用于在无细胞系统中使用葡萄糖计检测目标分析物的合成生物电路
阅读说明：本技术 用于在无细胞系统中使用葡萄糖计检测目标分析物的合成生物电路 () 是由 K·帕迪 E·阿马尔菲塔诺 M·卡里科夫 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：描述了用于在无细胞系统中响应于目标分析物而生成报告分子的方法。合成生物电路用于响应于所述目标分析物的存在而改变所述报告分子的水平。所述报告分子可以是葡萄糖或使用诸如葡萄糖监测仪或其他便携式传感器的装置容易检测的另一种分子。还提供了试剂盒,所述试剂盒包括具有合成生物电路的无细胞系统,所述合成生物电路响应于目标分析物而生成或消耗报告分子。()
相关申请
本申请要求2017年12月22日提交的美国临时专利申请号62/609,525的优先权权益，所述申请的全部内容特此以引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及用于检测目标分析物的产品和方法，并且更具体地涉及用于使用产生或消耗葡萄糖的合成生物电路检测目标分析物的产品和方法。
背景技术
血糖监测仪可以说是最广泛使用的诊断装置，并且通过实现血糖的便携式量化、以及因此个人管理，已经“彻底改变了”数百万糖尿病患者的生活。年度全球销售额110亿美元(USD)，葡萄糖计对于分布式诊断而言是前所未有的成功。这种广泛采用已引起装置制造、分销和耗材的全球网络，以及患者和临床医生的广泛接受。然而，这种成功尚未与其他疾病生物标志物(例如核酸、蛋白质和其他小分子)的便携式诊断相匹配。尽管关于这一点原因复杂，但重要的因素是缺乏用于其他类别的分析物的适当的便携式传感器技术。
已经描述了将个人葡萄糖计改变用途用于检测除葡萄糖以外的分析物的先前工作(Xiang和Lu,2011；Xiang等人,2014,Lan等人,2016)。然而，这些报告中使用的分子机制包括使用适体或多个元件之间的DNA杂交，以及使用可限制其实用性的预生成的酶。
仍然需要易于适用于便携式传感器技术的用于检测目标分析物的新颖产品和方法。
发明内容
本发明涉及可用于通过激活无细胞系统中的合成生物电路来检测目标分析物的方法和产品。在一个实施方案中，所述合成生物电路的激活改变诸如葡萄糖的报告分子的水平。然后可使用如通过使用葡萄糖计检测报告分子来检测样品中目标分析物的存在。
如图1所示，可使用诸如基因电路的合成生物电路来响应于目标分析物的存在而激活报告酶的活性或表达。可选择底物和酶的各种组合，所述组合引起反应中报告分子水平的增加或降低。在一个优选的实施方案中，所述报告分子是葡萄糖，并且所述合成生物电路生成和/或激活报告酶，所述报告酶改变反应体积内的葡萄糖水平。葡萄糖在无细胞反应体积内是由另外对葡萄糖计呈惰性的底物(如多糖)生成。在一个实施方案中，将葡萄糖转化为另外对葡萄糖计呈惰性的产物(如D-葡萄糖酸-1,5-内酯)。使用葡萄糖计和/或葡萄糖试纸可容易地确定所述反应体积内葡萄糖水平的变化。图2中示出用于使用葡萄糖监测仪检测来自患者的血液样品中的目标分析物的示例性测定。
此外，本文描述的实施方案允许在单个反应中检测样品内的多种目标分析物。如图4所示，可在无细胞系统中使用多个合成生物电路，以响应于使用葡萄糖监测仪容易地区分的不同目标分析物生成不同的葡萄糖水平。
在此描述的实施方案具有许多优点，并且可出于不同目的用于检测不同样品类型中的目标分析物。例如，本文所述的实施方案可在适于检测患者样品中临床上相关量的疾病相关DNA/RNA的便携式装置中实现。类似地，所述技术可用于在医护点(point-of-care)对个体进行基因分型以推断表型信息，测试食品中基因组标记物的存在(例如食品安全性)或分析环境样本(例如生态监测)。此外，通过简单地改变基于上游基因的电路，可检测目标样品中的小分子分析物，如污染物(例如重金属或农药)、***品(例如国家安全)或非法物质(例如执法机关)。本文所述的方法和产品还可用于检测分子条形码，如用于追踪供应链中的物品、对信息进行加密和/或给高价值物品加水印的分子条形码。本文所述的实施方案允许使用廉价且便携式的传感器(如葡萄糖监测仪)用于检测各种各样的目标分析物。
因此，在一个方面，提供了一种用于响应于样品中的目标分析物生成葡萄糖的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使所述样品与无细胞系统中的合成生物电路接触。所述目标分析物然后激活所述合成生物电路以改变无细胞系统反应体积内的葡萄糖水平。
任选地，所述目标分析物激活所述合成生物电路以增加所述无细胞系统反应体积内的葡萄糖水平或降低所述无细胞系统反应体积内的葡萄糖水平。
在一个实施方案中，所述目标分析物是无机分子或有机分子。在一个实施方案中，所述目标分析物是生物分子，如核酸分子(DNA或RNA)或蛋白质。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述样品与所述合成生物电路接触之前或期间处理所述样品以纯化一种或多种目标分析物和/或使一种或多种目标分析物可用。例如，在一个实施方案中，所述方法包括从所述样品提取核酸分子。本领域已知的各种核酸提取方法可与本文所述的实施方案组合使用。在一个实施方案中，所述方法包括使用诸如纸或膜的基底来提取目标分析物，所述基底捕获所述目标分析物，如核酸分子。在另一个实施方案中，所述方法包括将磁珠用于目标分析物提取。在一个实施方案中，本文所述的方法包括在使样品与合成生物电路接触之前从所述样品中基于纸的核酸分子提取，任选地如本文所述的ReCap RNA提取，然后基于核酸序列的等温扩增(例如NASBA、RPA、LAMP等)。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述样品与所述合成生物电路接触之前或期间，增加和/或扩增所述样品中的所述目标分析物的浓度。例如，在一个实施方案中，所述方法包括使用本领域已知的核酸扩增技术任选地作为等温扩增技术来扩增靶DNA分子或RNA分子。
在一个实施方案中，所述合成生物电路任选地通过调控响应于目标分析物改变所述无细胞反应体积中的葡萄糖水平的酶的转录或翻译来调控所述酶的表达。在一个实施方案中，所述合成生物电路是基因电路。例如，在一个实施方案中，所述基因电路包含响应于所述目标分析物而控制编码所述酶的mRNA的翻译的核糖调控因子，如支点开关(toeholdswitch)。或者，所述合成生物电路可任选地通过改变所述无细胞系统中的葡萄糖水平的酶的翻译后调控来调控所述酶的水平或活性。
