一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法
阅读说明：本技术 一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法 (Cationic lipid nucleic acid vaccine composition and preparation method thereof ) 是由 刘宗文 雍金贵 潘红 朱桃花 占应强 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法,属于生物技术领域,本发明制备了一种阳离子脂质体,该阳离子脂质体是将脂质基体和改性透明质酸通过正负电荷相吸,将改性透明质酸均匀的包覆在脂质基体表面,没有引入有机溶剂,避免了有机溶剂带来的毒性,同时,也提高了阳离子脂质体的包封率。先制得脂质基体,然后加入核酸类药物,对药物进行负载,最后通过改性透明质酸均匀的包覆在脂质基体表面,进行包覆,常见的聚合物基因载体普遍存在细胞毒性大、生物难降解的缺点,本发明中通过对单糖的聚合、修饰,既可以降低毒性,也可以提高载药量,减少了阳离子脂质体的用量,解决了毒性大的问题。(The invention relates to a cationic lipid nucleic acid vaccine composition and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biology, and the cationic liposome is prepared by the method that a lipid matrix and modified hyaluronic acid are attracted by positive and negative charges, the modified hyaluronic acid is uniformly coated on the surface of the lipid matrix, no organic solvent is introduced, the toxicity caused by the organic solvent is avoided, and the encapsulation efficiency of the cationic liposome is improved. The preparation method comprises the steps of preparing a lipid matrix, adding a nucleic acid drug, loading the drug, and finally uniformly coating the surface of the lipid matrix with modified hyaluronic acid for coating, wherein common polymer gene vectors generally have the defects of high cytotoxicity and difficult biodegradation.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
脂质体是由磷脂等类脂形成的双分子层的完全封闭的多层囊泡，可包封水溶性和脂溶性两种物质，具有靶向高效、缓释可控和安全无毒的特点。
按电荷性质，脂质体可分为阳离子脂质体、中性脂质体和阴离子脂质体。其中，阳离子脂质体具有可自然降解、无毒无免疫原性、可重复转染等优点。阳离子脂质体通常是用作基因载体，与DNA或RNA复合，保护其不被灭活或被核酸酶降解，携带基因可转运至特定部位，并且要保证转染过程方便易行，重现性好。
具有高表面电荷的阳离子脂质体通常会有一定的细胞毒性，因此需要控制阳离子脂质材料在脂质体中的用量。此外，阳离子脂质体进行基因转染的前提是与待转染的核酸形成阳离子脂质体/核酸复合物，常规的阳离子脂质体与核酸进行复合时，阳离子脂质体需要过量才能实现完全包裹，因此需要消耗大量的阳离子脂质体，导致细胞毒性较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种阳离子脂质核酸疫苗组合物，包括阳离子脂质体和核酸类药物，其中，阳离子脂质体和核酸类药物的质量比为15-20：1；
所述阳离子脂质体通过如下步骤制备：
将改性透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入脂质基体中，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，然后过0.22μm微孔滤膜，得到阳离子脂质体。
进一步地，改性透明质酸和去离子水的用量比为1mg：1mL，改性透明质酸和脂质基体的用量质量比0.5：1。
进一步地，脂质基体通过如下步骤制备：
步骤S11、葡萄糖内酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐和对苯二酚加入甲醇中，然后加入三乙胺，在温度为25℃条件下，搅拌反应5h，反应结束后，减压浓缩除去溶剂，然后用异丙醇洗涤，然后真空干燥至恒重，得到固体a；
步骤S12、将羰基二咪唑和甲苯混合，在温度为40℃条件下，加入油酸溶液，加完后，保持温度不变，继续搅拌反应3h，然后加入二乙烯三胺，加完后保持温度不变，继续反应3h，反应结束后，在60℃条件下旋蒸除去溶剂，然后用乙醇水溶液重结晶，得到中间体b；
