H3n2和h3n8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 H3n2和h3n8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用 (H3N2 and H3N8 subtype canine influenza bivalent inactivated vaccine as well as preparation method and application thereof ) 是由 孙怡朋 刘金华 陈明月 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用。本发明提供了一种犬流感病毒疫苗,包括疫苗抗原,所述疫苗抗原为如下1)或2)：1)由A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180和H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；2)由A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180拯救获得的重组H3N2流感病毒和由H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原。本发明H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活疫苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活疫苗对于不同分支的H3N2亚型犬流感病毒和H3N8亚型犬流感病毒均具有良好的保护作用。(The invention discloses a H3N2 and H3N8 subtype canine influenza bivalent inactivated vaccine as well as a preparation method and application thereof. The invention provides a canine influenza virus vaccine, which comprises a vaccine antigen, wherein the vaccine antigen is 1) or 2) as follows: 1) a whole virus bivalent inactivated vaccine antigen consisting of A/canane/Quanzhou/1224-1109/2018 (H3N2) CGMCC NO.18180 and H3N8 subtype canine influenza virus strains; 2) recombinant H3N2 influenza virus rescued by A/canane/Quanzhou/1224-1109/2018 (H3N2) CGMCC NO.18180 and recombinant H3N8 subtype canine influenza virus strain rescued by H3N8 subtype canine influenza virus strain. The H3N2 and H3N8 subtype canine influenza whole virus bivalent inactivated vaccine and the recombinant virus (H3N2/PR8+ H3N8/PR8) bivalent inactivated vaccine have good protective effects on different branched H3N2 subtype canine influenza viruses and H3N8 subtype canine influenza viruses.)
技术领域
本发明属于疫苗生产领域，涉及H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活苗的制备，尤其涉及H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用。
背景技术
目前接种疫苗是我国防控动物疫病的主要手段。其中灭活疫苗的使用可以追溯到1945年，1945年，全病毒灭活疫苗在美国开始使用并进行了临床效力观察。因其保留了流感病毒全部抗原成分，在免疫原性和安全性方面较好，不会出现变异和毒力回复现象，且制备工艺简单，成品易于储存，被广泛应用于禽类流感大流行的预防。目前应用最广的是利用鸡胚增殖病毒并通过化学处理生产灭活的流感疫苗。而重组病毒技术是利用反向遗传操作技术，将疫苗毒株的HA和NA基因与PR8病毒内部基因进行人工重组，拯救获得H3N2/PR8和H3N8/PR8，可有效突破疫苗毒株在鸡胚和MDCK上增殖能力差的限制。
自2006年首次在中国华南地区分离到4株H3N2亚型犬流感病毒感染病例以来，该病毒在我国犬群中广泛流行，2009年2-12月份，广州地区临床疑似病例中犬流感病毒病原学调查的阳性率为2.8％，血清学调查阳性率为6.9％。2009—2010年，在浙江、江苏、北京、辽宁等地也相继分离到禽源H3N2亚型犬流感病毒，该病毒与中国华南及韩国H3N2亚型犬流感病毒高度同源。2010-2018年吉林、黑龙江、河北、河南、广西、贵州等地也报道了犬群中犬流感病毒血清学阳性的结果，其中贵州地区在2018年首次报道其农村犬群和城市犬群中均检测到H3N2犬流感病毒血清学阳性结果。以上结果表明，犬流感病毒的传播范围仍在不断扩大，由沿海到内陆，目前可能已广泛存在于我国大部分地区。
犬作为人类重要的伴侣动物，犬中的流感病毒可能通过人-犬的亲密接触而增加感染人的机会；并且由于动物源流感病毒与人流感病毒的抗原性不同，一旦犬流感病毒能有效感染人，而人体又缺乏相应抗体很可能会发生病毒迅速流行。因此，犬流感病毒对公共卫生构成了潜在威胁。2017年就有报道称在采集的78份人血清(有犬流感阳性犬接触史的人)中，1份为H3N2犬流感病毒阳性，该结果充分验证了犬流感病毒对公共卫生的潜在威胁。
2016-2018年在对犬流感病毒的流行病学监测中发现2016-2018年新分离毒株8基因片段都位于与韩国、美国近期(2013年-2015年)流行毒株亲缘关系最近的新分支。该分支完全取代2015年之前流行于中国的犬流感病毒，且在抗原性方面新分支毒株与15年之前流行于我国的分离株相比有较大差异，形成新抗原群C群。提示目前流行于我国的犬流感病毒主要为新分支毒株且抗原性与我国早期毒株相比也已发生明显变化。
因此，为有效控制犬流感病毒在犬群中的传播速度，应采用接种疫苗的手段来有效防控。而中国到目前为止，仍未有相关疫苗上市。
发明内容
为了通过寻找交叉免疫反应好的新分支H3N2犬流感病毒作为疫苗候选毒株，与H3N8犬流感病毒制成全病毒二价灭活苗或重组病毒二价灭活苗，以期有效防控犬流感病毒对犬群的感染，进而消除犬流感病毒对公共卫生安全的潜在威胁。本发明提供如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种犬流感病毒疫苗。
本发明提供的犬流感病毒疫苗，包括疫苗抗原，所述疫苗抗原为如下1)或2)或3)或4)：
1)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCCNO.18180和H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；
2)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCCNO.18180拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原；
3)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；
4)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原。
上述疫苗中，所述H3N8亚型犬流感病毒株为A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)。
上述疫苗中，所述1)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗；
所述3)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)CGMCC NO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗。
上述疫苗中，
所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180的病毒滴度不低于108EID50/ml；
所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589的病毒滴度不低于108EID50/ml；
所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度不低于108EID50/ml；
所述混合的体积比均为1:1。
若病毒含量低于108EID50/ml时可使用超滤浓缩机进行浓缩。
在本发明的实施例中，所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180的病毒滴度均为108.5EID50/ml；所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度为108EID50/ml；所述混合的体积比均为1:1。
上述疫苗中，所述2)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2018流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗；
所述4)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2017流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗。
上述疫苗中，所述重组H3N2-2018流感病毒为将所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换PR8流感病毒(在本发明的实施例中，该病毒为A/Puerto Rico/8/34(H1N1)高产病毒)的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；
所述重组H3N2-2017流感病毒为将所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换所述PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；
所述重组H3N8流感病毒为将所述H3N8亚型犬流感病毒株的HA蛋白和NA蛋白编码基因分别替换所述PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒。
上述疫苗中，
所述重组H3N2-2018流感病毒或所述重组H3N2-2017流感病毒的病毒滴度均不低于108EID50/ml；
所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度不低于108EID50/ml；所述混合的体积比为1:1。
若病毒含量低于108EID50/ml时可使用超滤浓缩机进行浓缩。
在本发明的实施例中，所述重组H3N2-2018流感病毒或所述重组H3N2-2017流感病毒的病毒滴度的病毒滴度为109.5EID50/ml；所述重组H3N8流感病毒的病毒滴度为108EID50/ml；混合的体积比均为1:1。
上述疫苗中，所述疫苗还包括佐剂。
本发明另一个目的是提供一种制备犬流感病毒疫苗的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
A、按照上述的疫苗中的方法制备全病毒二价灭活苗抗原或重组病毒二价灭活苗抗原；
B、将所述全病毒二价灭活苗抗原或重组病毒二价灭活苗抗原加入佐剂，制备得到犬流感病毒疫苗。
上述疫苗在制备具有如下1)或2)功能产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)预防犬流感病毒；
2)提高犬流感病毒感染机体后机体的抗体含量。
H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，其保藏号为CGMCC NO.17589也是本发明保护的范围；
或H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，其保藏号为CGMCC NO.18180也是本发明保护的范围；
或所H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147或所述H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147在制备权利要求1-8所述的疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
犬流感病毒为H3N2犬流感病毒或H3N8犬流感病毒，在本发明的实施例中举例为犬流感老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009,H3N2)、新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017，H3N2)、147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2)及H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)、(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)。
灭活疫苗能够应用的前提是必需保证病毒的产量及稳定性。同时灭活疫苗对不同分支犬流感病毒的有效免疫保护效力也是疫苗评价的重要组成部分。为此，通过在鸡胚中连续传代来评价病毒的稳定性，并通过免疫犬攻毒保护试验来评价其免疫效力。研究发现，病毒在鸡胚中连续传至15代时仍能保持稳定的血凝效价，表明该病毒稳定性好。疫苗对犬的免疫攻毒保护试验结果证实，疫苗免疫后能够迅速(一次免疫后2周)产生针对不同分支H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒感染的抵抗力如抑制免疫动物排毒及降低病毒在免疫动物组织中的复制能力。结果表明，所研制的犬流感病毒灭活苗具有稳定和免疫效果好的特点，为犬流感病毒的防控奠定了基础。
