时就针对同源(ma-Ca/04H1N1或B/Bris)病毒进行了检测，这表明QIV制剂先前刺激了这种应答。事实上，病毒特异性IgA和IgG应答在攻击后至少维持了3周。21dpc时也检测到针对异源(Ty04 H3N2和B/Wisc)病毒的病毒特异性IgA和IgG应答，表明这些应答是由QIV制剂刺激的。虽然存在，但B/Wisc抗体应答有限。B/Bris的攻击改善了B/Wis-IgA和IgG应答，但没有改善HI反应，可能是因为交叉反应水平相同。

G.参考文献

Alexandrova GI,Maassab HF,Kendal AP,Medvedeva TE,Egorov AY,Klimov AI,Cox NJ.1990.《美国和苏联开发的冷适应乙型流感活疫苗株的实验室特性及其B/安阿伯市/1/86冷适应重配候选疫苗》Vaccine 8:61-64.

Andrews SF,Huang Y,Kaur K,Popova LI,Ho IY,Pauli NT,Henry Dunand CJ,Taylor WM,Lim S,Huang M,Qu X,Lee JH,Salgado-Ferrer M,Krammer F,Palese P,Wrammert J,Ahmed R,Wilson PC.2015.《免疫史深刻影响对流感的广泛保护性B细胞反应》Sci Transl Med 7:316ra192.

Baker SF,Nogales A,Finch C,Tuffy KM,Domm W,Perez DR,Topham DJ,Martinez-Sobrido L.2014.《甲型和乙型流感病毒通过相容的病毒包装信号进行型间重组》J Virol 88:10778-10791.

Barr IG,Russell C,Besselaar TG,Cox NJ,Daniels RS,Donis R,EngelhardtOG,Grohmann G,Itamura S,Kelso A,McCauley J,Odagiri T,Schultz-Cherry S,Shu Y,Smith D,Tashiro M,Wang D,Webby R,Xu X,Ye Z,Zhang W,世界卫生组织北半球流感疫苗成分讨论写作委员会,2014.世卫组织对2013-2014年北半球流感疫苗中使用的病毒的建议：2012年10月至2013年1月收集的甲型流感病毒(HlNl)pdm09、甲型流感病毒(H3N2)和乙型流感病毒的流行病学、抗原性和遗传特征。Vaccine 32:4713-4725.

Briedis DJ,Lamb RA.1982.《乙型流感病毒基因组：RNA片段8和编码NS1和NS2蛋白的mRNA序列和结构组织》J 594Virol 42:186-193.

Camilloni B,Neri M,Lepri E,Basileo M,Sigismondi N,Puzelli S,DonatelliI,Iorio AM.2010.《2007/2008年冬季养老院适当免疫的老年人中爆发的乙型流感》Vaccine 28:7536-7541.

Chan W,Zhou H,Kemble G,Jin H.2008.《作为减毒活流感疫苗主要供体病毒的冷适应和温度敏感的A/安阿伯市/6/60流感病毒在限制性温度下复制存在多种缺陷》Virology 380:304-311.

Chen R,Holmes EC.2008.《人类乙型流感病毒的进化动力学》J Mol Evol 66:655-663.

Chen Z,Aspelund A,Kemble G,Jin H.2006.《作为减毒活流感疫苗(FluMist)主要供体病毒的B/安阿伯市/1/66的冷适应表型的遗传图谱》Virology 345:416-423.

Chen Z,Aspelund A,Kemble G,Jin H.2008.《作为减毒活流感疫苗(FluMist)主要供体病毒的冷适应B/安阿伯市/1/66的温度敏感复制的分子研究》Virology 380:354-362.

Cheng X,Zengel JR,Suguitan AL,Jr.,Xu Q,Wang W,Lin J,Jin H.2013.《减毒活流感疫苗和灭活疫苗诱导的体液和细胞免疫应答的评价及其在雪貂异源保护中的作用》J Infect Dis 208:594-602.

Daum LT,Canas LC,Klimov AI,Shaw MW,Gibbons RV,Shrestha SK,Myint KS,Acharya RP,Rimal N,Reese F,Niemeyer DM,Arulanandam BP,Chambers JP.2006.《2005年美国和尼泊尔乙型流感爆发分离株的分子分析》Arch Virol 151:1863-1874.

DeBorde DC,Donabedian AM,Herlocher ML,Naeve CW,Maassab HF.1988.《野生型和冷适应B/安阿伯市/1/66流感病毒基因的序列比较》Virology 163:429-443.

DeBorde DC,Naeve CW,Herlocher ML,Maassab HF.1987.《病毒核苷酸序列》Virus Res 8:33-41.

