新型冠状病毒肺炎dna纳米疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 新型冠状病毒肺炎dna纳米疫苗及其制备方法 (Novel coronavirus pneumonia DNA nano vaccine and preparation method thereof ) 是由 米鹏 仝爱平 卓维玲 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法,将传统编码新型冠状病毒外壳上刺突蛋白(S)的DNA胞质尾区域删除为S.dCT DNA,与阳离子聚合物通过静电相互作用自组装成纳米疫苗,其中阳离子聚合物为PAsp(EDA)、PAsp(DET)、PAsp(TET)、PAsp(TEP)、PAsp(BAP)、PAsp(TAE)或PAsp(TAP)中的一种或它们的同类型衍生物。本发明制备的DNA纳米疫苗有较高的转染效率,优化的DNA可以增加刺突蛋白在细胞膜上的表达水平,引起体液免疫,引发高滴度的针对假病毒的中和抗体,并且安全性高,可用于预防和控制新型冠状肺炎。(The invention discloses a DNA nano vaccine aiming at novel coronavirus pneumonia and a preparation method thereof, wherein a DNA cytoplasmic tail region of a spike protein (S) on a traditional coding novel coronavirus shell is deleted to be S.dCT DNA, and the DNA cytoplasmic tail region and a cationic polymer are self-assembled into the nano vaccine through electrostatic interaction, wherein the cationic polymer is one of or the same type of derivatives of PASp (EDA), PASp (DET), PASp (TET), PASp (TEP), PASp (BAP), PASp (TAE) or PASp (TAP). The DNA nano vaccine prepared by the invention has higher transfection efficiency, the optimized DNA can increase the expression level of spike protein on cell membranes, cause humoral immunity and initiate high-titer neutralizing antibodies aiming at pseudoviruses, and the DNA nano vaccine has high safety and can be used for preventing and controlling novel coronary pneumonia.)
技术领域
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)是引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)爆发的原因，自2019年末开始疫情在全球持续爆发和持续，造成了巨大的人员伤亡和重大经济损失。面对反复无常的疫情和感染，唯有疫苗才是我们对抗病毒最有效的武器(Vaccine39(2)(2021)197-201)。
SARS-CoV-2的蛋白外壳由刺突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、血凝素酯酶二聚体蛋(He)和包膜蛋白(E)组成。S蛋白是一类病毒融合蛋白，介导病毒附着于细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体，进行膜融合，病毒进入细胞后被核内体吸收。S蛋白的蛋白水解裂解以及病毒膜与核内体膜的融合触发病毒RNA释放到细胞质中(Nat Microbiol5(4)(2020)562-569)。因此，S蛋白是SARS-CoV-2最重要的免疫原性蛋白，可刺激机体产生特异性中和抗体，介导机体的细胞免疫,它是研发SARS-CoV-2疫苗最关键的靶点。