本发明将交叉免疫反应好的H3N2毒株和H3N8毒株通过鸡胚传代的方法将病毒在鸡胚中连续传代培养，当效价达到27左右时，继续传代至15代，选择所有代次血凝效价均比较稳定的毒株作为候选毒株，再进行如下方法：方法一：是将两种病毒的全病毒进行灭活再等比例混合并辅以佐剂制成全病毒二价灭活苗；方法二：利用反向遗传技术将疫苗毒株的HA和NA基因与PR8病毒内部基因进行人工重组，拯救获得H3N2/PR8和H3N8/PR8，然后再将两种病毒在鸡胚中培养，收获病毒后将两种病毒进行灭活并等比例混合辅以佐剂制成重组病毒二价灭活苗。疫苗免疫攻毒保护试验结果证实，这两种疫苗均能够有效保护H3N2和H3N8犬流感病毒对比格犬的感染。
本发明所用的疫苗候选株可在鸡胚中稳定繁殖；H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活疫苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活疫苗的保护性研究表明这两种疫苗对于不同分支的H3N2亚型犬流感病毒和H3N8亚型犬流感病毒均具有良好的保护作用，可有效抵抗新分支毒株H3N2对犬群的感染，降低犬流感病毒对公共卫生安全的威胁。
A/canine/Beijing/0528-147/2017 147病毒株于2019年4月29日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.17589，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。
A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018 1109病毒株于2019年08月07日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.18180，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)记载在如下文献中：Wang C,Wang Q,Hu J,etal.A Multiplex RT-PCR Assay for Detection and Differentiation of Avian-OriginCanine H3N2,Equine-Origin H3N8,Human-Origin H3N2,and H1N1/2009CanineInfluenza Viruses[J].Plos One,2017,12(1):e0170374.。
实施例1、H3N2亚型犬流感病毒候选疫苗株的发现
1、新分支H3N2亚型犬流感病毒株的发现
新分支H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147分子鉴定结果：序列已上传GenBank，序列号：PB2(MK212678，2017/05/28)、PB1(MK212679，2017/05/28)、PA(MK212680，2017/05/28)、HA(MK212685，2017/05/28)、NP(MK212682，2017/05/28)、NA(MK212683，2017/05/28)、M(MK212684，2017/05/28)、NS(MK212681，2017/05/28)。
将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147病毒株于2019年4月29日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.17589，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。
新分支H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018分子鉴定结果如下：HA基因核苷酸序列为序列13，NA基因核苷酸序列为序列14，M基因核苷酸序列为序列15，NP基因核苷酸序列为序列16，NS基因核苷酸序列为序列17，PB1基因核苷酸序列为序列18，PB2基因核苷酸序列为序列19，PA基因核苷酸序列为序列20。
A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018 1109病毒株于2019年08月07日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.18180，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。
2、犬流感病毒候选疫苗株的筛选
为研究新分支H3N2亚型犬流感病毒H3N2 CIV的抗原性是否发生改变，根据分离年份及在进化树上的距离，选择了4株新分支H3N2亚型CIV(A/canine/Beijing/1228-9/2016(1228-9/16)、A/canine/Beijing/0512-137/2017(0512-137/17)、A/canine/Beijing/0527-147/2017(0527-147/17)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(1224-1109/18))，与5株2009-2015年分离的H3N2亚型CIV的代表毒株(A/canine/Beijing/814/2009(814/09)、A/canine/Beijing/362/2009(362/09)、A/canine/Beijing/0110-2/2014(0110-2/14)、A/canine/Beijing/0118-256/2015(0118-256/15)和A/canine/Beijing/0120-265/2015(0120-265/15))分别用SPF鸡制备抗血清，并将制备的血清与22株北京地区2009-2018年分离到的H3N2CIV，进行交叉血抑(HI)实验，从而研究不同年份病毒与血清的反应特性。同时，利用抗原性演化图谱、系统进化树和抗原表位氨基酸位点比对等方法对H3N2 CIV的抗原性进行分析发现新分支毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147已形成了新的抗原群C群。
此外，值得关注的是18年A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018 1109病毒株又出现了新的抗原性变化，与新抗原群C群存在显著的抗原性差异，结果如表1所示。
表1
注：上述红色带下划线数字表示毒株与自身血清反应所得血抑效价；
蓝色毒株(1224-1109/18，表中最后一行)为抗原性发生变化的毒株。
根据抗原性分析结果挑选A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒作为H3N2亚型犬流感病毒候选疫苗株，A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)作为H3N8亚型犬流感病毒候选疫苗株。
3、犬流感病毒候选疫苗株血凝(HA)效价检测
待测鸡胚尿囊液：将所需病毒的病毒液分别做10-1～10-3稀释，经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2m L/胚，37℃孵育，无菌收集48h～96h鸡胚尿囊液备用。
红细胞凝集实验按常规微量法(OIE Standards Commission,1996)进行，具体步骤如下：用100μL量程的微量移液器向血凝板中加入生理盐水25μL/孔，于第1孔中加入25μL待测鸡胚尿囊液，吹打混匀后吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μL。第12孔作为阴性对照。再吸取25μL 1％红细胞悬液依次加入各孔。置于微量振荡器上振荡1min，室温静置20-30min后观察结果。
待测鸡胚尿囊液分别为A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)鸡胚尿囊液、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液。
结果判定：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。结果以++++、+++、++、+和-表示，判定以++++为终点。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原的红细胞凝集效价(HA效价)。
结果如下：
A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的HA效价为4log2；
A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的HA效价为4log2；
A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的HA效价为5log2。
实施例2、H3N2和H3N8犬流感病毒二价灭活苗的制备
(一)H3N2和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗的制备
1、疫苗病毒株的筛选
根据上述实施例1检测的效价，用于制备全病毒疫苗的候选毒株的HA效价太低，因此进行如下传代：
分别将疫苗候选病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液分别做10-1～10-3稀释，经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2m L/胚，37℃孵育。无菌收集48h～96h鸡胚尿囊液，用1％鸡红细胞血凝试验(HA)分别测定其血凝效价(HA)，将各株HA效价较高的各鸡胚尿囊液收取混合后用无菌生理盐水稀释10-1～10-3后继续接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。反复传代，直至收获的病毒尿囊液HA效价稳定。经SPF鸡胚扩大培养，收集72h～96h鸡胚尿囊液，混合后测定其HA效价，A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的鸡胚尿囊液的HA效价均为7log2；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液的HA效价为7log2，作为疫苗种毒。
2、病毒EID50测定
1)鸡胚的准备：将9-11日龄鸡胚置于暗室，用照蛋器观察，标记出每个鸡胚的气室，避开大血管标记；
2)病毒的倍比稀释：将上述1得到作为疫苗种毒的HA效价为7log2的A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、HA效价为7log2的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)以及HA效价为7log2的A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)从-80℃冰箱中取出，置于冰上自然融化。准备10个1.5mL的EP管，每管中加入900μL的双抗PBS。第一管中加入100μL病毒原液，充分混匀后吸出100μL至第二管，依次稀释到第十管，做好标记。置于冰上保存。
3)接种病毒：将标记好的鸡胚用75％的酒精消毒，将打孔器消毒后在气室上方和配体处打孔。将1mL注射器沿着胚体处小孔***0.5cm，注入0.1mL上述2)稀释后的病毒液，每个稀释度的病毒液接种三个鸡胚，做好标记。石蜡封口。置于孵化箱孵育，每日照胚。
4)收获鸡胚：接毒后48-72h，将鸡胚置于4℃冰箱1h，防止鸡胚出血。用75％酒精消毒气室后，用镊子打开，吸取25μL的尿囊液至96孔血凝板，进行血凝试验，并记录结果。
按Reed-Muench法公式，计算半数感染量，10倍系列稀释的修正系数为1。
logEID50＝高于50％感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数
A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的定量结果为108.5EID50/ml(ml是指含有病毒的尿囊液)；
A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的定量结果为108.5EID50/ml(ml是指含有病毒的尿囊液)；
A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的定量结果为108EID50/ml。
3、灭活疫苗的制备
将1得到的作为疫苗种毒的HA效价为7log2的A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)病毒(108.5EID50/ml)鸡胚尿囊液或HA效价为7log2的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒(108.5EID50/ml)鸡胚尿囊液分别和HA效价为7log2的A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)(108EID50/ml)鸡胚尿囊液按照体积比1:1混匀，按常规方法用10％甲醛灭活，并使甲醛溶液的最终浓度达到0.1％，37℃灭活24h后，4℃保存备用，得到H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原。
灭活液检验包括无菌检验和灭活检验：
无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，观察有无细菌生长；结果无细菌生长；
灭活检验：取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔接种灭活病毒液(灭活苗抗原)，每枚0.2ml，置37℃继续孵育，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚，对所有胚液分别测定血凝效价，均不应出现血凝现象，视为灭活完全；结果所有胚液均无血凝现象。
上述H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原可作为疫苗抗原。
将上述2种疫苗抗原参考“兽用生物制品规程”方法制备油乳佐剂疫苗，得到H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗。
上述油乳佐剂疫苗为将矿物油佐剂与上述疫苗抗原按3∶2(体积比)的比例混合常规方法乳化。
(二)H3N2和H3N8犬流感病毒重组病毒二价灭活苗的制备
1、病毒RNA的提取和cDNA合成
1.1使用购自Magen公司的组织细胞RNA快速提取试剂盒(RaPure Total RNA Kit)对(一)中作为疫苗种毒的A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)鸡胚尿囊液、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液进行RNA的提取，操作方法如下：
(1)在1.5ml无RNA酶EP管中加入200μl病毒液(鸡胚尿囊液)，加入350μl RTLLysis Buffer，吹打混匀，再加入等体积的RNA Binding Buffer(已加无水乙醇)，移液枪吹打混匀；
(2)把HiPure RNA Mini Column吸附柱装在2ml收集管中，将混合液体转移至HiPure RNA Mini Column吸附柱中，每次转移小于700μl，12,000×g离心30-60秒；