Della Cioppa G,Vesikari T,Sokal E,Lindert K,Nicolay U.2011.《幼儿三价和四价MF59((R))佐剂流感疫苗：剂量和时间表研究》Vaccine 29:8696-8704.

Finch C,Li W,Perez DR.2015.《替代性减毒活流感病毒疫苗的设计》Curr TopMicrobiol Immunol 386:205-235.

Gauger PC,Loving CL,Khurana S,Lorusso A,Perez DR,Kehrli ME,Jr.,RothJA,Golding H,Vincent AL.2014.《减毒活甲型流感疫苗在没有疫苗相关的增强呼吸道疾病的情况下抵抗A(HlNl)pdm09异源攻击》Virology 471-473:93-104.

Grohskopf LA,Sokolow LZ,Broder KR,Olsen SJ,Karron RA,Jernigan DB,Bresee JS.2016.《用疫苗预防和控制季节性流感》MMWR Recomm Rep 65:1-54.

Hai R,Martinez-Sobrido L,Fraser KA,Ayllon J,Garcia-Sastre A,PaleseP.2008.《乙型流感病毒NS1截短突变体：减毒活疫苗方法》J Virol 82:10580-10590.

Hoffmann E,Mahmood K,Chen Z,Yang CF,Spaete J,Greenberg HB,HerlocherML,Jin H,Kemble G.2005.《多个基因片段控制ca B/安阿伯市/1/66的温度敏感性和衰减表型》J Virol 79:11014-11021.

Hoffmann E,Neumann G,Kawaoka Y,Hobom G,Webster RG.2000.《由八个质粒产生甲型流感病毒的DNA转染系统》Proc Natl Acad Sci U S A 97:6108-6113.

Hoffmann E,Stech J,Guan Y,Webster RG,Perez DR.2001.《用于所有甲型流感病毒全长扩增的通用引物组》Arch Virol 146:2275-2289.

Horvath CM,Williams MA,Lamb RA.1990.《串联顺反子真核偶联翻译：乙型流感病毒BM2多肽的鉴定》EMBO J 9:2639-2647.

Hutchinson EC,Charles PD,Hester SS,Thomas B,Trudgian D,Martinez-Alonso M,Fodor E.2014.《流感病毒粒子结构的保守和宿主特异性特征》Nat Commun 5:4816.

Iijima N,Iwasaki A.2014.《T细胞记忆》《局部巨噬细胞趋化因子网络维持保护性组织驻留记忆CD4 T细胞》Science 346:93-98.

Jain VK,Rivera L,Zaman K,Espos RA,Jr.,Sirivichayakul C,Quiambao BP,Rivera-Medina DM,Kerdpanich P,Ceyhan M,Dinleyici EC,Cravioto A,Yunus M,Chanthavanich P,Limkittikul K,Kurugol Z,Alhan E,Caplanusi A,Durviaux S,BoutetP,Ofori-Anyinam O,Chandrasekaran V,Dbaibo G,Innis BL.2013.《预防儿童轻度和中度至重度流感的疫苗》N Engl J Med 369:2481-2491.

Jin H,Lu B,Zhou H,Ma C,Zhao J,Yang CF,Kemble G,Greenberg H.2003.《多种氨基酸残基赋予源于冷适应A/安阿伯市/6/60的人流感病毒疫苗株(FluMist)温度敏感性》Virology 306:18-24.

Jin H,Zhou H,Lu B,Kemble G.2004.《通过从冷适应A/安阿伯市/6/60中转移温度敏感性的遗传特征将雪貂的温度敏感性和衰减性赋予A/波多黎各/8/34流感病毒》JVirol 78:995-998.

Krammer F.2016.《新型通用流感病毒疫苗方法》Curr Opin Virol 17:95-103.

Laidlaw BJ,Decman V,Ali MA,Abt MC,Wolf AI,Monticelli LA,MozdzanowskaK,Angelosanto JM,Artis D,Erikson J,Wherry EJ.2013.《CD8+T细胞、非中和抗体和肺泡巨噬细胞之间的协同作用对异亚型流感病毒免疫很重要》PLoS Pathog 9:el003207.

Laidlaw BJ,Zhang N,Marshall HD,Staron MM,Guan T,Hu Y,Cauley LS,CraftJ,Kaech SM.2014.《CD4+T细胞有助于在流感病毒感染期间引导CD103+肺驻留记忆CD8+T细胞的形成》Immunity 41:633-645.