可根据本文所述的实施方案使用底物和酶的各种组合，所述组合引起所述无细胞系统反应体积内报告分子水平的增加或降低。在一个实施方案中，所述底物是葡萄糖或由酶作用以生成葡萄糖的底物。例如，在一个实施方案中，所述底物是海藻糖，并且所述酶是海藻糖酶。根据说明书的教义，底物和酶的其他组合对于熟练的技术人员将是显而易见的，包括但不限于图1B中列出的那些。在一个实施方案中，使用酶HMG-CoA裂解酶从HMG-CoA生成乙酰乙酸酮。在另一个实施方案中，使用酶3-羟基丁酸脱氢酶将D-3-羟基丁酸酯氧化为乙酰乙酸酯。在一个实施方案中，使用β-羟基丁酸脱氢酶将β-羟基丁酸酯转化为乙酰乙酸酯。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括在使所述样品或其一部分与所述无细胞系统中的合成生物电路接触之前处理所述样品。例如，在一个实施方案中，对所述样品进行处理以使所述样品中的葡萄糖浓度标准化或降低和/或以增加所述样品中的目标分析物的相对浓度。在一个实施方案中，对所述样品进行处理以除去和/或螯合样品中的内源性葡萄糖和/或血糖。任选地，所述方法包括使所述样品与葡萄糖脱氢酶和NAD接触以将内源性葡萄糖转化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括检测所述无细胞系统反应体积中的报告分子，从而检测所述样品中的目标分析物。在一个实施方案中，所述报告分子是葡萄糖，并且葡萄糖计和/或葡萄糖试纸用于检测所述无细胞系统反应体积中的葡萄糖。在一个实施方案中，所述报告分子是酮，并且酮计和/或酮试纸用于检测所述无细胞系统反应体积中的酮。
本文所述的实施方案还可用于在多重检测反应中检测多种不同的目标分析物。例如，在一个实施方案中，所述方法包括使所述样品与无细胞系统中的多个合成生物电路接触，其中不同的目标分析物激活每个合成生物电路以改变所述无细胞系统反应体积中的葡萄糖水平。在一个实施方案中，将所述无细胞系统反应体积中的葡萄糖水平与一种或多种对照水平进行比较可用于确定所述样品中多种目标分析物的存在、不存在和/或水平。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括将指示一种或多种目标分析物的存在或不存在的数据呈现给用户。或者，将数据在诸如智能手机的便携式电子装置上呈现给用户。
在另一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括包含合成生物电路的无细胞系统，所述合成生物电路响应于样品中的目标分析物而生成或消耗报告分子。在一个实施方案中，所述报告分子是葡萄糖。在一个实施方案中，所述试剂盒包括容器，任选地，用于接收所述样品和/或使所述样品与所述无细胞系统接触的容器。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于执行如本文所述的方法的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括试剂，所述试剂操作以形成具有合成生物电路的无细胞系统。在一个实施方案中，将所述无细胞细胞冷冻干燥。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于执行用于生成报告分子和/或检测如本文所述的目标分析物的方法的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于加工所述样品，如用于从所述样品中提取核酸分子的产品和/或试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于捕获所述目标分析物的基底，如纸或膜基底，任选地纤维素。在一个实施方案中，将所述基底固定至容器，任选地固定至适于接收所述样品的容器的内部。在一个实施方案中，将粘附的基底固定至所述容器的可移除的帽或盖的内部。在一个实施方案中，所述试剂盒包括适于提取核酸的磁珠。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于增加所述样品中的目标分析物的浓度的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增靶核酸分子，任选地用于所述核酸分子的等温扩增的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于所述样品的热处理，任选地用于蒸发所述样品或溶解所述样品中的细胞的加热器。在一个实施方案中，在使所述样品与所述无细胞系统接触之前的热处理使内源性蛋白质(包括修饰葡萄糖的酶)变性。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于接收样品的容器，其中所述容器包括可移除的盖，并且所述基底被附接至所述可移除的盖。在一个实施方案中，所述试剂盒包括多个容器，并且所述可移除的盖被构造成配合所述多个容器。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于在使所述样品与所述合成生物电路接触之前提取、洗涤和/或扩增目标分析物的单独容器。在一个实施方案中，所述试剂盒包括适于提取、洗涤和/或扩增所述目标分析物的试剂，如缓冲液。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括合成生物电路，所述合成生物电路包括基因电路。在一个实施方案中，所述基因电路包含控制编码酶的mRNA的翻译的核糖调控因子，如支点开关，所述酶的表达生成或消耗所述无细胞系统中的葡萄糖。在一个实施方案中，所述试剂盒包括多个合成生物电路，所述多个合成生物电路响应于所述样品中的多种不同的目标分析物而生成或消耗葡萄糖。任选地，每个合成生物电路使用不同的底物和酶生成葡萄糖。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于处理和/或稀释所述样品的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于除去和/或螯合所述样品中的内源性葡萄糖和/或血糖的试剂。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括预定量的用于将所述样品中的葡萄糖转化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯的葡萄糖脱氢酶(GDH)和NAD。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括葡萄糖计和/或葡萄糖试纸。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包括酮计和/或酮试纸。