(3)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，把剩余混合液体转移至HiPure RNA MiniColumn吸附柱中，12,000×g离心30-60秒；
(4)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，加入500μl Buffer RW1至吸附柱中。12,000×g离心30-60秒；
(5)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，加入500μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中，12,000×g离心30-60秒；
(6)重复步骤(5)一次；
(7)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，12,000×g离心2分钟；
(8)将吸附柱转移至1.5ml无RNA酶离心管中，加入50μl RNase Free Water至吸附柱膜中央，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟；
(9)弃去吸附柱，离心管中液体即为流感病毒的总RNA。
得到A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)以及A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的总RNA。
1.2cDNA合成
流感病毒RNA反转录所使用的通用引物Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。
流感病毒反转录(RT)反应体系：
取11ul上述提取的流感病毒RNA加入到1.5ml的无RNA酶EP管中，依次再加入表中各成分，轻柔混匀，瞬离。反应条件：37℃1h。反转录产物即为cDNA。
2、病毒HA和NA基因的扩增
以上述各个病毒株的cDNA为模板，用下述HAd BsmBI-HA-1F/HA-875R和HA-759F/BsmBI-HA-1778R进行PCR扩增，得到各个病毒株的HA-1片段和HA-2片段；
再以HA-1片段和HA-2片段为模板，用HAd BsmBI-HA-1F和BsmBI-HA-1778R进行PCR扩增，得到HA融合片段；
以上述各个病毒株的cDNA为模板，用下述BsmBI-NA-1F/BsmBI-NA-1466R进行PCR扩增，得到各个病毒株的NA片段；
具体方法如下：
2.1用于反向遗传操作质粒构建的引物
HA
NA
BsmBI-NA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT
BsmBI-NA-1466R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT
2.2PCR扩增出HA和NA基因片段，反应体系如下：
将依次加入上述成分，混匀并瞬离。
PCR扩增反应程序如下：
2.3将上述PCR产物1％凝胶电泳后，使用OMEGA公司生产琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的进行切胶回收，回收产物作为融合PCR的模板。
切胶回收方法如下：
(1)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电压180V，电流180V，时间30min；
(2)电泳完成，在紫外灯下切下目的条带放入1.5mlEP管中；
(3)按凝胶重量：Bind buffer体积＝1：1的比例加入相应体积的Bind buffer，56℃溶解；
(4)将溶解后获的凝胶混合物转移至离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液，每次转移体积少于700μl，直至混合液全部滤过柱子；
(5)取300μl Bind buffer加入离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液；
(6)取700μl Wash buffer加入离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)12,000×g空离2分钟，离心后弃掉滤液；
(9)将离心柱转移至1.5ml离心管中，在离心柱的膜中央加入30μl洗脱液，室温静止1分钟，12,000×g离心2分钟；
(10)弃掉离心柱，1.5ml离心管中的液体即为胶回收DNA产物，得到HA-1片段、HA-2片段和NA基因片段。
2.4将上步回收的HA-1片段、HA-2片段两份PCR产物混合使其互为模板，用引物BsmBI-HA-1F和BsmBI-HA-1778R配对，进行融合PCR扩增。
融合PCR扩增反应体系如下：
融合PCR产物，按上述切胶回收方法进行回收，得到HA基因片段；
3、基因片段和载体的酶切
将HA基因片段、NA基因片段和PHW2000载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)用BsmBI酶切。酶切体系如下：
BsmBI酶切时间：1h。反应条件：55℃。
酶切产物的回收纯化
酶切后取5μl进行1％凝胶电泳，以确保片段酶切完全。用全氏金公司生产的DNA产物纯化试剂盒回收纯化酶切产物，方法如下：
(1)将酶切产物加入到1.5mlEP管中，加入5倍体积的溶液BB(Binding buffer),混匀后加入离心柱中(为提高纯化产量可以选择静置1分钟)，10000×g离心1分钟，弃去流出液；
(2)加入650μl溶液WB(wash buffer),10000×g离心1分钟，弃去流出液；
(3)10000×g空离2分钟，弃去流出液；
(4)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30μl-50μlEB(Elutionbuffer)(为提高产量可选择60-70℃预热EB)，室温静置1分钟，10000×g离心1分钟。
(5)弃去离心柱，在1.5mlEP管底部的液体即为洗脱出来的DNA。
得到酶切后HA、酶切后NA和酶切后PHW2000载体。
5、重组质粒的构建
重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的HA基因(序列1，编码的蛋白为序列2所示的HA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的NA基因(序列3，编码的蛋白为序列4所示的NA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的HA基因(序列5，编码的蛋白为序列6所示的HA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的NA基因(序列7，编码的蛋白为序列8所示的NA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
重组质粒PHW2000-HA(H3N8)为将A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的HA基因(序列9，编码的蛋白为序列10所示的HA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
重组质粒PHW2000-NA(H3N8)为将A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的NA基因(序列11，编码的蛋白为序列12所示的NA蛋白)***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。
具体方法如下：
使用NEB公司生产的T4 DNA连接酶将酶切后的目的基因和载体进行连接，通常按目的基因：载体＝1：3-1：8的比例进行连接，体系如下：
6、连接产物的转化
采用热激转化法，将上述5得到的重组质粒转入感受态大肠杆菌TransT1中，方法如下：
(1)解冻：从-80℃冰箱取出感受态TransT1细胞，置冰上使其融化；
(2)冰浴：在冰浴环境中，将10μl连接产物加入50μl TransT1细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；
(3)热激：42℃热激45s，然后再冰浴2min，注意在这个过程中不要摇动离心管；
(4)扩繁：加入37℃预热的LB培养基500μL，37℃，200rpm小摇1h(通常大肠杆菌20min繁殖一代)；
(5)集菌：将扩繁1h的大肠杆菌3500×g离心4分钟，吸弃部分上清，只留80-100μl上清将沉于管底的大肠杆菌重悬；
(6)涂板：将菌液吹打混匀，涂于预热的氨苄青霉素抗性的LB营养琼脂平板(LBA)平板上，37℃倒置平板过夜培养(14～18h)。
7、阳性重组质粒的筛选鉴定
大肠杆菌本身不具有氨苄青霉素抗性，在LBA平板上不生长，pHW2000载体质粒具有氨苄抗性，大肠杆菌内转入该质粒或者转入携带目的基因的重组质粒后也具有了氨苄抗性，可以在LBA平板上生长繁殖。因此，LBA平板上生长的菌落只有三种，即转入了pHW2000质粒的菌、转入了载体自连产物的菌和转入了携带目的基因的重组质粒的菌。因此，挑取LBA平板上的单克隆菌落进行PCR鉴定，得到1778bp或1446bp的为阳性克隆。具体方法如下：
(1)在高压灭菌的洁净1.5mlEP管中，加入500-600ml的LBA液体培养基；
(2)取转化后的平板，用无菌镊夹持小白枪头挑取单个菌落，连同白枪头一同放入EP管中；
(3)将挑取的单克隆菌落在37℃，200rpm摇床培养4-6h；
(4)4-6h后进行菌液PCR扩增，1％凝胶电泳鉴定；
(5)样本阳性菌液送北京博尚生物技术有限公司测序，以确保阳性克隆序列的正确性。
用于菌液鉴定的引物
HA
BsmBI-HA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG
BsmBI-HA-1778R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
NA
BsaI-NA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT
BsaI-NA-1466R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT
菌液PCR体系：
阳性克隆分别为含有重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-HA(H3N8)的重组菌和含有重组质粒PHW2000-NA(H3N8)的重组菌。
8、目的质粒的提取
使用Promega公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒，步骤参照产品说明书。质粒用Nanodrop2000进行核酸浓度的定量，将质粒分装保存于-80℃，供后续实验使用。得到重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-HA(H3N8)和重组质粒PHW2000-NA(H3N8)。
9、病毒的拯救与鉴定
重组H3N2-2017亚型犬流感病毒为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589病毒株的HA蛋白编码基因(序列1)和NA蛋白编码基因(序列3)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒；
重组H3N2-2018亚型犬流感病毒为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)专利保藏编号待定病毒株的HA蛋白编码基因(序列5)和NA蛋白编码基因(序列7)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒；
重组H3N8亚型犬流感病毒为将H3N8亚型犬流感病毒株的HA蛋白编码基因(序列9)和NA蛋白编码基因(序列11)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒。
具体如下：
9.1 6孔细胞板的准备
转染用的6孔板通常用293-T细胞(普如汀生物技术(北京)有限公司)进行铺板，有些实验室也用MDCK细胞和293-T的混合细胞。
细胞传代：在已长满单层293T细胞的75ml培养瓶中加入2ml胰酶，轻轻摇晃，使胰酶充分浸润覆盖细胞，弃去胰酶，于37℃5％CO 2培养箱中静置消化1-2分钟，待细胞呈沙粒状完全下滑时，加入60ml含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM(相当于1传3传代)，吹打混匀。
293-T细胞铺板：将吹打混匀的293-T细胞铺6孔细胞板，2ml/孔。
混合细胞铺板：MDCK细胞(普如汀生物技术(北京)有限公司)与293-T细胞混合比例为1：2(细胞培养液体积比)，具体如下：一只75ml培养瓶已长满单层293-T细胞，胰酶消化后加入15ml培养基，一只75ml培养瓶已长满单层MDCK细胞，胰酶消化后加入15ml培养基，在6孔板中每孔加1ml 293T细胞和0.5ml MDCK细胞，摇晃均匀。
9.2质粒转染
6孔板细胞密度达到80％时，使用jetPRIME转染试剂(生产商：PolyplusTransfection出售公司：上海康稳生物科技有限公司，产品目录号：14Y0307J7)进行质粒转染。具体方法如下：
(1)标记好无菌1.5mlEP管；
(2)每个EP管加入200uL jetPRIME beffer；
(3)加入待拯救流感病毒的8个pHW2000质粒：(H3+N2+PR8(H1N1)内部片段或H3+N8+PR8(H1N1)内部片段)，每个质粒加500ng，涡旋震荡10s，瞬时离心；
上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。
或上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。
或上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N8)和重组质粒PHW2000-NA(H3N8)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/PuertoRico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。