Lanthier PA,Huston GE,Moquin A,Eaton SM,Szaba FM,Kummer LW,Tighe MP,Kohlmeier JE,Blair PJ,Broderick M,Smiley ST,Haynes L.2011.《减毒活流感疫苗(LAIV)影响先天和适应性免疫应答》Vaccine 29:7849-7856.

Loving CL,Lager KM,Vincent AL,Brockmeier SL,Gauger PC,Anderson TK,Kitikoon P,Perez DR,Kehrli ME,Jr.2013.《减毒流感病毒灭活疫苗和活疫苗对猪抗类似于2011-2012年H3N2v的新型H3N2病毒感染和传播的效力》J Virol 87:9895-9903.

Loving CL,Vincent AL,Pena L,Perez DR.2012.《猪接种温度敏感的减毒活流感病毒后，与佐剂全灭活病毒相比，适应性免疫应答增强》Vaccine 30:5830-5838.

Lowen AC,Mubareka S,Steel J,Palese P.2007.《流感病毒的传播取决于相对湿度和温度》PLoS Pathog 3:1470-1476.

Maassab HF,Francis T,Jr.,Davenport FM,Hennessy AV,Minuse E,AndersonG.1969.《流感病毒减毒株的实验室和临床特征》Bull World Health Organ 41:589-594.

Maassab HF.1967.《流感病毒在25℃下的适应和生长特性》Nature 213:612-614.

McCullers JA,Saito T,Iverson AR.2004.《1979年至2003年间传播的乙型流感病毒的多种基因型》J Virol 78:12817-12828.

Mena I,Nelson MI,Quezada-Monroy F,Dutta J,Cortes-Fernandez R,Lara-Puente JH,Castro-Peralta F,Cunha LF,Trovao NS,Lozano-Dubernard B,Rambaut A,van Bakel H,Garcia-Sastre A.2016.《2009年墨西哥猪H1N1流感大流行的起源》Elife 5.

Monto AS,Miller FD,Maassab HF.1982.《减毒冷重组乙型流感病毒疫苗的评价》J Infect Dis 145:57-64.

Mosterin Hopping A,Fonville JM,Russell CA,James S,Smith DJ.2016.《乙型流感疫苗谱系选择-优化的三价疫苗》Vaccine 34:1617-1622.

Nakaya HI,Wrammert J,Lee EK,Racioppi L,Marie-Kunze S,Haining WN,MeansAR,Kasturi SP,Khan N,Li GM,McCausland M,Kanchan V,Kokko KE,Li S,Elbein R,Mehta AK,Aderem A,Subbarao K,Ahmed R,Pulendran B.2011.《人类季节性流感疫苗接种的系统生物学》Nat Immunol 12:786-795.

Paul Glezen W,Schmier JK,Kuehn CM,Ryan KJ,Oxford J.2013.《乙型流感的负担：结构化文献综述》Am J Public Health 103:e43-51.

Pena L,Vincent AL,Ye J,Ciacci-Zanella JR,Angel M,Lorusso A,Gauger PC,Janke BH,Loving CL,Perez DR.2011.《对猪型三重重组流感病毒聚合酶基因改性以产生针对2009年H1N1流感大流行的减毒活疫苗》J Virol 85:456-469.

Pica N,Langlois RA,Krammer F,Margine I,Palese P.2012.《NS1截短的减毒活疫苗为老龄小鼠提供强有力的病毒攻击保护》J Virol 86:10293-10301.

Reed LJ,Muench H.1938.《估计50％终点的简单方法》Am J Hyg 27:493-497.

Ritchey MB,Palese P,Kilbourne ED.1976.《甲型、乙型和丙型流感病毒的RNA》JVirol 18:738-744.

Rota PA,Wallis TR,Harmon MW,Rota JS,Kendal AP,Nerome K.1990.《1983年以来乙型流感病毒两种不同进化谱系的共传播》Virology 175:59-68.

Rudenko L,Yeolekar L,Kiseleva I,Isakova-Sivak I.2016.《基于Russian主供体病毒的减毒活流感疫苗的开发和批准：流程挑战和成功案例》Vaccine 34:5436-5441.

Russell CA,Jones TC,Barr IG,Cox NJ,Garten RJ,Gregory V,Gust ID,Hampson AW,Hay AJ,Hurt AC,de Jong JC,Kelso A,Klimov AI,Kageyama T,Komadina N,Lapedes AS,Lin YP,Mosterin A,Obuchi M,Odagiri T,Osterhaus AD,Rimmelzwaan GF,Shaw MW,Skepner E,Stohr K,Tashiro M,Fouchier RA,Smith DJ.2008.《流感疫苗株的选择及季节性流感病毒全球迁移的最新研究》Vaccine 26Suppl 4:D31-34.