根据以下详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图简要说明
现将结合附图来描述本发明的实施方案，在附图中：
图1A示出用于检测产生荧光或比色蛋白质输出并需要专用设备进行解释的目标分析物的常规的基于基因电路的传感器。此类常规检测方法与诸如葡萄糖计的广泛可用的诊断基础设施不兼容。图1B、1C、1D和1E示出用于将标准葡萄糖计和试纸转换成用于使用生成葡萄糖的酶来检测如本文所述的目标分析物的通用装置的各种实施方案。图1B提供报告酶、它们各自的底物和每分子的葡萄糖产量的列表。图1C示出基于基因电路的传感器的示例性实施方案可通过调节控转录而起作用，其中基于TetO的基因电路受到TetR的存在阻遏。这种阻遏在添加小分子aTc的情况下减轻，所述小分子破坏TetR与TetO启动子的结合，从而允许生成葡萄糖的酶的转录和翻译。图1D示出用于调控翻译的示例性基于支点开关的基因电路的示意图。在存在正确触发RNA的情况下，支点开关的5'RNA发夹被线性化，这允许核糖体结合至核糖体结合位点(RBS)并诱导生成葡萄糖的报告酶的翻译。图1E示出无细胞反应中低聚葡萄糖底物的转化。这些底物的低聚状态意味着它们对葡萄糖试纸无反应，直到它们通过来自激活的基因电路的报告酶输出转化为单体葡萄糖为止。
图2示出用于解释使用葡萄糖计的基于基因电路的RNA传感器输出的流程图的一个实施方案。可例如使用柳叶刀通过手指点刺从受试者提供样品。然后将样品稀释到样品制备缓冲液小瓶中，所述小瓶包括靶标特异性引物和等温扩增反应混合物，并且将所述小瓶倒置以混合。在扩增后，通过移除密封并倒置封闭的小瓶，将扩增的靶序列转移至盖中的微腔室中。允许进行使用RNA传感器的无细胞反应(任选地持续20-40分钟)，并且正是在此时间段期间，如果患者样品对于目标分析物呈阳性，则将产生葡萄糖。然后将葡萄糖试纸***微腔室中并在葡萄糖监测仪上读取。
图3示出通过滴定葡萄糖脱氢酶(GDH)的NAD共底物进行的葡萄糖的受控减少。当GDH在无细胞反应中表达时，可通过供应不同量的NAD来精确控制由所述酶分解代谢的葡萄糖的量。NAD通过GDH还原为NADH，并且是1:1比例的葡萄糖的分解代谢所需的。GDH可用作诊断性报告酶，或在运行测定之前减少样品中存在的内源性葡萄糖。
图4示出信号强度用于来自诊断性无细胞反应的多路复用输出。将不同酶的DNA模板添加到共同反应混合物中允许反应响应于不同的目标分析物而生成不同的葡萄糖水平。这可用于在单个反应中操作多个诊断传感器。所有反应均使用无细胞表达系统进行，并且除了如实施例1中所述添加的DNA外均相同。在所述系统中由质粒DNA表达酶。乳糖酶表达在支点开关的控制下，并添加了触发物。其他两种酶由标准T7启动子表达。在减去背景信号后显示所有值，所述背景信号通过测量未添加任何DNA的对照反应确定。将无细胞反应物在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图5示出，滴定酶的DNA模板的量可控制由反应生成的葡萄糖的量。模板DNA的量减少导致更慢的葡萄糖产生。这可用于诊断系统中，以调整来自不同酶的输出，从而在用于多路复用的信号强度之间产生明显差异。在减去背景信号后显示值，所述背景信号在不存在DNA的情况下使用阴性对照确定。将样品在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图6示出底物浓度对葡萄糖产生的影响。在海藻糖酶存在下，不同水平的海藻糖底物产生不同浓度的葡萄糖。在减去背景信号后显示值，所述背景信号在不存在DNA的情况下使用阴性对照确定。将无细胞反应物在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图7示出在基于支点开关的RNA传感器的控制下，海藻糖酶的表达。这代表了模拟的诊断反应，其中触发RNA的存在诱导海藻糖酶的翻译和葡萄糖的伴随产生。海藻糖酶将每个海藻糖分子转化为两个葡萄糖分子。在减去背景信号后显示值，所述背景信号在不存在DNA的情况下使用阴性对照确定。将无细胞反应物在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图8示出在基于支点开关的RNA传感器的控制下，乳糖酶的表达。在此，在正确RNA触发序列的存在下诱导报告酶乳糖酶的翻译，从而产生葡萄糖。乳糖酶将每个糖乳糖分子转化为一个葡萄糖分子(加上一个半乳糖)。在此，可能由于这种酶的反应速率较慢，不可检测到渗漏。在减去背景信号后显示值，所述背景信号在不存在DNA的情况下使用阴性对照确定。将无细胞反应物在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图9示出用于检测患者样品中的目标分析物的方法的一个实施方案。任选地，在使用葡萄糖计检测葡萄糖之前，将葡萄糖计缓冲液(5x 0.1M NaCl、0.1M磷酸钠、0.05％tween-20，pH 7.3)添加至反应体积。
图10示出在单个反应体积中对于不同的目标分析物，使用两种不同的支点开关进行的多路复用。图10B示出来自类似实验的结果，以及使用两种不同的生成葡萄糖的酶进行的两种不同的靶RNA序列的多重检测。图10C示出使用相同酶的多重检测，其中已使用不同的支点开关(支点开关可具有不同的活性水平)和不同量的编码每个支点开关的DNA(即：存在的传感器的量)调整了报告基因活性。
图11示出合成生物电路的用途，所述合成生物电路产生葡萄糖来检测伤寒和副伤寒靶标。
图12示出用于诊断应用的示例性葡萄糖计介导的工作流程。
图13示出ReCap纸提取PCR和对照PCR反应的结果。
图14示出使用ReCap纸提取PCR进行的SYBR Green I测定的结果。
图15示出磁珠提取PCR的结果。
图16示出ReCap RNA提取、随后NASBA扩增的结果。
图17示出用于使用合成生物电路检测汞的示例性葡萄糖计介导的工作流程。
具体实施方式