上述重组质粒、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。分别为将A/PuertoRico/8/34(H1N1)高产病毒(Ping J,Lopes T J S,Neumann G,et al.Development ofhigh-yield influenza B virus vaccine viruses[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2016,113(51):201616530.)PR8流感病毒的M基因(GenBank号：V01099,1934)、NS基因(GenBank号：J02150,1934)、NP基因(GenBank号：J02147,1934)、PB1基因(GenBank号：J02151,1934)、PB2基因(GenBank号：V00603,1934)和PA基因(GenBank号：V01106,1934)分别***PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体PHW2000-M(A/PuertoRico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。
(4)加入8uL转染试剂JetPRIME(通常转染试剂的量须根据转染质粒的量决定，约为质粒质量的2倍)，涡旋震荡10s，瞬时离心；
(5)将无菌EP管置于室温，静置10分钟；
(6)取出前一天已经铺好的6孔细胞板，将上述混合液直接加入到6孔板中，(该转染试剂不受血清和抗生素的影响)，加完后按上下左右方向轻轻的水平摇晃6孔板，使其在培养基中均匀分布，置于37℃5％CO 2培养箱中静置培养；
(7)培养6h后，每孔加入含有双抗和TPCK胰酶的DMEM培养基1mL，胰酶终浓度为2ug/mL,双抗的终浓度为1％；
(8)收获病毒：6孔板置于37℃5％CO 2培养箱中静置培养24-72h后，大约50％细胞发生病变脱落时即可收获病毒，若当下无鸡胚则将6孔板置于-80℃冰箱冻存。将转染后的细胞液吹打混匀，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔(每个孔接种1枚鸡胚)，35℃孵育72h，收获尿囊液，测定其血凝活性。若无血凝活性，则盲传一代，放弃仍无血凝性的样本。
得到重组H3N2-2017亚型犬流感病毒、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒和重组H3N8亚型犬流感病毒。
9.3重组H3N2亚型犬流感病毒和重组H3N8亚型犬流感病毒的滴度及效价检测
病毒滴度测定方法见“实施例2、H3N2和H3N8犬流感病毒二价灭活苗的制备”的病毒EID50测定方法，病毒效价检测方法：红细胞凝集实验；
结果：重组H3N2-2017亚型犬流感病毒、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒的效价HA均为：10log2,病毒滴度均为：109.5EID50/ml。
重组H3N8效价HA：7log2,病毒滴度：108EID50/ml。
10、重组病毒灭活疫苗的制备
将上述9制备的重组H3N2-2017亚型犬流感病毒(109.5EID50/ml；HA：10log2)、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒(109.5EID50/ml；HA：10log2)分别和重组H3N8亚型犬流感病毒(108EID50/ml；HA：7log2)鸡胚尿囊液按常规方法用0.1％甲醛灭活，检测，作为疫苗抗原。
疫苗的制备参考“兽用生物制品规程”方法，油乳佐剂疫苗为将矿物油佐剂与抗原按3∶2的比例混合常规方法乳化，得到H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗、H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗。
实施例2、H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活疫苗及重组病毒灭活疫苗安全性评价
将50只BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只：
第1组滴鼻方式接种实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)病毒的HA效价为7log2，108.5EID50/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)；
第2组滴鼻方式接种实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒的HA效价为7log2，108.5EID50/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)；
第3组滴鼻方式接种实施例1(二)制备的H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，109.5EID50/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)；
第4组滴鼻方式接种实施例1(二)制备的H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，109.5EID50/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)；
第5组为空白对照组(接入Gbico磷酸盐缓冲液PBS销售公司：上海根生生物科技有限公司)。
观察感染后14天内所有小鼠的临床症状。
结果为临床症状：五组小鼠14天内均状态良好，未出现死亡小鼠，临床表现无明显差异，表明制备的H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗及H3N2和H3N8重组病毒二价灭活疫苗安全性好。
实施例3、H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒二价灭活疫苗免疫原性和保护性评价
1、犬疫苗效力试验
1.1动物分组
将93只8周龄比格犬随机分为31组，HI检测均为H3亚型流感病毒抗体阴性：第1-1组，1-2组，1-3组，1-4组，1-5组和1-6组为H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗组；第2-1组，2-2组，2-3组，2-4组2-5组和2-6组为H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗组；第3-1组，3-2组，3-3组，3-4组3-5组和3-6组为H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗组；第4-1组，4-2组，4-3组，4-4组4-5组和4-6组为H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗二价灭活疫苗组；第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组5-5组和5-6组为阴性对照组；第6组为空白对照组；监测整个试验阶段是否有H3亚型流感病毒的自然感染。
1.2免疫与攻毒
第1-1组，1-2组，1-3组，1-4组，1-5组和1-6组通过皮下注射实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)病毒的HA效价为7log2，108.5EID50/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)，免疫2次，每次间隔14d；
第2-1组，2-2组，2-3组，2-4组、2-5组和2-6组通过皮下注射实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒的HA效价为7log2，108.5EID50/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)，免疫2次，每次间隔14d；
第3-1组，3-2组，3-3组，3-4组、3-5组和3-6组通过皮下注射实施例1(二)制备的H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，109.5EID50/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)，免疫2次，每次间隔14d；
第4-1组，4-2组，4-3组，4-4组、4-5组和4-6组通过皮下注射实施例1(二)制备的H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，109.5EID50/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，108EID50/ml)，免疫2次，每次间隔14d。
第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组、5-5组和5-6组和第6组犬均未注射疫苗。
2免后14d，第1-1、2-1、3-1、4-1和5-1组犬通过静脉注射2m L 106EID50的老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009，H3N2)，第1-2、2-2、3-2、4-2和5-2组犬通过静脉注射2m L 106EID50的新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017；H3N2)，第1-3、2-3、3-3、4-3和5-3组犬通过静脉注射2m L 106EID50新分支毒株1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2)；第1-4、2-4、3-4、4-4和5-4组犬通过静脉注射2m L 106EID50新分支毒株147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)；
第1-5、2-5、3-5、4-5和5-5组犬通过静脉注射2m L 106EID50的H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)；第1-6、2-6、3-6、4-6和5-6组犬通过静脉注射2m L106EID50的H3N8毒株(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)，攻毒前，各组犬均通过肌肉注射5-11mg/kg舒泰50(出售公司：北京佑宠生物科技有限公司及产品编号：WK001)。
第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组5-5组和5-6组为阴性对照组(非免疫组)；第6组为空白对照组(非免疫且非攻毒组)。
以下H3N2毒株均为本实验室保存毒株；
362毒株Genbank号：PB2：(JX101382,2009/12/17)PB1：(JX101383,2009/12/17)PA：(JX101384,2009/12/17)HA：(JX101385,2009/12/17)NP：(JX101386,2009/12/17)NA：(JX101387,2009/12/17)M：(JX101388,2009/12/17)NS：(JX101389,2009/12/17)。
159毒株Genbank号：PB2：(MK212398,2017/06/01)PB1：(MK212399,2017/06/01)PA：(MK212400,2017/06/01)HA：(MK212405,2017/06/01)NP：(MK212402,2017/06/01)NA：(MK212403,2017/06/01)M：(MK212404,2017/06/01)NS：(MK212401,2017/06/01)。
H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005)为Genbank上传毒株，Genbank号：PB2：(CY067275,2005/9/30)PB1：(CY067276,2005/9/30)PA：(CY067277,2005/9/30)HA：(CY067278,2005/9/30)NP：(CY067279,2005/9/30)NA：(CY067280,2005/9/30)MP：(CY067281,2005/9/30)NS：(CY067282,2005/9/30))
1.3临床症状和体温的监测
攻毒后1d～14d，每日观察各组犬的临床症状，早晚监测各组犬的体温变化。
结果为：第1-1、2-1、3-1、4-1组第1-2、2-2、3-2、4-2组第1-4、2-4、3-4、4-4组、第1-5、2-5、3-5、4-5组和第1-6、2-6、3-6、4-6组犬在分别感染A/canine/Beijing/362/2009,H3N2、A/canine/Xian/0601-159/2017,H3N2、A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2犬流感病毒及A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8和A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8犬流感病毒后无明显临床症状且体温正常；而第1-3、2-3、3-3、4-3组犬在感染A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2后只有第2-3和4-3组无明显临床症状且体温正常，1-3组和3-3组出现明显的临床症状与5-3组出现的临床症状相似，另外阴性对照组第5-1组、5-2组、5-3组、5-4组、5-5组和5-6组出现明显的临床症状，犬在攻毒后第2天开始精神沉郁，喜卧，而后攻毒犬出现眼鼻分泌物增多，流鼻涕，打喷嚏等。且第5-1组(攻362毒株)在攻毒后第8天体温达到最高39.6℃，第5-2组(攻159毒株)在攻毒后第5天体温达到最高40.2℃，第5-3组、1-3组和3-3组(攻1109毒株)在攻毒后第5天体温达到最高分别为40.4℃、40℃及40.2℃，第5-4组(攻147毒株)在攻毒后第5天体温达到最高40℃；第5-5组(攻115809H3N8毒株)在攻毒后第7天体温达到最高39.8℃，第5-6组(攻13628H3N8毒株)在攻毒后第7天体温达到最高39.4℃(实验开始前比格犬正常体温38.5℃-38.7℃，以上均为各组犬平均体温。)。
1.4病毒排毒检测
攻毒后1d～14d，每天采集各组犬的鼻咽拭子，通过鸡胚定量的方法检测每只犬的排毒情况。
结果为：攻毒后第1-1、2-1、3-1、4-1组、第1-2、2-2、3-2、4-2组、第1-4、2-4、3-4、4-4组以及第2-3、4-3组犬鼻咽拭子未检测到病毒。第5-1、5-2、5-3、5-4组、5-5组、5-6组及1-3、3-3组犬鼻咽拭子检测到病毒，排毒时长均为6天，并分别对以上排毒组采集的2,4,6天的犬鼻咽拭子进行了定量，第5-1组(362)第2天鼻咽拭子定量结果4.5EID50/ml,第4天2.75EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；第5-2组(159)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID50/ml，第四天2.75EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；第5-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果3.5EID50/ml，第四天3.75EID50/ml，第6天3.5EID50/ml；第5-4组(147)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID50/ml，第四天2.75EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；