目前，多种SARS-CoV-2候选疫苗正在开发中，主要分为五条技术方向：灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗(又分为mRNA疫苗和DNA疫苗)五种。最近，中国的灭活疫苗已上市(Cell 182(3)(2020)713)，美国辉瑞公司与德国拜恩泰科公司合作研发的BNT162b1(Interim Report.medRxiv；2020.DOI:10.1101/2020.06.30.20142570.)和美国莫德纳公司研发的mRNA-1273等(N.Engl.J.Med.383(20)(2020)1920-1931。然而，现有的疫苗存在保护周期较短，副反应大和安全性问题，另外，病毒的不断变异，需要开发新型新冠疫苗。
DNA疫苗技术相对成熟，质粒DNA在宿主体内可存在较长时间，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠，基因疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且可以导致细胞毒T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫，而传统的疫苗只有活疫苗可诱导细胞免疫，但存在活疫苗毒力回升的危险。DNA疫苗比需要体外培养冠状病毒的灭活疫苗更安全，且灭活疫苗有引起抗体依赖性感染增强(antibody-dependentenhancement of infection,ADE)的风险，抗体增加病毒感染的能力，最终使疾病恶化(Nature Microbiology 5(10)(2020)1185-1191)。与mRNA疫苗相比，DNA更加稳定，是温度稳定和不受冷链限制的，这是输送到资源有限的环境中的重要优势。
基因递送载体是DNA疫苗中的关键部分，主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然转染效率高，但因其制备与生产困难、具有高免疫原性及包载基因的大小会受到限制等原因，其发展和应用受到了很大限制。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体，通过与基因的静电相互作用将基因递送到细胞内。其中阳离子聚合物易于合成和改性，无免疫原性，因此可作为良好的基因递送载体，用来制备新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗，但是同时必须关注其转染效率、稳定性和安全性尤其是避免产生ADE效应等问题。
Walls等(Cell 183(5)(2020)1367)构建了表达S蛋白受体结合域的质粒，通过质粒转染293细胞，从293细胞中提取、纯化S蛋白的受体结合域，制备了S蛋白质纳米颗粒疫苗，在BALB/c小鼠中引起强效的中和抗体反应。该技术存在以下缺点：
(1)提取、纯化蛋白质和制备好纳米粒后的纯化过程比较繁杂，生产成本较高；
(2)没有关注此疫苗的是否安全，是否会引起ADE效应。
Smith等(Nature Communications 11(1)(2020))构建了表达S蛋白的质粒，提取目的DNA，注射到小鼠胫骨前肌肉中，随后使用体内电穿孔设备对肌肉进行恒定电流的脉冲，促使DNA转染进小鼠的细胞中，该DNA疫苗能刺激小鼠产生中和抗体，阻断S蛋白与ACE2受体结合，阻止SARS-CoV-2病毒的感染。该技术存在以下缺点：
(1)此文献设计的DNA序列为表达S蛋白的全长DNA序列，表达的S蛋白大部分会滞留在内质网膜上(Journal of Virology,2020.94(21))，分泌到细胞外的较少；
(2)需要专用的电穿孔设备促进DNA的转染，成本较高；
(3)要控制电穿孔的条件，否则细胞死亡率高或者转染效率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：
(1)针对现在新型冠状肺炎疫情肆虐的情况，构建一种预防新型冠状病毒感染的疫苗，根据该病毒的特点，选定S蛋白为靶点，构建能稳定表达S蛋白的、能将S蛋白分泌到细胞外被免疫细胞识别从而引起强烈免疫应答的DNA。
(2)提供一种新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗的制备方法。
(3)提供上述新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗的应用。