步骤S13、将中间体b和去离子水加入反应釜中，用氢氧化钾调节pH值为8，然后加入碘甲烷，密封反应釜，在60℃条件下反应24h，反应结束后，自然冷却至室温，后处理除去多余碘甲烷，得到中间体c；
步骤S14、将固体a、中间体c和二甲基亚砜加入反应釜中，在氮气保护条件下，加入葡聚糖溴酸酯、2，2'-联吡啶、氯化铜和氯化亚铜，密封反应釜，在30℃条件下搅拌反应2h，反应结束后，加水透析48h，透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后冻干得到脂质基体。
进一步地，步骤S11中葡萄糖内酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、对苯二酚、甲醇和三乙胺的用量比为10g：16g：0.1g：100mL：14mL；
步骤S12中油酸溶液为油酸和甲苯按照1g：10mL混合而成，羰基二咪唑、甲苯、油酸溶液和二乙烯三胺的用量比为6.5g：60mL：100mL：2.1g；
步骤S13中中间体b、去离子水和碘甲烷的用量比为3.5g：30mL：2g；
步骤S14中固体a、中间体c和二甲基亚砜的用量比为1.5：2.1：50mL；中间体c、葡聚糖溴酸酯、2，2'-联吡啶、氯化铜和氯化亚铜的用量比为350g：0.01mol：0.25mol：0.2mol：0.01mol。
进一步地，改性透明质酸通过如下步骤制备：
将透明质酸和去离子水混合，在温度为35℃条件下搅拌，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9，然后加入辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的混合液，混合液在1.5h内滴加完，滴加结束后，保持温度不变，继续搅拌3h，然后用1mol/L的盐酸溶液调节pH值为6，反应结束后，依次用体积分数60％的乙醇水溶液和去离子水洗涤两遍，洗涤结束后，在50℃条件下干燥至恒重，得到改性透明质酸。
进一步地，透明质酸和去离子水的用量比为1g：10mL，辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的混合液中辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的用量比为1g：10mL；透明质酸与辛烯基琥珀酸酐的用量质量比为1.5：1。
一种阳离子脂质核酸疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：
第一步，在温度为30-40℃条件下，将脂质基体在溶剂中平衡30-60min，保持温度不变，加入核酸类药物，搅拌2h，然后加入改性透明质酸，继续搅拌2-5h得到混合物；
第二步、将得到的混合物依次过孔径1000nm、800nm及500nm的碳酸纤维膜筛选，得到一种阳离子脂质核酸疫苗组合物。
进一步地，阳离子脂质体和溶剂的用量质量比为1：3；溶剂为生理盐水。
本发明的有益效果：
本发明制备了一种阳离子脂质体，该阳离子脂质体是将脂质基体和改性透明质酸通过正负电荷相吸，将改性透明质酸均匀的包覆在脂质基体表面，没有引入有机溶剂，避免了有机溶剂带来的毒性，同时，也提高了阳离子脂质体的包封率。
本发明中葡萄糖内酯和甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐反应引入不饱和双键，制得固体a，中间体c为含有不饱和双键的季铵盐结构，然后固体a和中间体c发生聚合反应，制得脂质基体，然后加入核酸类药物，对药物进行负载，最后通过改性透明质酸均匀的包覆在脂质基体表面，进行包覆，改性透明质酸中引入了碳氢长链，可以提高聚合物的转染效率，常见的聚合物基因载体普遍存在细胞毒性大、生物难降解的缺点，通常阳离子脂质体与核酸进行复合时，阳离子脂质体需要过量才能实现完全包裹，本发明中通过对单糖的聚合、修饰，减少了阳离子脂质体的用量，可以降低毒性，也可以提高载药量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备改性透明质酸：
将透明质酸和去离子水混合，在温度为35℃条件下搅拌，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9，然后加入辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的混合液，混合液在1.5h内滴加完，滴加结束后，保持温度不变，继续搅拌3h，然后用1mol/L的盐酸溶液调节pH值为6，反应结束后，依次用体积分数60％的乙醇水溶液和去离子水洗涤两遍，洗涤结束后，在50℃条件下干燥至恒重，得到改性透明质酸。其中，透明质酸和去离子水的用量比为1g：10mL，辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的混合液中辛烯基琥珀酸酐和异丙醇的用量比为1g：10mL；透明质酸与辛烯基琥珀酸酐的用量质量比为1.5：1。
实施例2
制备脂质基体：
步骤S11、葡萄糖内酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐和对苯二酚加入甲醇中，然后加入三乙胺，在温度为25℃条件下，搅拌反应5h，反应结束后，减压浓缩除去溶剂，然后用异丙醇洗涤，然后真空干燥至恒重，得到固体a；其中，步骤S11中葡萄糖内酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、对苯二酚、甲醇和三乙胺的用量比为10g：16g：0.1g：100mL：14mL；