第5-5组(115809H3N8毒株)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID50/ml，第四天3.5EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；第5-6组(13628H3N8毒株)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID50/ml，第四天3.25EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；第1-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID50/ml，第四天3.25EID50/ml，第6天2.5EID50/ml；第3-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID50/ml，第四天3.5EID50/ml，第6天2.75EID50/ml。
以上定量结果为每组三只犬的平均值。
1.5抗体检测
第1-1组、1-2组、1-3组、1-4组、1-5组和1-6组，第2-1组、2-2组、2-3组、2-4组、2-5组和2-6组，第3-1组、3-2组、3-3组、3-4组、3-5组和3-6组和第4-1组、4-2组、4-3组、4-4组、4-5组和4-6组犬在免疫0、7d、14d、21d、28d攻毒，0、3d、7d、9d、13d分别采血，制备血清，经RDE处理，通过HI检测抗体水平(请提供具体处理方法和抗体水平检测方法血清处理方法：血清：RDE＝1:3(体积比)置于37℃水浴锅中处理18-20h，然后再置于56℃水浴锅中处理30分钟，将RDE灭活。
抗体水平检测方法：血凝抑制实验。
第1-1组、1-2组、1-3组、1-4组、1-5组和1-6组结果(免疫A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:2log2,7d HI:5log2,9d HI:7log2,13d HI:8log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；
第2-1组、2-2组、2-3组、2-4组、2-5组和2-6组结果(免疫A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:3log2,7d HI:6log2,9d HI:8log2,13d HI:10log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；
第3-1组、3-2组、3-3组、3-4组、3-5组和3-6组结果(免疫A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:2log2,7d HI:4log2,9d HI:6log2,13d HI:8log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；
第4-1组、4-2组、4-3组、4-4组、4-5组和4-6组结果(免疫A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:3log2,7d HI:5log2,9d HI:8log2,13d HI:10log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)。
上述结果表明，本发明的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗与A/canine/Beijing/0528-147/2017 147H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗、A/canine/Beijing/0528-147/2017 147H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗相比，前者(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2相关疫苗)可以更好的实现对犬流感老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009,H3N2)和新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017，H3N2)、147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2)及H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)、(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)的攻毒免疫保护。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业大学
<120> H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1700
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60
ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc gaacgggaca 120
atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180
aactcctcaa cagggaaaat atgcaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gagggactgc 240
acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300
gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360
tatgcatccc tccgatccat agttgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420
ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgct 480
aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcag gaaatacata tccagtgttg 540
aatgtgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600
ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660
tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720
ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780
ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaatgca cattgggaaa 840
agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900
aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960
tgtcccaaat atgttaagca aaacaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020
gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080
gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140
gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200
attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260
aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320
gccgagcttc ttgttacctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380
aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440
ggctgcttca aaatctacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500
acttatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaagt 1560
gttgagctaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620
tttttgcttt gcgttgtctt gctggggttc attatgtggg cctgcgcgaa aggcaacatt 1680
aggtgcaaca tttgcatttg 1700
<210> 2
<211> 566
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Phe Gly
1 5 10 15
Gln Asn Leu Leu Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Met Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asp Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln
85 90 95
Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Ala
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Pro Ala
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Asn Thr
165 170 175
Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr
195 200 205
Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg
225 230 235 240
Gly Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Met His Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val
385 390 395 400
Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Thr Leu Glu
435 440 445
Asn Gln Asn Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser
485 490 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Val
500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Ser Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Ala Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 3
<211> 1403
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60
tgtttcctct tacagattgc catcctagca acaactgtga cactgtactt caagcaaaat 120
gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaaata gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180
aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240
gtgctagaat acaggaactg gtcgaaaccg cagtgtcaaa ttacaggatt tgctcctttc 300
tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tctgggtaac aagggaacct 360
tatgtgtcat gcgaccccag caaatgttat cagtttgcac ttgggcaggg gaccacactg 420
aacaataaac actcaaacag cacaatacat gataggacct cttatcggac tcttttaatg 480
aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgcatagc atggtccagt 540
tcaagttgtc acgatgggaa agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600
gcgactgcta gtttcgtgta taatggaatg cttgttgaca gtattggttc atggtctcga 660
aatatcctca ggactcaaga gtcagaatgt gtttgcatca atgggacttg tacagtagta 720
atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tactattcat cagagagggg 780
aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840
tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900
cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960
