具体实施方式

实施例1：PRRSV流行毒株的分离及鉴定

(1)病毒、细胞及疫苗

PRRSV分离流行毒株ZJ/H和ZJ/NB，PBMC细胞、Marc145细胞，猪外周血单 核细胞分离液试剂盒，高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)，猪繁殖与 呼吸综合征灭活疫苗(CH-1a株)。

病料的采集及处理。取临床疑似蓝耳发病猪新鲜肺脏及淋巴结，加入冷的PBS研磨，将研磨液3000r/min离心10min，取上清，冻融2次，0.22μm滤菌器过滤，即为 疑似PRRSV病毒原液。

PBMC细胞的制备。首先用加抗凝剂的抗凝管缓慢抽取等量抗凝血(全血∶抗凝剂＝6∶1)，轻轻颠倒混匀，取一支15ml离心管，按照猪外周血单核细胞分离液试剂盒说 明书，依次小心缓慢加入分离液1、分离液2制成梯度界面。用吸管吸取细胞悬液加 于分层液面上，500g，离心20min。用吸管小心吸取第二层到另一个15ml离心管中， 向所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。250g，离心10min，弃上清。用吸管加 入5ml清洗液重悬所得细胞，250g，离心10min，重复洗涤2次，获得细胞沉淀。

PBMC细胞的培养。用含10％胎牛血清的1640培养液，以1.5～3×10⁶个/ml的密 度重悬细胞，将细胞铺于细胞培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中贴壁培养，24h后弃 去漂浮细胞，贴壁细胞即为分离的单核细胞(PBMC)，补加新的生长液培养待用。显 微镜可见细胞较小，多呈星形(见图1)。

PBMC细胞初步分离PRRSV。将疑似PRRSV病毒原液按10％比例接种准备好的 PBMC细胞，37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h，加入含2％胎牛血清的1640维持液， 继续培养48～96h，每天观察记录细胞病变，将病变明显的细胞液，冻融2次，-70℃ 冻存。

(2)PRRSV的PCR检测及鉴定。

参考PRRSV毒株基因序列(GenBank登录号：EU807840.1)设计并合成NSP2 基因引物，用于对分离株基因组序列的PCR扩增。引物由上海生工生物工程有限公司 合成。

上游引物：5ˊ-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTT-3ˊ；

下游引物：5ˊ-GACAAATCTAGAGGCTCGTC-3ˊ。

吸取反转录引物Random Primer 1μL、RNA模板1μL，70℃作用5min，冰浴2min； 加入5×M-MLV Buffer 4.0uL、10mmol/L dNTP 2.0μL、HPRI RNA酶抑制剂1.0μl，37℃ 作用5min；1000r/min离心10s后加入M-MLV反转录酶1.0ul，充分混匀后，42℃温 浴90min，70℃10min灭活反转录酶，冰浴2min，-20℃保存备用。

PCR反应体系：10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)2μL、2.5mmol/L的dNTP Mix 2.0μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、上下游引物各0.5～1.5μL、模板5.0μL，灭菌双蒸水补足至20μL PCR扩增程序为：PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性40s，46～55℃退 火45s，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝 胶电泳检测。结果显示在767bp和464bp处出现特异性PRRSV目的条带(见图2)， 将鉴定为阳性的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。

Mega6.0软件进行的序列比对结果显示，与经典PRRSV CH-1a相比，所检样品中 分离出一株高致病性PRRSV和一株类NAD30毒株，将其分别命名为ZJ/H株和ZJ/NB 株。高致病性PRRSV ZJ/H株扩增出的NSP2基因序列如SEQ ID No.1所示；类NAD30 毒株ZJ/NB株扩增出的NSP2基因序列如SEQ ID No.2所示。

将分离的PRRSV，按照5％比例接种状态良好的单层Marc145细胞，37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h，加入含2％胎牛血清的DMEM继续培养，待80％细胞出现聚堆、脱 落时收获病毒液，冻融2次，-70℃冻存。按照同样的方法，再盲传接种2代。所分离 PRRSV在Marc145细胞上培养的第二代开始，出现典型细胞病变，说明病毒适宜在 Marc145细胞上繁殖。

将分离的ZJ/H株和ZJ/NB株PRRSV病毒按照Reed-Muench法检测病毒半数感染 量(TCID₅₀)。结果病毒效价均可达10^7.0TCID₅₀/ml以上。

按照《中国兽药典》进行ZJ/H株和ZJ/NB株的外源检测，检测合格，可作为PRRSV 灭活疫苗候选毒种进行免疫效力的研究。

将分离到的ZJ/H株和ZJ/NB株PRRSV病毒进行保藏。

ZJ/H株PRRSV病毒分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒，株号为PRRSV-ZJ/H 株，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年5月8日，保 藏号为CCTCC NO：V202130。

ZJ/NB株PRRSV病毒分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒，株号为 PRRSV-ZJ/NB株，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021 年5月8日，保藏号为CCTCC NO：V202140。

实施例2：猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的制备

疫苗用病毒液的制备。取生长为良好单层的Marc145细胞，弃掉旧培养液，按5％比例(V/V)分别接种猪繁殖与呼吸综合征ZJ/H株和ZJ/NB株毒种，37℃、5％CO₂培养箱内吸附1h后，加入含2％胎牛血清的DMEM维持液继续培养。待80％细胞出 现聚堆、脱落时收获病毒液，冻融2次，-70℃保存。