本发明的技术方案为：一种新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗，它由质粒载体和阳离子聚合物通过静电自组装形成纳米疫苗，所述质粒载体上含有编码新型冠状病毒外壳S蛋白且删除了胞质尾区域99个核苷酸的DNA，所述阳离子聚合物为聚天冬氨酸。
进一步地，编码新型冠状病毒外壳S蛋白且删除了胞质尾区域99个核苷酸的DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，质粒载体为pCAGGS载体。
进一步地，阳离子聚合物中可质子化的氮原子和质粒载体中的磷酸根的摩尔比为1-60。
进一步地，阳离子聚合物聚[N-(2-氨乙基)天冬氨酸]简写为PAsp(EDA)，分子量为1.0-40KDa；聚{N-[N’-(2-氨乙基)-2-氨乙基]天冬氨酸}简写为PAsp(DET)，分子量为1.0-40KDa；聚(N-{N’-[N”-(2-氨乙基)-2-氨乙基]-2-氨乙基}天冬氨酸)简写为PAsp(TET)，分子量为1.0-40KDa；聚[N-(N’-{N”-[N”’-(2-氨乙基)-2-氨乙基]-2-氨乙基}-2-氨乙基)天冬氨酸]简写为PAsp(TEP)，分子量为1.0-40KDa；聚(N-{N’-[N”-(3-氨乙基)-3-氨乙基]-3-氨乙基}天冬氨酸)简写为PAsp(BAP)，分子量为1.0-40KDa；聚(N,N,N-3(2-氨乙基)天冬氨酸)简写为PAsp(TAE)，分子量为1.0-40KDa；或者聚(N,N,N-3(3-氨丙基)天冬氨酸)简写为PAsp(TAP)，分子量为1.0-40KDa。
上述所述的新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将质粒载体和阳离子聚合物分别用pH 7.40的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液配成适宜浓度的溶液。
(2)将质粒载体溶液与阳离子聚合物溶液按适当的比例混合均匀，静置，使带正电的阳离子聚合物与带负电的DNA通过静电相互作用形成DNA纳米疫苗，其粒径在40-100nm。
进一步地，阳离子聚合物的浓度为1.0-10μg/μL，质粒载体的浓度为0.1-10μg/μL；阳离子聚合物中可质子化的氮原子和质粒载体中磷酸根的摩尔比(N/P比)为1-60。
本发明所述的DNA纳米疫苗在制备预防或/和治疗新型冠状病毒肺炎的药物上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的新型冠状病毒DNA纳米疫苗基因载体为阳离子聚合物，具有低毒性、可生物降解性，提高了此疫苗的安全性和稳定性。
(2)本发明提供的新型冠状病毒DNA纳米疫苗，针对新冠病毒的S蛋白，并且将S蛋白的DNA删除了胞质尾区域，可以增加S蛋白分泌到细胞膜外的水平，引发高滴度的针对假病毒的中和抗体。
(3)制备方法简单，所需设备为常规设备。
附图说明
图1不同阳离子聚合物的结构；
图2S.dCT DNA表达载体的构建；
图3制备DNA纳米疫苗的示意图；
图4DNA纳米疫苗的DLS粒径图；
图5DNA纳米疫苗的透射电镜图(比例尺为100纳米)；
图6DNA纳米疫苗体外表达S蛋白的蛋白质印迹分析；
图7S蛋白在细胞膜上的表达量；
图8DNA纳米疫苗免疫小鼠后小鼠血清中结和抗体的含量；
图9DNA纳米疫苗免疫小鼠后引起CD4+和CD8+T细胞免疫的实验结果，其中(A-B)为IFN-γ的百分含量，(C-D)为TNF-α的百分含量，(E-F)为IL-4的百分含量；
图10假病毒中和实验结果图，(A)为假病毒中和荧光图，(B)为假病毒中和滴度图；
图11DNA纳米疫苗对于小鼠的安全性实验结果，其中(A)为注射DNA纳米疫苗后14天内小鼠的体重变化图，(B)为注射DNA纳米疫苗后14天内小鼠的体温变化图，(C)为注射DNA纳米疫苗后第14天小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑的苏木精-伊红染色图(比例尺为100微米)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1：阳离子聚合物的制备