cttgttggcg atacaccaag gaatgatgat agctctagca gcagtaactg caaggatcct 1020
aataatgaga gagggaatcc aggagtgaag gggtgggcct ttgataatga taatgacgtt 1080
tggatgggga ggacaatcag caaagattta cgttcaggtt atgagacttt caaggtcatt 1140
ggtggctgga ccactgctaa ttccaagtca caggtcaata gacaagtcat agttgacaat 1200
aataactggt ctggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg tgttaatagg 1260
tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320
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ggggcgaata ttaacttcat gcc 1403
<210> 4
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Leu Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu Tyr Phe Lys Gln Asn Glu Cys Asn Ile Pro Ser Asn Ser
35 40 45
Gln Ile Val Pro Cys Lys Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu
50 55 60
Val Val His Leu Asn Asn Thr Thr Glu Lys Glu Ile Cys Ser Val Val
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp
100 105 110
Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Ser Lys Cys
115 120 125
Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Lys His Ser
130 135 140
Asn Ser Thr Ile His Asp Arg Thr Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn
145 150 155 160
Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala
165 170 175
Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys
180 185 190
Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Val Tyr Asn Gly
195 200 205
Met Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Arg Asn Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met
225 230 235 240
Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile
245 250 255
Arg Glu Gly Lys Ile Ile His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln
260 265 270
His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Gln Tyr Pro Asn Val Arg Cys
275 280 285
Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Asp Ile
290 295 300
Asn Met Ala Asp Tyr Asn Ile Asn Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu
305 310 315 320
Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys
325 330 335
Lys Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala
340 345 350
Phe Asp Asn Asp Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp
355 360 365
Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr
370 375 380
Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn
385 390 395 400
Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys
405 410 415
Val Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Gly Pro Gln Glu
420 425 430
Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr
435 440 445
Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn
450 455 460
Phe Met
465
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<211> 1691
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60
ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc aaacgggaca 120
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gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080
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attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260
aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320
gccgagcttc ttgttgcctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380
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gttgagttaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620
tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaatatt 1680
aggtgcaaca t 1691
<210> 6
<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Phe Gly
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20 25 30
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35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln
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100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Ile
115 120 125
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Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Arg Asn Thr
165 170 175
Tyr Pro Val Leu Asn Met Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys
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Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg
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Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg
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Gly Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Ile His Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
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305 310 315 320
Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
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Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
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Arg Cys Asn
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60
tgtttcctat tacagattgc catcctaaca acaactgtga cactgtactt caaacaaaat 120
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aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240
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tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tttgggtaac aagagaacct 360
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aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgtatagc atggtccagt 540
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atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tattattcat cagagagggg 780
aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840
tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900
cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960
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aatagcattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380
ggggcgaata ttaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttagaaaa aaactcctt 1439
<210> 8
<211> 477
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 8
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Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Leu Gln Ile Ala Ile Leu Thr Thr Thr
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Leu Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe
85 90 95
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100 105 110
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Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Lys His Ser
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Asn Ser Thr Ile His Asp Arg Thr Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn
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Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala
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Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys
180 185 190
Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn Gly
195 200 205
Met Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Arg Asn Ile Leu Arg Thr