本说明书提供用于检测无细胞系统中的目标分析物的合成生物电路。如实施例中所示，如所描述的合成生物电路的使用允许使用可容易获得的传感器和试剂如葡萄糖监测仪和试纸来检测目标分析物。使用本文所述的实施方案，可容易地生成不同的合成生物电路以允许检测不同的目标分析物。例如，可使用核糖调控因子如支点开关来检测靶RNA或DNA序列，以响应于靶标核酸序列来控制报告酶的表达。报告酶的表达改变底物的水平，然后在无细胞反应体积内检测底物。在一个优选的实施方案中，报告酶改变所述无细胞反应体积中的葡萄糖水平，从而能够使用葡萄糖监测仪和/或葡萄糖试纸检测目标分析物。
可在同一反应中使用不同的报告酶，以允许同时检测多种目标分析物。通过选择具有改变报告分子(如葡萄糖)水平的不同速率的报告酶以及为每种酶预先负载不同量的底物，多种目标分析物的存在或不存在将产生不同水平的报告分子。
如本文所用，“无细胞系统”是指在不存在细胞的情况下能够在体外提供或支持生物合成反应(例如，转录反应、翻译反应或两者)的一组试剂。例如，为了提供转录反应，无细胞系统包含含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。可使用从真核细胞或原核细胞(包括重组细胞)分离或纯化的酶、辅酶和其他亚细胞组分制备，或作为此类细胞的提取物或级分制备无细胞系统。无细胞系统可源自多种来源，包括但不限于真核细胞和原核细胞如细菌(包括但不限于大肠杆菌、嗜热细菌或嗜冷细菌等)、小麦胚芽、兔网织红细胞、小鼠L细胞、埃利希氏腹水癌细胞、HeLa细胞、CHO细胞和芽殖酵母等。在一个实施方案中，将细胞提取物纯化和/或处理以除去内源性葡萄糖和/或葡萄糖转化酶以获得无细胞系统。无细胞系统的实例还包括可从New England Biolabs Inc获得的系统。
如本文所用，术语“生物合成反应”是指引起一种或多种生物化合物(例如，DNA、RNA、蛋白质、单糖、多糖等)的合成的任何反应。例如，因为产生RNA，所以转录反应是生物合成反应。生物合成反应的其他实例包括但不限于翻译反应、偶联的转录和翻译反应、DNA合成、等温扩增反应和聚合酶链反应。
本文使用的术语“合成生物电路”是指其中生物组分被设计为执行逻辑功能的任何工程化的生物电路。通常，需要输入来激活合成生物电路，所述合成生物电路随后根据输入产生输出。在一些实施方案中，合成生物电路包含至少一种核酸材料或构建体。在其他实施方案中，合成生物电路基本上不含核酸。合成基因网络是一种合成生物电路。合成生物电路的其他实例包括但不限于工程化的信号传导途径，如经由激酶活性扩增输入的途径。在一个实施方案中，合成生物电路响应于目标分析物而改变无细胞反应体积中的报告分子的水平。在一个实施方案中，合成生物电路调控在无细胞反应体积中生成或消耗报告分子的酶的表达和/或活性。
“合成基因网络”或“合成基因电路”或“基因电路”在本文中可互换使用来指包含至少一种核酸材料或构建体并且能够执行包括但不限于感测、逻辑功能和/或调控功能的工程化的组合物。所述核酸材料或构建体可以是天然存在的或合成的。所述核酸材料或构建体可包括DNA、RNA或其人工核酸类似物。在包含至少两种核酸材料或构建体的合成基因网络的一些实施方案中，所述核酸材料或构建体可直接或间接地相互作用。间接相互作用是指相互作用中需要其他分子或其他分子在相互作用中起媒介作用。合成基因网络的一些实例包括可操作地连接至启动子的核酸。在一实施方案中，所述基因电路或基因网络包括核糖调控因子，如支点开关。
在一个方面，提供了一种用于响应于样品中的目标分析物生成报告分子的方法。优选地，所述报告分子是可使用容易获得的传感器如葡萄糖监测仪检测的分子，如葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括使所述样品与无细胞系统中的合成生物电路接触，其中所述目标分析物激活所述合成生物电路以改变无细胞系统反应体积内的报告分子水平。
在一个实施方案中，所述目标分析物激活所述合成生物电路以增加所述无细胞系统反应体积内的报告分子水平。在另一个实施方案中，所述目标分析物激活所述合成生物电路以降低所述无细胞系统反应体积内的报告分子水平。例如，所述目标分析物可激活所述合成生物电路以产生通过分解聚合糖来增加葡萄糖水平的酶。
本文所述的方法可用于检测多种不同的目标分析物。在一个实施方案中，所述目标分析物是无机分子，如金属。在另一个实施方案中，所述目标分析物是有机分子，任选地是生物分子。由各种无机或有机靶标激活的合成生物电路是本领域已知的，并且可容易地适用于本文所述的方法和试剂盒。例如，此类电路在Roelof Van der Meer和Belkin(NatRev Microbiol.,2010,Jull 8(7)511-522)；Zhou等人Chem.Rev.,2017,117(12),第8272–8325页；以及Wedekind等人(The Journal of Biological Chemistry 292,9441-94502017年6月9日)中进行了描述，所述文献全部特此以引用的方式并入。
在一个实施方案中，所述目标分析物是生物分子，如核酸(DNA或RNA)、蛋白质、脂质、代谢物或糖分子。所述核酸可以是与特定生物体和/或表型相关的核酸或变体。在一个实施方案中，所述目标分析物是与微生物病原体、任选地是病毒或细菌相关的核酸分子。本文所述的方法和试剂盒因此可用于检测特定微生物，任选地用于诊断目的。例如，在一个实施方案中，所述目标分析物是与微生物耐药性相关的核酸分子。在一个实施方案中，本文所述的方法和试剂盒可用于检测肠热症，如伤寒或副伤寒。例如，如实施例4和图11所示，被配置为激活用于葡萄糖生成的海藻糖酶的产生的支点开关能够检测来自伤寒、甲型副伤寒或乙型副伤寒的RNA靶标。
在一个实施方案中，所述样品来自受试者，并且所述目标分析物是与已知表型相关的生物标志物。例如，所述生物标志物可与疾病或对某些疗法或化学治疗药物的应答性相关。本文所述的方法和产品可用于在护理点生成患者的生物标志物数据，任选地使用诸如葡萄糖计的便宜便携式装置。
或者或另外，本文所述的合成生物电路可用于响应于金属(例如Ni、Co、Fe、Hg)、***物、除草剂(例如阿特拉津)、污染物和/或毒素而生成报告分子。然后可使用便宜的便携式装置如葡萄糖计来检测报告分子。图17示出用于使用具有Tn21启动子的基因电路检测汞的示例性工作流程，所述启动子在不存在汞的情况下被MerR阻遏因子结合并螯合。Tn21-MerR基因调控系统与海藻糖酶可操作地偶联以产生葡萄糖，然后可使用葡萄糖计检测所述葡萄糖。