步骤S12、将羰基二咪唑和甲苯混合，在温度为40℃条件下，加入油酸溶液，加完后，保持温度不变，继续搅拌反应3h，然后加入二乙烯三胺，加完后保持温度不变，继续反应3h，反应结束后，在60℃条件下旋蒸除去溶剂，然后用乙醇水溶液重结晶，得到中间体b；其中，中油酸溶液为油酸和甲苯按照1g：10mL混合而成，羰基二咪唑、甲苯、油酸溶液和二乙烯三胺的用量比为6.5g：60mL：100mL：2.1g；
步骤S13、将中间体b和去离子水加入反应釜中，用氢氧化钾调节pH值为8，然后加入碘甲烷，密封反应釜，在60℃条件下反应24h，反应结束后，自然冷却至室温，后处理除去多余碘甲烷，得到中间体c；其中，中间体b、去离子水和碘甲烷的用量比为3.5g：30mL：2g；
步骤S14、将固体a、中间体c和二甲基亚砜加入反应釜中，在氮气保护条件下，加入葡聚糖溴酸酯、2，2'-联吡啶、氯化铜和氯化亚铜，密封反应釜，在30℃条件下搅拌反应2h，反应结束后，加水透析48h，透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后冻干得到脂质基体；其中，中固体a、中间体c和二甲基亚砜的用量比为1.5：2.1：50mL；中间体c、葡聚糖溴酸酯、2，2'-联吡啶、氯化铜和氯化亚铜的用量比为350g：0.01mol：0.25mol：0.2mol：0.01mol。
实施例3
制备阳离子脂质体：
将改性透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入脂质基体中，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，然后过0.22μm微孔滤膜，得到阳离子脂质体；其中，改性透明质酸和去离子水的用量比为1mg：1mL，改性透明质酸和脂质基体的用量质量比0.5：1；改性透明质酸为实施例1制得的；脂质基体为实施例2制得的。
实施例4
制备阳离子脂质核酸疫苗组合物，包括如下步骤：
第一步在温度为30℃条件下，将脂质基体在溶剂中平衡30min，保持温度不变，加入H9N2型流感病毒裂解疫苗原液，搅拌2h，将改性透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，得到混合物；
第二步、将得到的混合物依次过孔径1000nm、800nm及500nm的碳酸纤维膜筛选，得到一种阳离子脂质核酸疫苗组合物。
其中，阳离子脂质体和溶剂的用量质量比为1：3；溶剂为生理盐水。核酸类药物为H9N2型流感病毒裂解疫苗原液；阳离子脂质体和核酸类药物的质量比为15：1；制备阳离子脂质体为实施例3制得的。
实施例5
制备阳离子脂质核酸疫苗组合物，包括如下步骤：
第一步，在温度为40℃条件下，将脂质基体在溶剂中平衡50min，保持温度不变，加入H9N2型流感病毒裂解疫苗原液，搅拌2h，将改性透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，得到混合物；
第二步、将得到的混合物依次过孔径1000nm、800nm及500nm的碳酸纤维膜筛选，得到一种阳离子脂质核酸疫苗组合物。
其中，阳离子脂质体和溶剂的用量质量比为1：3；溶剂为生理盐水。核酸类药物为H9N2型流感病毒裂解疫苗原液；阳离子脂质体和核酸类药物的质量比为18：1；制备阳离子脂质体为实施例3制得的。
实施例6
制备阳离子脂质核酸疫苗组合物，包括如下步骤：
第一步，第一步，在温度为40℃条件下，将脂质基体在溶剂中平衡60min，保持温度不变，加入H9N2型流感病毒裂解疫苗原液，搅拌2h，将改性透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，得到混合物；
第二步、将得到的混合物依次过孔径1000nm、800nm及500nm的碳酸纤维膜筛选，得到一种阳离子脂质核酸疫苗组合物。
其中，阳离子脂质体和溶剂的用量质量比为1：3；溶剂为生理盐水。核酸类药物为H9N2型流感病毒裂解疫苗原液；阳离子脂质体和核酸类药物的质量比为20：1；制备阳离子脂质体为实施例3制得的。
对比例1
与实施例3相比，将改性透明质酸换成透明质酸，其余原料及制备过程保持不变。
对比例2
与实施例5相比，在温度为40℃条件下，将脂质基体在溶剂中平衡50min，保持温度不变，加入H9N2型流感病毒裂解疫苗原液，搅拌2h，将透明质酸和去离子水混合，在转速为300r/min条件下加入，加完后，在频率为40kHz条件下，超声分散6min，得到混合物；其余原料及制备过程，保持不变。
对实施例4-6和对比例1制得的样品进行测试，利用马尔文粒度分析仪检测脂质体的粒径和Zeta电位。
对实施例4-6和对比例2制备的疫苗组合物包封率的检测：基于离心装置以60000×g的离心力超速离心，将脂质体完全沉淀，用BCA法检测上清中游离抗原的蛋白含量，从而计算脂质体包封率的检测方法。包封率的计算公式为:包封率＝[1-(上清中抗原含量×溶液体积)/(抗原给药含量×给药体积)]×100％；
结果如下表1所示：
表1
粒径nm
Zeta电位
包封率％
实施例4
422.58±5.31
56.31±2.62
59.29±4.34
实施例5
422.37±5.31
56.31±3.02
59.34±5.64
实施例6
422.31±5.31
56.31±2.82
59.21±3.18
对比例1
387.44±5.31
43.31±5.72
-
对比例2
-
-
48.55±5.17
从表1中看出包封率均在50％以上，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
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