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Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met
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Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile
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Arg Glu Gly Lys Ile Ile His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln
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His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Gln Tyr Pro Asn Val Arg Cys
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Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Asp Ile
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Asn Met Ala Asp Tyr Asn Ile Asn Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu
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Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys
325 330 335
Lys Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala
340 345 350
Phe Asp Asn Asp Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp
355 360 365
Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr
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Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn
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Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys
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Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr
435 440 445
Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn
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atgacaaaca ttctaacggc acaataaagg atcgaagccc gtataggact ttgatgagtg 240
tcaaaatagg gcaatcaccc aatgtatatc aagctaggtt tgaatcggtg gcatggtcag 300
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Gly Val Thr Gly Pro Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Val Asn Tyr Gly
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Gly Val Pro Val Asp Thr Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg
130 135 140
Thr Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Lys Gly Asp Cys Tyr Trp Val
145 150 155 160
Met Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Lys Tyr Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Ala Lys Asp Gly Arg Val Ile Gly Gln Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly
180 185 190
Gly His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu
195 200 205
Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Ile Leu Val
210 215 220
Ile Ser Ser Asp Leu Ser Tyr Thr Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Ile
225 230 235 240
Pro Thr Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys
245 250 255
Thr Ser Pro Leu Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe
260 265 270
Arg Gln Gly Thr Asp Val Trp Ala Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser
275 280 285
Arg Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn
290 295 300
Ser Lys Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Asp Pro Asn Trp
305 310 315 320
Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Thr Lys Lys
325 330 335
Gly Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Lys Pro
340 345 350
Glu Glu Thr Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly
355 360 365
Val Asp His Lys Ile Ala Ser Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu
370 375 380
Pro
385
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<211> 1691
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60
ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc aaacgggaca 120
atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180
aactcctcaa cagggaaaat atgtaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gaggaactgc 240
acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300
gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360
tatgcatccc tccgatccat aattgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420
ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgat 480
aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcaa gaaatacata tccagtgttg 540
aatatgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600
ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660
tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720
ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780
ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaataca cattgggaaa 840
agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900
aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960
tgtcccaaat atgttaagca aagcaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020
gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080
gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140
gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200
attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260
aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320
gccgagcttc ttgttgcctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380
aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440
ggctgcttca aaatctacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500
acctatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaggt 1560
gttgagttaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620
tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaatatt 1680
aggtgcaaca t 1691
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<211> 1439
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60
tgtttcctat tacagattgc catcctaaca acaactgtga cactgtactt caaacaaaat 120
gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaaata gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180
aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240
gtgctagaat acaggaactg gtcgaaaccg cagtgtcaaa ttacaggatt tgctcctttc 300
tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tttgggtaac aagagaacct 360
tatgtgtcat gcgaccccag caaatgttat cagtttgcac ttgggcaggg gaccacactg 420
aacaataaac actcaaacag cacaatacat gataggacct cttatcggac tcttttaatg 480
aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgtatagc atggtccagt 540
tcaagttgtc acgatgggaa agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600
gcgactgcta gtttcattta taatggaatg cttgttgaca gtattggttc atggtctcga 660
aatatcctca gaactcaaga gtcagaatgt gtttgcatca atgggacttg tacagtagta 720
atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tattattcat cagagagggg 780
aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840
tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900
cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960
cttgttggcg atacaccaag gaatgatgat agctctagca gcagtaactg caaggatcct 1020
aataatgaga gaggaaatcc aggagtgaag gggtgggcct ttgataatga taatgacgtt 1080
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tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320
aatagcattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380