在与合成生物电路接触之前或期间，可使样品经受各种处理。在一个实施方案中，所述处理增加所述样品中的目标分析物的浓度。或者或另外，可处理所述样品以除去一种或多种污染物或稀释所述样品以有助于目标分析物的检测。在一个实施方案中，所述目标分析物是核酸分子，并且所述方法包括扩增所述样品中的核酸分子。例如，在一个实施方案中，所述方法包括在与合成生物电路接触之前或期间，靶DNA分子或靶RNA分子的等温扩增。
在一个实施方案中，本文描述的方法和试剂盒包括用于在使用合成生物电路检测一种或多种目标分析物之前加工样品的步骤和/或试剂。在一个实施方案中，从所述样品提取核酸分子。各种核酸提取方法可与本文所述的实施方案组合使用。如实施例中所示，可使用诸如基于纤维素的纸的粘附基底来从样品，如裂解的细胞样品中捕获核酸。任选地，然后在洗涤步骤期间将核酸分子保留在基底上，同时除去所述样品中存在的污染物。
可使用本领域中已知的各种技术来扩增所述样品内的核酸分子。这些包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的扩增(LAMP)、Invader测定、滚环扩增(RCA)、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、切口核酸内切酶信号扩增(NESA)和切口核酸内切酶辅助的纳米粒子激活(NENNA)、核酸外切酶辅助的靶标再循环、连接或Y-探针、分离的DNAZyme和脱氧核酶扩增策略、导致扩增的信号的模板指导的化学反应、非共价DNA催化反应、杂交链反应(HCR)以及经由DNA探针的自组装以产生超分子结构进行检测。
在本公开的一个方面，构建了合成生物电路以响应于目标分析物的存在而改变报告分子如葡萄糖的水平。在一个实施方案中，所述合成生物电路调控在无细胞系统中改变报告分子的水平的酶的表达、水平和/或活性。任选地，所述合成生物电路可通过调控所述酶的转录或翻译或通过所述酶的翻译后调控，如通过使用小分子控制的内含肽来操作。
在一个实施方案中，所述合成生物电路是基因电路。在一个实施方案中，所述基因电路包括DNA分子，所述DNA分子包含可操作地连接至编码一种或多种酶的核酸的启动子，所述酶的表达改变所述无细胞系统中的报告分子如葡萄糖的水平。在一个实施方案中，所述基因电路调控编码一种或多种酶的DNA分子的转录或编码一种或多种酶的一种或多种mRNA分子的翻译。任选地，两个或更多个合成生物电路调控改变葡萄糖水平的两种或更多种酶的表达。在一个实施方案中，所述两种或更多种酶例如通过作用于不同的底物以不同的速率改变葡萄糖的水平。
在一个实施方案中，所述基因电路包含一种或多种转录激活因子或转录阻遏因子。在一个实施方案中，所述基因电路包含控制编码酶的mRNA分子的翻译的核糖调控因子。在一个实施方案中，所述核糖调控因子是支点开关。例如，在一个实施方案中，所述目标分析物是所述支点开关的触发物，以使得所述靶核酸分子与所述支点开关的结合允许所述基因电路中编码所述酶的mRNA的翻译。技术人员将能够容易地设计用于各种靶DNA或RNA分子的支点开关。
在一个实施方案中，所述无细胞系统包含一种或多种底物，所述一种或多种底物响应于生物电路的活性以改变报告分子的水平。例如，在一个实施方案中，所述无细胞系统包含葡萄糖或在合成生物电路的控制下由酶作用以生成葡萄糖的底物。
在一个实施方案中，所述底物包含含有一个或多个葡萄糖单体的寡糖或多糖。适用于本文所述的合成生物电路的酶和底物的示例性组合在图1B中示出。
本文所述的方法和产品可用于分析需要有关目标分析物存在或不存在的信息的任何样品。在一个实施方案中，所述样品是生物流体，任选地是血液、尿液、脑脊髓液或唾液。在一个实施方案中，所述样品是患者样品，如组织样品。在另一个实施方案中，所述样品是环境样品，任选地是水样品。在一些实施方案中，所述样品是食物样品。
在一些实施方案中，所述方法包括使所述样品与所述无细胞系统中的合成生物电路接触。在一个实施方案中，处理所述样品包括用缓冲液/稀释剂和/或无核酸酶的水稀释所述样品。在一个实施方案中，对所述样品进行处理以使所述样品中的葡萄糖浓度标准化或降低。还可对所述样品进行处理，以除去污染物或降低污染物的水平，所述污染物干扰无细胞系统和/或报告分子的检测。在一个实施方案中，对所述样品进行处理以增加目标分析物的相对浓度。或者或另外，可使样品经受热处理，如通过加热、冷却和/或冷冻所述样品。在一个实施方案中，加热样品以溶解所述样品中所含的细胞和/或使可能干扰无细胞系统和/或合成生物电路的操作内源性蛋白质(如天然存在的酶)变性。
在一个实施方案中，可在使样品与合成生物电路接触之前对所述样品进行处理以使所述样品中的报告分子(如葡萄糖)的水平标准化和/或降低。在一个实施方案中，处理所述样品有助于控制样品来源的影响，所述样品来源可能潜在包括报告分子(如葡萄糖或天然血糖)或可能使目标分析物的检测失真的酶。
在一个实施方案中，用稀释剂或缓冲液稀释样品以降低所述样品中报告分子的水平。在一个实施方案中，所述稀释剂或缓冲液包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂是Tween-20。在一个实施方案中，稀释所述样品可使甚至高糖尿病葡萄糖水平降至本文所述的方法的阈值以下。例如，正常葡萄糖水平是7.8-16.7mM，但在极度高血糖症中偶尔可暂时超过28mM。将样品稀释例如10倍将使葡萄糖水平达到0.8mM与2.8mM之间，这在一些实施方案中不会预期损害本文所述的方法的使用。
在一些实施方案中，可使样品经受另外的处理步骤以减少、除去、螯合葡萄糖和/或使葡萄糖水平标准化。例如，结合葡萄糖的凝集素可用于螯合来自所述样品的葡萄糖和/或血糖。在一个实施方案中，可通过添加将葡萄糖转化为惰性物质的酶(例如葡萄糖脱氢酶)从样品中除去葡萄糖。此过程将受到供应并定制为中和进入葡萄糖的辅因子(例如NAD)的量的限制。
在一个实施方案中，所述方法包括用预定量的GDH和/或NAD处理样品以从所述样品中除去预定量的葡萄糖，如在特定样品类型中发现的平均量的葡萄糖。
在一个实施方案中，所述无细胞系统包含如本文所述的合成生物电路、用于转录和翻译的酶、核糖体、dNTP、tRNA和氨基酸。任选地，所述无细胞系统还包含RNA酶抑制剂、缓冲液、一种或多种辅因子、冷冻保护剂和表面活性剂(任选地Tween-20)中的一者或多者。在一个实施方案中，所述无细胞系统还包含酶的底物，所述酶的表达和/或活性由所述合成生物电路调控。例如，在一个实施方案中，所述无细胞系统包含预定量的图1B所示的葡萄糖或底物。在一个实施方案中，所述底物是由酶作用以生成葡萄糖，如包含一个或多个葡萄糖单体的低聚糖或多糖的底物。