本实施例以正丁胺和L-天冬氨酸-5-苄酯-N-羧酸内酸酐(BLA-NCA)单体为原料通过开环聚合反应得到高分子PBLA，通过氨解反应将氨基小分子引入到PBLA侧链中，合成了阳离子聚合物。其中氨基小分子可以是乙二胺(EDA)、二乙烯三胺(DET)、三乙烯四胺(TET)、四乙烯五胺(TEP)、双3-氨基丙基-1,3-丙二胺(BAP)、三(2-氨基乙基)胺(TAE)或者三(3-氨丙基)胺(TAP)，对应地，可得到阳离子聚合物[N-(2-氨乙基)天冬氨酸]简写为PAsp(EDA)；聚{N-[N’-(2-氨乙基)-2-氨乙基]天冬氨酸}简写为PAsp(DET)，聚(N-{N’-[N”-(2-氨乙基)-2-氨乙基]-2-氨乙基}天冬氨酸)简写为PAsp(TET)，聚[N-(N’-{N”-[N”’-(2-氨乙基)-2-氨乙基]-2-氨乙基}-2-氨乙基)天冬氨酸]简写为PAsp(TEP)，聚(N-{N’-[N”-(3-氨乙基)-3-氨乙基]-3-氨乙基}天冬氨酸)简写为PAsp(BAP)，聚(N,N,N-3(2-氨乙基)天冬氨酸)简写为PAsp(TAE)，或者聚(N,N,N-3(3-氨丙基)天冬氨酸)简写为PAsp(TAP)。不同阳离子聚合物的结构如图1所示。
实施例2：S.dCT DNA表达载体的构建
根据官方公布的SARS-CoV-2S蛋白序列(Wuhan/WIV04/2019)，删除了序列最后的胞质尾区域99个核苷酸(SEQ ID No.1)，在其cDNA片段的5’和3’端分别加上EcoRI和Bg1II酶切位点，将其克隆到含鸡β-肌动蛋白启动子和β-珠蛋白聚腺苷化信号控制下的pCAGGS表达载体中，其中抗性基因为抗氨苄青霉素的抗性基因。
实施例3：DNA纳米疫苗的制备
以阳离子聚合物PAsp(EDA)为例制备DNA纳米疫苗，将PAsp(EDA)和S.dCT DNA表达载体分别溶解于10mM，pH 7.40的HEPES缓冲溶液中，使阳离子聚合物的浓度为1.0-10μg/μL，S.dCT DNA表达载体的浓度为0.1-10μg/μL。
本实施例中，S.dCT DNA表达载体浓度为0.1μg/μL，按照不同N/P比(阳离子聚合物中可质子化的氮原子和S.dCT DNA表达载体中磷酸根的摩尔比为1-60)调节PAsp(EDA)溶液的浓度。将PAsp(EDA)溶液加入到两倍体积的S.dCT DNA表达载体溶液中，涡旋混合30s，静置半个小时，制备成了S.dCT/PAsp(EDA)复合物溶液，即DNA纳米疫苗。用同样的方法步骤，可以用其它阳离子聚合物PAsp(DET)、PAsp(TET)、PAsp(TEP)、PAsp(BAP)、PAsp(TAE)、PAsp(TAP)或者它们的衍生物制备出复合物溶液。制备DNA纳米疫苗的示意图如图3所示。
取100μL的N/P比为10:1的复合物溶液用马尔文激光粒度仪对其粒径进行测定，各组DNA纳米疫苗的粒径结果如图4所示，其水合粒径都在60-70纳米左右。将上述复合物负染后，通过透射电子显微镜观察其形态和大小，结果如图5所示，纳米粒呈大小均一的圆形颗粒。
实施例4：DNA纳米疫苗体外S蛋白的表达
将人肾上皮细胞(293T细胞)接种于6孔板中，在37℃、5％CO2孵箱中孵育过夜，原始细胞密度为每孔5×105个细胞。每孔用含3μg实施例3中的DNA纳米疫苗转染细胞，48h后用细胞刮刀将细胞刮下，在冰上用细胞裂解液裂解细胞30分钟，将裂解后的样品与上样缓冲液在95℃加热10分钟，进行对钠十二烷基的硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，8％分离胶和4％浓缩胶)。然后在300mA电泳条件下，将蛋白从胶上转移到0.45μm的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，将膜放入5％(W/V)脱脂奶粉中封闭1h。将含有蛋白的PVDF膜与抗刺突糖蛋白抗体或抗β-actin的小鼠单克隆抗体在4℃下孵育过夜，随后与过氧化物酶亲和纯山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗孵育1h，最后，用ECL超敏发光液孵育后用曝光仪成像。实验结果见图6，说明该DNA纳米疫苗能在体外转染293T细胞表达S蛋白。
实施例5：流式细胞仪分析细胞膜表面S蛋白的表达
将表达ACE2受体的293T细胞(293T/ACE2)接种于24孔板，初始细胞密度为5×104个/孔，在37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。将实施例3中制备的DNA纳米疫苗(1μgDNA/孔)加入细胞，培养48h后，收获细胞，用1％BSA封闭30分钟。封闭后用PBS洗三次，细胞用抗S蛋白抗体在4℃孵育1h。然后加入荧光素(FITC)偶联亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)，4℃避光孵育1h。PBS洗涤3次后，用流式细胞仪分析细胞。实验结果见图7，说明该DNA纳米疫苗能将S蛋白分泌到细胞膜上，以便免疫细胞的识别从而产生免疫应答。