Seo SU,Byun YH,Lee EY,Jung EJ,Jang YH,Kim HA,Ha SH,Lee KH,SeongBL.2008.《减毒活乙型流感病毒疫苗候选株的开发与鉴定》Vaccine 26:874-881.

Shaw MW,Choppin PW,Lamb RA.1983.《来自也编码病毒神经氨酸酶的双顺反子mRNA的之前未被识别的乙型流感病毒糖蛋白》Proc Natl Acad Sci U S A 80:4879-4883.

Shaw MW,Xu X,Li Y,Normand S,Ueki RT,Kunimoto GY,Hall H,Klimov A,CoxNJ,Subbarao K.2002.《2000-2001年和2001-2002年乙型流感/Victoria/2/87谱系病毒变异株的重现和全球传播》Virology 303:1-8.

Shin H,Iwasaki A.2013.《组织驻留记忆T细胞》Immunol Rev 255:165-181.

Snyder MH,Betts RF,DeBorde D,Tierney EL,Clements ML,Herrington D,Sears SD,Dolin R,Maassab HF,Murphy BR.1988.《四个病毒基因独立地有助于减毒活流感A/安阿伯市/6/60(H2N2)冷适应重组病毒疫苗》J Virol 62:488-495.

Solorzano A,Ye J,Perez DR.2010.《基于聚合酶基因改性的替代性减毒活流感疫苗预防流行性流感和大流行性流感》J Virol 84:4587-4596.

Song H,Nieto GR,Perez DR.2007.《使用两种策略组合作为潜在候选疫苗的新一代改性减毒活禽流感病毒》J Virol 81:9238-9248.

Stech J,Garn H,Herwig A,Stech O,Dauber B,Wolff T,Mettenleiter TC,Klenk HD.2011.《血凝素裂解位点改性的乙型流感病毒作为新型减毒活疫苗》J InfectDis 204:1483-1490.

Stech J,Garn H,Wegmann M,Wagner R,Klenk HD.2005.《流感活疫苗的新方法：血凝素裂解位点的改性》Nat Med 11:683-689.

Te Velthuis AJ,Fodor E.2016.《流感病毒RNA聚合酶：洞悉病毒RNA合成机制》Nat Rev Microbiol 14:479-493.

Teijaro JR,Turner D,Pham Q,Wherry EJ,Lefrancois L,Farber DL.2011.《前沿：组织保持型肺记忆CD4 T细胞介导对呼吸道病毒感染的最佳保护》J Immunol 187:5510-5514.

Thompson WW,Shay DK,Weintraub E,Brammer L,Bridges CB,Cox NJ,FukudaK.2004.《美国流感相关住院治疗》JAMA 292:1333-1340.

Victor ST,Watanabe S,Katsura H,Ozawa M,Kawaoka Y.2012.《不能复制的PB2敲除甲型流感病毒疫苗载体》J Virol 86:4123-4128.

Wakai C,Iwama M,Mizumoto K,Nagata K.2011.《与甲型流感病毒聚合酶的识别相比，乙型流感病毒RNA聚合酶对帽结构的识别较少依赖于甲基残基》J Virol 85:7504-7512.

Watanabe S,Watanabe T,Kawaoka Y.2009.《缺乏M2蛋白的甲型流感病毒作为减毒活疫苗》J Virol 83:5947-5950.

Win MK,Chow A,Chen M,Lau YF,Ooi EE,Leo YS.2010.《新加坡接种流感疫苗的福利院居民爆发乙型流感》Ann Acad Med Singapore 39:448-452.

Ye J,Sorrell EM,Cai Y,Shao H,Xu K,Pena L,Hickman D,Song H,Angel M,Medina RA,Manicassamy B,Garcia-Sastre A,Perez DR.《(2010)2009H1N1流感病毒血凝素的变化：毒力表型改变的病毒株的可能性？》PLoS Pathog.6(10).

Zhou B,Lin X,Wang W,Halpin RA,Bera J,Stockwell TB,Barr IG,WentworthDE.2014.《通用乙型流感病毒基因组扩增有助于测序、诊断和反向遗传学》J ClinMicrobiol 52:1330-1337.

Zhu W,Higgs BW,Morehouse C,Streicher K,Ambrose CS,Woo J,Kemble GW,Jallal B,Yao Y.2010.《幼儿减毒活流感疫苗和灭活疫苗诱导的早期免疫应答的全基因组转录分析》Vaccine 28:2865-2876.

H.序列

IAYPYDVPDY(SEQ ID NO:1)

YPYDVPDY(SEQ ID NO:2)