所述无细胞系统的组分可在如本文所述的方法之前或作为本文所述的方法的一部分进行冷冻干燥并再水合。例如，在一个实施方案中，将所述无细胞系统冷冻干燥并通过与样品、缓冲液和/或稀释剂接触而再水合。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括检测报告分子如葡萄糖，所述报告分子的水平通过合成生物电路改变。在一个实施方案中，检测报告分子的存在或不存在指示样品中目标分析物的存在或不存在。在一个实施方案中，所述方法包括检测无细胞反应体积中的葡萄糖水平。
在一个实施方案中，所述无细胞反应体积中的葡萄糖水平指示所述样品中目标分析物的水平。在一个实施方案中，所述无细胞反应体积中的葡萄糖水平指示在多重反应中检测到的多个靶分子的存在或不存在。在一个实施方案中，在多个时间点确定所述无细胞反应体积中的葡萄糖水平。
尽管葡萄糖计能够检测广泛范围的葡萄糖水平，但葡萄糖计常规上仅用于生成单个读数(以mg/dL计的葡萄糖)。本文所述的方法和试剂盒利用葡萄糖计的宽动态范围来创建用于多路复用输出的带宽。这可通过选择具有不同动力学的酶并控制底物浓度来完成。通过为每个合成生物电路设计不重叠的葡萄糖产量，在单个读出数字的情况下多重诊断是可能的。在一个实施方案中，多路复用系统中的每个传感器产生独特的报告酶，所述报告酶将低聚葡萄糖底物转化为可通过葡萄糖计检测到的单体葡萄糖。通过选择具有不同动力学的酶并调整底物、模板DNA的浓度和其他分子/生物化学参数，可控制所得的葡萄糖产生。在一个实施方案中，传感器输出被设计为非重叠，以使得加成性葡萄糖产生可容易地用于确定哪个传感器被激活。
在一个实施方案中，在检测无细胞反应体积中的葡萄糖之前，使样品与无细胞系统中的合成生物电路接触或孵育预定量的时间。在一个实施方案中，使样品与无细胞系统中的合成生物电路接触或孵育至少5、10、15、20、25、30、35、40或45分钟。在一个实施方案中，使样品与无细胞系统中的合成生物电路接触或孵育30-180分钟、任选地介于30与90分钟之间或介于60与90分钟之间的时间段。
在一个实施方案中，所述方法包括在检测葡萄糖之前将缓冲液添加至所述无细胞系统。在一个实施方案中，所述缓冲液是包含0.1M NaCl、0.1M磷酸钠、0.05％Tween-20的组合物，并且具有约7.3的pH值。在一个实施方案中，所述缓冲液包含Tween-20、任选约0.0125％Tween-20或介于0.01％与0.02％之间的Tween-20或由其组成。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括使用葡萄糖计，任选地使用葡萄糖试纸来检测葡萄糖水平。在一个实施方案中，所述方法包括使所述无细胞反应体积或其一部分与葡萄糖试纸接触。
如实施例3所示，使用多于一个如本文所述的合成生物电路可用于在单个反应体积中检测多种目标分析物。在一个实施方案中，所述方法包括使所述样品与无细胞系统中的多个合成生物电路接触，其中不同的目标分析物激活每个合成生物电路以改变无细胞反应体积内的报告分子水平。在一个实施方案中，所述多个合成生物电路中的每一个使用不同的底物和酶来生成葡萄糖。在一个实施方案中，由所述无细胞系统中的多个合成生物电路生成的报告分子的速率和/或水平的差异允许在单一反应中多种不同的目标分析物的多重检测。
如图10A和10B所示，本文所述的方法和试剂盒可用于使用两种不同的酶进行多路复用，例如以不同的速率产生葡萄糖，或者如图10C所示，使用单一酶，其中每个靶标激活单一酶的产生，但速率不同。
任选地，本文所述的方法包括将在无细胞系统反应体积中检测到的葡萄糖水平与一种或多种对照水平进行比较。在一个实施方案中，所述对照水平指示在相似条件下测试的对照样品中目标分析物的预定水平。在一个实施方案中，所述方法包括将在所述无细胞系统反应体积中检测到的葡萄糖水平与一种或多种对照水平进行比较，其中每种对照水平指示所述样品中一种或多种目标分析物的存在或不存在。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括将指示所述样品中的一种或多种目标分析物的存在或不存在的数据呈现给用户。例如，数据可指示所述样品中的一种或多种目标分析物的水平。在一个实施方案中，数据可指示与样品中的目标分析物的存在相关的表型或其他条件。
在本说明书的另一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括包含合成生物电路的无细胞系统，所述合成生物电路响应于样品中的目标分析物而生成或消耗报告分子。在一个实施方案中，所述报告分子是葡萄糖。在另一个实施方案中，所述报告分子是酮。在一个实施方案中，所述试剂盒包括试剂，如但不限于所述无细胞系统中的那些或用于增加目标分析物的浓度的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于执行如本文所述的方法的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于接收所述样品并使所述样品与所述无细胞系统接触的容器。在一个实施方案中，所述容器包括盖和贮器。任选地，所述容器适于接收葡萄糖试纸，以使得所述容器内的无细胞反应体积与所述葡萄糖试纸接触。在一个实施方案中，所述容器包括含有所述无细胞系统的腔室。例如，在一个实施方案中，所述腔室位于盖中。任选地，可将无细胞系统冷冻干燥并定位在所述容器内。在一个实施方案中，所述无细胞系统与诸如纸或另一种种惰性材料的基底缔合。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括在如本文所述的工作流程中有用的多个容器。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器适合于接收样品并将核酸提取到粘附基底上。在一个实施方案中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器适合于洗涤粘附的基底以除去杂质。在一个实施方案中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器适合于洗脱捕获在所述基底上的核酸分子，并任选地用于在使样品与合成生物电路接触之前扩增所述样品中的核酸分子。在一个实施方案中，将粘附基底固定至被配置为配合三个容器中的一个或多个的盖或帽上。这有助于含有目标分析物的样品在不同容器之间的转移以用于在与合成生物电路接触之前加工和/或扩增样品。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于提取和/或洗涤来自样品的目标分析物的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括适合于溶解细胞以提取核酸的提取缓冲液。在一个实施方案中，所述试剂盒包括适合于从核酸分子的样品中除去杂质的洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，所述目标分析物是核酸分子，并且所述试剂盒包括用于增加所述核酸分子的浓度的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于所述核酸分子的等温扩增的试剂。任选地，用于增加目标分析物的浓度的试剂与所述容器内的无细胞系统合并，或者在所述容器内或容器外单独提供。
