一种生物碱化合物sophaline B的制备方法及用途
阅读说明：本技术 一种生物碱化合物sophaline B的制备方法及用途 (Preparation method and application of alkaloid compound sephaline B ) 是由 代小勇 张玉波 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：一种生物碱化合物sophaline B的制备方法及用途,属于天然药物化学技术领域。本发明一方面提供了生物碱化合物sophaline B在制备非小细胞肺癌疾病药物中的用途,一种用于预防或治疗非小细胞肺癌细胞的药物制剂,另一方面提供了生物碱化合物sophaline B的制备方法。本发明从中药材苦豆子中分离的生物碱类化合物sophaline B对肿瘤细胞有很好抑制作用,能够显著抑制非小细胞肺癌细胞A549,PC9的增殖。本发明提供的化合物可为新型抗肿瘤药物的开发提供物质基础,有利于中药材苦豆子药用价值的进一步开发。为非小细胞肺癌等提供有效的治疗小分子药物,能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。(A preparation method and application of alkaloid compound sephaline B, belonging to the technical field of natural medicinal chemistry. The invention provides an application of an alkaloid compound, namely, sephaline B in preparation of a non-small cell lung cancer disease medicament, a medicinal preparation for preventing or treating non-small cell lung cancer cells, and provides a preparation method of the alkaloid compound, namely, sephaline B. The alkaloid compound, namely the sephaline B, separated from the traditional Chinese medicine sophora alopecuroides has a good inhibition effect on tumor cells, and can obviously inhibit the proliferation of non-small cell lung cancer cells A549 and PC 9. The compound provided by the invention can provide a material basis for the development of novel antitumor drugs, and is beneficial to the further development of the medicinal value of the Chinese medicinal herb sophora alopecuroides. Provides effective small molecule treatment medicine for non-small cell lung cancer and the like, and can be widely applied in the fields of medicine and biology.)
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种生物碱化合物sophaline B的制备方法及用途。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是全球最常见的恶性肿瘤之一，随着全球人口数量的增长和人口老龄化的增加，肺癌发生率不断增加，成为致死率最高的肿瘤。2015年世界卫生组织发布的统计数据表明，2012年全球肺癌新发病例约180万，占到全部肿瘤类型的13％。2013年中国肺癌死亡约55万例，占全球该类癌症死亡例数1/3。在我国，男性肺癌发病率和病死率均占所有恶性肿瘤的第1位，女性发病率占第2位，病死率占第1位。国家癌症中心统计，2015年中国肺癌发病例数约73万例，其中男性约51万例、女性约22万例；同年，中国死亡的肺癌病例数约61万例，其中男性约43万例、女性约18万例。肺癌发病和死亡率随着年龄增长而上升，一般40岁以后上升明显，75岁左右达到高峰，然后有所下降。
非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是一种常见的肺部恶性肿瘤，绝大多数非小细胞肺癌起源于支气管粘膜上皮。指的是肺部组织内细胞生长失去控制的疾病。这种细胞生长可能会造成转移，就是侵入相邻的组织和渗透到肺部以外。约占肺癌总数的80-85％。它是一种异质性肿瘤，可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。NSCLC大部分患者确诊时已是晚期。局部晚期、身体状况好的NSCLC患者经一系列化疗、放疗和(或)手术治疗能达到8个月的无病生存(disease-free survival，DFS)期，5年生存率＜15％。因此寻找新的有效治疗药物是十分必要的！
苦豆子，中药名，为豆科植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的种子。槐属草本或基部木质化成亚灌木状植物，高可达1米。分布于华北、西北及河南、西藏。具有清热燥湿，止痛，杀虫之功效。常用于痢疾，胃痛，白带过多，湿疹，疮疖，顽癣。具有中枢抑制，抗炎及抗变态反应，抑制免疫作用，抗心律失常及正性肌力，保肝等作用。sophaline B化合物，是苦豆子中分离出来的生物碱类化合物，现有技术并无报道其具有治疗非小细胞肺癌的作用。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种生物碱化合物sophaline B的制备方法及用途。本发明首次发现中药材苦豆子或其提取物具有明显的抗非小细胞肺癌肿瘤活性，具有制备预防或治疗非小细胞肺癌及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
生物碱化合物sophaline B在制备抗非小细胞肺癌疾病药物中的用途。
所述的用途，其特征在于所述sophaline B抑制非小细胞肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭和克隆，促进非小细胞肺癌细胞A549发生凋亡。
所述的用途，其特征在于所述sophaline B抑制非小细胞肺癌细胞PC9的增殖。
所述的用途，其特征在于所述sophaline B抑制非小细胞肺癌细胞HUVEC血管形成。
一种用于预防或治疗非小细胞肺癌细胞的药物制剂，其特征在于所述药物制剂中含有生物碱化合物sophaline B。
所述的用于预防或治疗非小细胞肺癌细胞的药物制剂，其特征在于所述药物制剂是通过添加常规辅料，按照常规工艺制备而成；
所述的常规辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、交联聚维酮、微粉硅胶、氢化植物油、滑石粉、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、碳酸氢纳、枸橼酸、羧甲基淀粉钠中一种或一种以上；
所述的制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
一种生物碱化合物sophaline B的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取干燥的苦豆子种子粉碎后，用95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏；
(2)将所得浸膏分散于水中，用1％的盐酸调pH到3，加入氯仿，充分萃取后弃去有机层，将剩下的水层用2％的氨水调pH到8，再用氯仿萃取得苦豆子总碱；
(3)将步骤(2)得到的苦豆子总碱混悬于水中后，上D101大孔树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱后得水部位、40％乙醇部位、65％乙醇部位和95％乙醇部位；
(4)将95％乙醇部位再经ODS柱分析，采用甲醇：水系统梯度洗脱，得到5个馏分Fr.1-Fr.5，Fr.5部分再经制备型高效液相，采用乙腈：水：二乙胺系统，纯化后得到化合物sophaline B。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中苦豆子与95％乙醇的质量比为1:10。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中梯度洗脱系统中甲醇：水体积比为30:70-100:0。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中乙腈：水：二乙胺体积比为35:65:0.01。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次发现苦豆子提取物sophaline B具有明显的抗非小细胞肺癌肿瘤活性，具有制备预防或治疗非小细胞肺癌及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。