ggggcgaata ttaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttagaaaa aaactcctt 1439
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaaaaacac cgatctcgag 120
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ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acaaggcagt caaactgtac 300
aggaagttga aaagagagat aacattccac ggggctaaag aagttgcact cagctattca 360
accggtgcac ttgccagttg tatgggtctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccaca 420
gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccacc tgtgaacaga ttgctgattc acagcatcgg 480
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actcacccta gctccagtgc cggtctaaaa gatgatcttc ttgaaaactt gcaggcctac 720
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tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgtat 840
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tatgagggaa gagtatcggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg at 952
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atggcgtctc agggcaccaa acgatcgtat gaacagatgg aaactggtgg agaacgccag 60
aatgctaccg agataagagc atctgttggg cgaatggttg gtggcattgg gagattttac 120
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attaatgatc ggaatttctg gagaggcgaa aacggacgga gaacaaaaat tgcatatgag 660
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caggtgcgag aaagcagaaa ccccggaaat gctgaaattg aagatctcat ctttttggca 780
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tacggacttg ccgtggccag tggatatgat tttgagaaag aagggtactc tctagttgga 900
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ctaagagtct caagtttcat cagaggaaca agggtaattc caagaggaca actatccacc 1080
agaggagttc aaattgcttc aaatgagaac atggaaaaaa tagactccag tactcttgaa 1140
ctgagaagca gatattgggc tataaggacc aggagtggag gaaacaccaa ccaacagaga 1200
gcatctgcag gacaaatcag tgtacagcca actttctcgg tacagagaaa tattcccttc 1260
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
atggactcca atactgtgtc aagctttcag gtagactgct ttctttggca tgtccccaaa 60
cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aagtccctaa gaggaagagg cagcaccctt ggtctggaca ttgaaacagc tactcgtata 180
ggaaaacaga tagtggagtg gattctggag gaagaatccg ataaggcact taaaatgacc 240
attgcttcag tcccagtttc acgctaccta actgacatga cacttgaaga aatgtcaaga 300
gactggttca tgctcatgcc aaagcaaaaa gtagcagggt ccctttgcat caaaatggac 360
caggcaataa tggataaaaa catcacattg aaagcaaact tcagtgtgat ttttgagcga 420
ctggaaactc taatactact tagagctttc acaaacgaag gagcaattgt tggagaaatt 480
tcaccattac cttctcttcc aggacatact gataaggatg tcaaaaatgc aattgggatc 540
ctcatcggag ggcttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaat tctacagaga 600
ttcgcttgga gaagcagtga tgagaatggg agatcttcac tccctccaaa gtagaaacgg 660
aaaatggcga gaacaattaa gtcagaaatt tgaggaaata aggtggctaa tcgaagaagt 720
acggcataga ttaaagatta cggaaaacag ctttgaacaa ataacattta tgcaagcctt 780
acgaactatt gcttgaggta gagcaagaga taaga 815
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtggcag cacaaaatgc tataagtact 60
acattccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa cagggacagg atacaccatg 120
gacacagtca atagaacaca tcaatactca gagaaaggaa aatggacaac aaacacagaa 180
actggagcac cccaactcaa tccaattgat ggaccactac ccgaggataa tgagccaagc 240
ggatatgcac aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgaaaa gtcccaccca 300
gggatctttg aaaactcatg tattgaaacg atggaagttg ttcagcaaac aagagtggac 360
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ggaagactaa tagatttcct taaggatgta atggaatcaa tggacaaaga agagatggag 540
ataacaacac atttccagaa aaaaagaaga gtaagagaca acatgaccaa gaaaatgata 600
acacagagga caatagggaa gaaaaagcag agactgaaca agaggaacta cataataaga 660
gcactgacat tgaacacaat gaccaaggat gcagaaagag gcaaattgaa gagacgggca 720
attgcaacac ccggaatgca gatcagagga ttcgtgtatt ttgttgaaac attagcgaga 780
agcatctgtg agaaacttga gcagtctgga ctccctgttg gagggaatga aaaaaaggct 840
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acaattactg gagacaatac caaatggaat gagaatcaaa atcctcggat gtttctagca 960
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cctataatgt tctcgaacaa aatggcaagg ttgggaaaag gatacatgtt cgagagtaag 1080
aacatgaaac tacgaacaca aataccagca gaaatgcttg caaacattaa cctgaaatac 1140
ttcaatgaat caacaagaaa gaaaatcgag aaaataagac ctctcttaat agatggcaca 1200
gcctcactga gccctggaat gatgatgggc atgttcaaca tgctgagtac agtcttagga 1260
gtctcaatct taaatcttgg acaaaaaagg tataccaaaa gcacatactg gtgggatgga 1320
ctccaatcct ccgatgattt cgccctcata gtgaatgcac caaatcatga ggggatacaa 1380
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tttgtagcca acttcagtat ggaactaccc agctttggag tatccggggt taacgagtca 1560
gctgacatga gcattggagt tacggtaata aagaacaata tgataaacaa tgatctagga 1620
ccagcaacag ctcagatggc ccttcagcta ttcatcaaag actacagata cacatatcgg 1680
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aagagaataa tggaaatgat tcctgaaagg aatgaacaag ggcagatact ttggagtaag 240
acaagtgacg ctggatcgga cagggtgatg gtgtctccct tagctgtaac ctggtggaac 300
aggaatgggc cgacgacaag tacagtccac tatccaaagg tttacaaaac atactttgag 360
aaggttgaaa ggttaaaaca tggaaccttc ggtcccgttc atttccgaaa ccaagttaaa 420
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gatgtcatca tggaggtcgt ttttccaaat gaagtgggag ctagaatatt gacatcagag 540
tcgcaattaa caataacaaa agagaagaaa gaagaactcc aaaattgtaa gattgctcct 600
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gcaggcggaa caagcagtgt gtacattgag gtattgcatt tgacacaagg aacctgctgg 720
gaacagatgt acactccagg cggagaagta agaaatgacg acgttgatca gagtctgatc 780
atcgccgcca gaaacattgt taggagagca acggtatcag cggatccact ggcatcactg 840
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aatccaactg aggaacaagc tgtggatata tgcaaggcag caatgggctt gaggatcagt 960
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gacgcaaaag tactgtttca gaattggggg attgaaccta ttgataatgt catgggaatg 1380
atcggaatat tacctgacat gactccaagc acagagatgt cactgagagg agtaagagtt 1440
agtaaaatgg gagtagatga atattccagc actgaaagag tggttgtaag tattgatcgt 1500
ttcttacggg ttcgagatca acgggggaac atactcttat ctcccgaaga ggtcagcgaa 1560
acacaaggaa ccgagaaatt gacaataaca tactcatcat caatgatgtg ggagatcaac 1620
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aaagctaatg tactgatagg acaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg gaaacgggac 2220
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gagaagacac acatccatat tttttcattc actggagaag agatggccac caaagcagac 480
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ttgaaaacaa caccacgccc tcttaaatta cctgatgggc ctccctgcac ccaacggtca 840
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gaatcgagga aattacttct cattgttcag gcacttaggg acaacctgga acctggaacc 2040
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ttgcttaatg catcttggtt caactccttc ctcacacatg cactgaaata gttgtggcaa 2160
tgctact 2167
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