在一个实施方案中，所述合成生物电路是基因电路。例如，在一个实施方案中，所述基因电路包含DNA分子，所述DNA分子包含可操作地连接至编码一种或多种酶的核酸的启动子，所述酶的表达生成或消耗所述无细胞系统中的报告分子。在一个实施方案中，所述基因电路包含控制编码酶的mRNA的翻译的核糖调控因子，所述酶的表达生成或消耗所述无细胞系统中的报告分子。在一个实施方案中，所述核糖调控因子是支点开关。在一个实施方案中，所述报告分子是葡萄糖。
在一个实施方案中，所述试剂盒中的无细胞系统包含葡萄糖或由酶作用以生成葡萄糖的底物。例如，在一个实施方案中，所述无细胞系统包含预定量的图1B所示的葡萄糖或底物。在一个实施方案中，所述底物是由酶作用以生成葡萄糖，如包含一个或多个葡萄糖单体的低聚糖或多糖的底物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于在使所述样品与所述无细胞系统接触之前处理所述样品的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于处理所述样品以除去和/或螯合来自所述样品的内源性葡萄糖和/或血糖的试剂。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括葡萄糖脱氢酶(GDH)和NAD，任选地预定量的GDH和/或NAD。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于螯合所述样品中的葡萄糖和/或血糖的凝集素。在一个实施方案中，所述用于处理样品以除去和/或螯合内源性葡萄糖和/或血糖的试剂被提供在与所述无细胞系统分开的试剂盒中。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括稀释剂或缓冲液。在一个实施方案中，所述稀释剂或缓冲液可用于稀释样品和/或使无细胞系统再水合。在一个实施方案中，所述稀释剂或缓冲液包含无核酸酶的水和/或表面活性剂，任选地Tween-20。在一个实施方案中，所述稀释剂或缓冲被提供在与所述无细胞系统分开的容器内。在使用中，可使样品和稀释剂或缓冲液与无细胞系统接触以响应于靶分子而激活合成生物电路。
在一个实施方案中，所述无细胞系统包含如本文所述的合成生物电路、用于转录和翻译的酶、核糖体、dNTP、tRNA和氨基酸。任选地，所述无细胞系统还包含RNA酶抑制剂、缓冲液、一种或多种辅因子、冷冻保护剂和/或表面活性剂，任选地Tween-20。在一个实施方案中，所述无细胞系统还包含酶的底物，所述酶的表达和/或活性由所述合成生物电路调控；如图1B中所示的底物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括由不同的目标分析物激活的多个不同的合成生物电路。例如，可提供单独或组合的不同试剂盒，用于检测不同的目标分析物或目标分析物的组合。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括适合于检测无细胞反应体积内的报告分子的装置和/或试剂。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括葡萄糖计和任选地一种或多种葡萄糖试纸。
实施例1：合成生物电路在无细胞系统中响应于目标分析物而产生葡萄糖的用途。
进行了一系列实验，以证明合成生物电路在无细胞反应中响应于目标分析物而生成葡萄糖的用途。对于所有实验，使用可商购的葡萄糖计和相关的是指(Bayer Contour血糖监测系统)检测葡萄糖。
样品内的内源性水平的葡萄糖可潜在干扰葡萄糖作为报告分子的用途，特别是对于生物样品的分析而言。如图3所示，有可能使用葡萄糖脱氢酶(GDH)并在辅因子NAD中进行滴定来实现样品内的葡萄糖的受控减少。因此，在使用无细胞系统进行分析之前，GDH和NAD可用于处理样品以使葡萄糖水平降低或标准化。
接下来，使用可从New England Biolabs(NEB)商购的
支点开关G由下文的RNA触发序列G(SEQ ID NO:2)激活：
如图4-6所示，通过使用不同的报告酶作为来自合成生物电路的输出，可生成不同浓度的葡萄糖。这种特征可用于区分单个反应体积中的不同合成生物电路(感测不同分析物)的活性和葡萄糖测量值(图4)。类似地，可控制DNA模板和酶底物的浓度，以调整来自报告酶的葡萄糖产量(图5和6)。此外，如图7所示，使用无细胞系统和支点开关G的模拟诊断引起响应于目标分析物(RNA触发序列G)产生葡萄糖，使用便携式血糖仪容易地检测到所述葡萄糖。
实施例2：使用支点开关来调控无细胞系统中的乳糖酶表达
如表1所示，使用支点开关来控制乳糖酶表达后，在反应模板后组装了一系列无细胞反应。
具有β-半乳糖苷(LacZ)报告酶的支点开关
·酶底物乳糖
＊反应体积(uL)
主混合物组装
处理
试剂
NEB A(0.4)
NE8B(0.3)
(0.005)
乳糖(mM)
Tween-20(1％)
储备液浓度
2.50
3.33
200.00
1460.00
1.00
最终浓度
总体积的40％
总体积的30％
20mM
0.0125
阴性对照-仅无细胞
NEB
3.20
2.40
0.04
0.11
0.10
阳性对照-葡萄糖掺入
葡萄糖
3.20
2.40
0.04
0.11
0.10
仅支点开关
LacZSwE
3.20
2.40
0.04
0.11
0.10
支点开关+触发RNA
LacZSwE+Trig
3.20
2.40
0.04
0.11
0.10
主混合物
14.1
10.6
0.18
0.48
0.44
单独反应的组装.