2、本发明的苦豆子提取物成本低、污染小，有利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。
3、本发明通过研究苦豆子提取物sophaline B对非小细胞肺癌细胞A549，PC9的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用，有力证明了本发明的苦豆子提取物对肿瘤细胞具有明显的抑制和致亡作用。
4、本发明的苦豆子或苦豆子提取物还具有祛风除湿、舒筋活血等功效，可用于风湿性关节炎、跌打损伤、瘀积肿痛、产后风瘫等症，可以在用于预防或治疗肿瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。
5、苦豆子可以与其他药材进行配伍组成复方药用于预防或治疗肿瘤，还可以将苦豆子提取物与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂，这些制剂较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。
附图说明
图1为生物碱sophaline B化合物化学结构式；
图2为生物碱sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549，PC9增殖的影响作用，其中A为sophaline B化合物在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞A549增殖影响，B为sophaline B化合物在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞PC9增殖影响；
图3为生物碱sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响作用，其中A为sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响，B为凋亡统计；
图4为生物碱sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭的影响作用，其中A为sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭影响，B为迁移统计，C为侵袭统计；
图5为生物碱sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成的影响作用，其中A为sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成影响，B为克隆统计；
图6为生物碱sophaline B化合物对非小细胞肺癌细胞A549血管形成的影响作用，其中A为sophaline B化合物对HUVEC细胞血管形成影响，B为血管长度统计，C为血管百分比统计，D为血管连接长度统计。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：苦豆子的提取
干燥的苦豆子种子(30kg)粉碎后，用10倍质量的95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(1.9kg)。将所得浸膏分散于水中，用1％的盐酸调pH到3，并加入氯仿，充分萃取后弃去有机层。剩下的水层用2％的氨水调pH到8，再用氯仿萃取得苦豆子总碱(897g)。苦豆子总碱混悬于水中后，上D101大孔树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱后得水部位(302g)、40％乙醇部位(317g)、65％乙醇部位(177g)和95％乙醇部位(35g)。95％乙醇部位再经ODS柱分析，采用甲醇：水(体积比为30:70-100:0)系统梯度洗脱，得到5个馏分(Fr.1-Fr.5)。Fr.5部分再经制备型高效液相(乙腈：水：二乙胺体积比为35:65:0.01)纯化后得到化合物sophaline B，化合物结构如图1所示。
实施例2：sophaline B化合物可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549，PC9的增殖
1.将非小细胞肺癌细胞A549，PC9以5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，培养24h，然后饥饿过夜；
2.加入不同浓度梯度(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)的化合物分别培养24小时、48小时、72小时；
3.每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
4.弃培养板中的上清，加入150μLDMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。
如图2所示，不同浓度的sophaline B化合物可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549，PC9的增殖，并且随着作用时间的增加，化合物抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用也更为显著。
实施例3：生物碱Sophaline B化合物可以促进非小细胞肺癌细胞A549的凋亡
1.将非小细胞肺癌细胞A549以5×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，培养24h，然后饥饿过夜；
2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养48小时；
3.先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管。500g左右离心5分钟，沉淀细胞；
4.用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；
5.加入100μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；
6.加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；
7.加入400μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。
如图3所示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，Sophaline B化合物可以明显促进非小细胞肺癌细胞A549发生凋亡。**P<0.01与对照组相比较。
实施例4：生物碱Sophaline B化合物可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的迁移和侵袭
1.Transwell上室种2×105个细胞，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养24小时；
2.下室加入800μL含有10％FBS的培养基；
3.用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
4.用PBS洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；
5.用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照；
如图4所示，通过实验发现，随着作用浓度的升高，Sophaline B化合物可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭。**P<0.01与对照组相比较。
实施例5：生物碱Sophaline B化合物可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的体外克隆形成能力
1.将非小细胞肺癌细胞A549以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，培养10天，然后饥饿过夜；
2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物作用24h；
3.PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
4.用PBS洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；
5.用PBS洗3次，显微镜拍照。
如图5所示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，Sophaline B化合物可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549克隆形成。**P<0.01与对照组相比较。
实施例6：生物碱Sophaline B化合物可以显著抑制HUVEC血管形成能力
1.先用Matrigel铺板24孔板过夜；
2.将HUVEC细胞以5×104个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养6h；
3.用PBS洗3次，显微镜拍照。
如图6所示，随着作用浓度的升高，Sophaline B化合物可以明显抑制HUVEC血管形成。**P<0.01与对照组相比较。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。