实施例6：小鼠对S蛋白的体液反应
在小鼠腿部肌肉注射实施例3中的DNA纳米疫苗或者磷酸盐缓冲液(PBS)，以疫苗中的DNA计算，每只小鼠注射25μg DNA。每两周免疫一次，一共三次，最后一次免疫2周后取小鼠血清，通过酶联免疫吸附(ELISA)测试其中的结合抗体含量。96孔板用1μg/mL SARS-CoV-2S蛋白预涂，在2-8℃下孵育过夜，并在室温下用2％的牛血清白蛋白溶液封闭1小时。然后每孔加入不同稀释倍数的热灭活血清于37℃孵育2小时，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠抗体在37℃避光孵育1小时后，每孔加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，然后加入2mol/L的硫酸中止反应。用酶标仪在450nm处读取吸光度值。ELISA终点滴度定义为产生吸光度的最高血清稀释倍数。实验结果见图8，该DNA纳米疫苗刺激小鼠产生了高水平的结和抗体。
实施例7：DNA纳米疫苗免疫诱导小鼠T细胞免疫应答
按实施例6中的免疫方案免疫小鼠三次后，在最后一次免疫后两周，处死小鼠取脾脏，将脾脏组织均质化，重悬于PBS中，然后通过70μm尼龙细胞过滤器，用SARS-CoV-2S蛋白(2μg/mL)的重叠肽和淋巴细胞刺激合剂在37℃、5％CO2下刺激脾细胞6h。孵育后，用荧光标记的抗CD3、CD4和CD8抗体对细胞进行染色。细胞表面染色后，固定细胞，进行细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)染色后，使用流式细胞仪进行检测，然后使用FlowJo软件分析。结果见图8，这两种DNA纳米疫苗引起了T细胞免疫应答，细胞因子TNF-α和IFN-γ的含量显著增多，而IL-4的含量几乎不变，说明该疫苗引起了Th1型免疫应答而不会引起抗体依赖性增强的风险。
实施例8：小鼠免疫血清中和SARS-CoV-2假病毒的研究
用编码密码子优化的SARS-CoV-2S蛋白质粒(S.dCT DNA表达载体)、PCDH-Luc-mCherry载体和带有gag/pol表达质粒的psPAX2转染293T细胞。感染48小时后，从培养上清中收集表达荧光素酶和红色荧光蛋白(mCherry)的假病毒，用超滤离心管浓缩，放入-80℃保存直至使用。
将293T/ACE2细胞接种于96孔板中，密度为每孔104个细胞，在37℃、5％CO2孵箱中孵育过夜。将实施例6中免疫的小鼠血清样品在96孔板上连续稀释。将相同体积的假病毒加入孔中，37℃预孵育1h，然后加入293T/ACE2细胞中感染细胞48h。用荧光光显微镜观察mCherry红色荧光的表达情况。将细胞裂解后，使用酶标仪检测细胞荧光素酶含量。SARS-CoV-2中和滴度定义为相对荧光素酶单位(RLU)比对照组降低50％的样品稀释度。实验结果见图10，S.dCT/DET纳米疫苗引起小鼠产生的中和抗体滴度为1︰115，S.dCT/TEP纳米疫苗引起小鼠产生的中和抗体滴度为1︰143。
实施例9：DNA纳米疫苗安全性实验
用DNA纳米疫苗或者PBS免疫小鼠，以DNA计算，每只小鼠肌肉注射25μg DNA，记录打药后14天内小鼠的体温体重变化。在14天后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾和脑进行苏木精-伊红染色，观察疫苗对小鼠组织的毒性。实验结果见附图11，结果表明该DNA纳米疫苗不会引起小鼠体温、体重和主要器官组织的变化，具有安全性。
序列表
<110> 四川大学
<120> 新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3765
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒S蛋白(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa tctgaccaca 60
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