病毒半数感染量(TCID₅₀)的测定。将上述制备的病毒液用无血清培养基做10 倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，分别接种于Marc145细胞的96孔板，每 个稀释度6孔，0.1ml/孔，在37℃、5％CO₂培养箱观察5日，计算TCID₅₀。两个病毒 的病毒含量均不低于10^7.0TCID₅₀/ml。

疫苗用病毒液的灭活。将检验合格的病毒液分别加入终浓度为5mmol/L的BEI灭活剂，37℃搅拌灭活24h，最后加入5mmol/L的硫代硫酸钠中和1h，2～8℃保存。

将灭活后的两种病毒抗原按体积比1∶1混合，再按照病毒水相抗原与佐剂3∶1 (质量比)比例缓慢加入赛比科公司的ISA 28VG佐剂，1000rpm搅拌20min，制成乳 化剂。制备的疫苗物理性状检验合格。

猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的安全试验：

用5月龄健康易感后备母猪5头(中和抗体效价＜1∶4)，每头颈部肌肉注射疫苗4ml，连续观察14d，无不良反应。表明疫苗具有良好的安全性。

猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的免疫效力试验：

应用PRRSV抗原、抗体阴性的健康易感后备母猪，对猪繁殖与呼吸综合征二价 灭活疫苗进行免疫效力试验。

试验动物方案：

40头5月龄健康后备母猪(中和抗体效价＜1∶4)分为A～H共8个组。A～F组 先免疫商品化高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)，2ml/头份。2周后， C、D组免疫制备的猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗(ZJ/H株+ZJ/NB株)2ml/头份， E、F组免疫商品化猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(CH-1a株)2ml/头份；A、B、G及 H组免疫PBS 2ml。二免14d后，所有试验猪按照以下试验方案分组情况，用ZJ/H株 或ZJ/NB株攻毒(10^5.0 TCID₅₀)，每头滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，连续观察14d， 所有存活猪安乐死。根据临床症状、中和抗体水平、血清病毒载量及攻毒前后体重变 化等评价所制备猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗对后备母猪的免疫效力(表1)。

表1试验方案分组

免疫及攻毒后临床症状。A～F六个组在疫苗免疫后精神、食欲正常，无体温升高等不良反应。

攻毒后A、B、C、D、E及F组猪全部存活，B、E组及F组各有一头试验猪发病， 发病猪体温升高，精神食欲下降，有咳嗽、气喘等呼吸道症状。G和H两个不免疫攻 毒对照组猪全部发病，且分别有2头和1头死亡。结果表明PRRS活疫苗虽对ZJ/H可 产生较好的免疫保护，但对ZJ/NB的攻击保护效率降低，而若在PRRS活苗免疫后进 行PRRS二价灭活疫苗的加强免疫，则攻毒后未出现任何肉眼可见病变，对猪提供良 好的攻毒保护(表2)。

表2攻毒后临床症状及大体剖检病理变化

注：分子为发病或存活试验猪数量，分母为试验猪总头数。

中和抗体是评价疫苗激发体液免疫保护的重要参考指标。检测结果显示，免后21d所有组中和抗体均为阴性(＜1∶4)，相比之下，C、D、E及F四个灭活疫苗加强免 疫组虽在首次免疫后28d中和抗体仍较低，但在攻毒后第7d中和抗体明显上升，其中 最高的为C组，中和抗体效价达4.9log2。攻毒后第14d灭活疫苗加强免疫组中和抗体 水平虽略有下降，但仍比其他试验组明显高，F组疫苗毒株诱导血清对HZ/NB的中和 能力差，所以与其他三组灭活疫苗加强免疫组相比，中和抗体效价偏低(见图3)。

各试验组在首免后28d(攻毒前)、攻毒后7、14d，分别采血，检测血清中PRRSV 病毒载量，结果整个攻毒期间C、D及E组未检测到PRRSV，A、B和F组攻毒后血 清病毒载量较低，约10^1.3～10^2.2copies/μl；G及H组病毒载量较高，达10^3.4copies/μl以 上。表明与单独免疫PRRS活疫苗相比，PRRS灭活疫苗的加强免疫，尤其是免疫的 同源性更高的PRRS二价灭活疫苗，可加速试验猪体内排毒，缩短排毒期，有效降低 病毒在自然感染后环境中的病毒量(见图4)。

首免后28d(攻毒前)及攻毒后7、14d对存活试验猪称重，计算平均日增重。平 均日增重＝(攻毒后称重当天体重-攻毒当日体重)/攻毒后天数/攻毒当日体重。攻毒后 7d所有免疫组试验猪的日增重均比攻毒当天首免后28d降低，其中C、D、E加强免 疫组日增重降低不明显(小于15g)，而A、B两个活苗免疫攻毒组平均降低约167g， G和H两组体重负增长。在攻毒14d后A、B组试验猪日增重逐渐恢复正常，C、D、 E及F组基本恢复至正常生长水平，而G和H两组存活试验猪仍未实现增重。表明灭 活疫苗的加强免疫对提高猪的日增重，缩短出栏天数提供保障(见图5)。

序列表

<110> 杭州佑本动物疫苗有限公司

<120> 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒二价灭活疫苗及制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 767

<212> DNA

<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus)

<400> 1

atgttgtgct tcctggggtt gtggcggcga atctgacaac cgaacaacct caggtcaact 60

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<212> DNA

<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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