处理
主混合物
葡萄糖(mM)
LacZ开关
LacZ触发物
ddH2O
总体积
200.00
97.00
257.00
10mM
10ng/uL
15ng/uL
阴性对照-仅无细胞
5.85
0.00
0.00
0.00
2.15
8.00
阳性对照-葡萄糖掺入
5.85
0.40
0.00
0.00
1.75
8.00
仅支点开关
5.85
0.00
0.82
0.00
1.33
8.00
支点开关+触发RNA
5.85
0.000
0.82
0.62
0.70
8.00
总计
23.40
0.40
1.65
0.62
5.93
32.00
表1：在支点开关的控制下，使用乳糖酶(也称为β-半乳糖苷酶或LacZ)的无细胞系统的主混合物和单独反应的组装。体积以微升为单位。
用T7启动子(斜体)生成了重组构建体“支点开关E”，并且将支点开关E(带下划线)可操作地连接至编码乳糖酶报告酶的DNA(SEQ ID NO：3)：
支点开关E由下文的RNA触发序列E(SEQ ID NO:4)激活：
GGGACAGAUCCACUGAGGCGUGGAUCUGUGAACACUAAACUAAACGACAAUGUAAUCAAACUAAC(SEQID NO:4)
如图8所示，使用无细胞系统和支点开关E的模拟诊断反应引起响应于目标分析物(RNA触发序列E)产生葡萄糖，使用便携式血糖仪容易地检测到所述葡萄糖。
实施例3：在单个反应体积中目标分析物的多重检测
组装含有两种不同的支点开关的常见反应混合物，并等分成复制品。然后将第一组一式三份反应在没有触发物的情况下孵育，并用于针对背景信号标准化数据。如图10A所示，下一组一式三份反应接收了触发E RNA，并产生了葡萄糖的少量、但显著的增加。第三组一式三份反应接收了触发G RNA而产生更大且不同量的葡萄糖。
因此，可使用具有两个不同基因电路的单个反应来区分多于一种目标分析物。这展示模拟诊断应用，其中使用具有葡萄糖输出的单个反应来区分多于一种病原体/分析物，所述葡萄糖输出取决于存在的RNA输入。
图10B示出来自类似实验的结果，进行所述实验以使用两种不同的生成葡萄糖的酶表征两种不同的靶RNA序列的多重检测。每个靶标激活不同酶的产生，并且每种酶生成不同量的葡萄糖。靶标A触发乳糖酶的产生，而靶标B触发海藻糖酶的产生。所有反应中都存在所有支点开关，唯一的不同是添加了靶标。在减去背景信号后显示图10B中的值，所述背景信号通过测量未添加任何DNA的对照反应确定。将样品在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
图10C示出使用单一酶(海藻糖酶)在多重反应中检测两种不同靶标而不是每种靶标使用不同酶生成的结果。每种靶标激活同一酶的产生，但是由于支点开关的动力学差异而以不同的速率激活。这导致取决于存在的一种或多种靶标，葡萄糖产生的速率不同，包括当两者存在时的较强信号。所有反应中都存在所有支点开关，唯一的不同是添加了一种或多种靶标。在减去背景信号后显示值，所述背景信号通过测量不存在任何靶标的对照反应确定。将样品在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。如图10C所示，容易地区分含有靶标A、靶标B或靶标A+B的样品。
实施例4：合成生物电路用于检测伤寒和副伤寒靶标的用途。
支点开关被设计用于分别检测来自伤寒、甲型副伤寒和乙型副伤寒的RNA序列。所有支点开关都被配置为激活海藻糖酶的产生以生成葡萄糖。图11示出在优化开关DNA浓度和底物以增强和区分所生成的信号之前的初步数据，但是在所有三种情况下都可观察到明显的增加。图11中呈现的数据不是多重实验，因为每个反应中仅存在一个支点开关。在减去背景信号后显示值，所述背景信号通过测量不存在任何靶标的对照反应确定。将样品在37℃下孵育1小时。使用血糖仪测量葡萄糖浓度。
实施例5：葡萄糖计介导的诊断工作流程
图12示出示例性(但不限于)葡萄糖计介导的诊断工作流程。所提出的工作流程的一般过程遵循6个步骤；步骤1-样品收集，步骤–2RNA提取，步骤3-等温扩增，步骤4-在存在靶RNA的情况下产生葡萄糖的与靶标特异性传感器结合的无细胞反应，步骤5-在葡萄糖计上进行样品分析，以及步骤6-在定制软件上解释结果。本文所述的方法的优选实施方案可包括图12所示的步骤中的一个或多个，其任选的细节在下文列出。
步骤1：样品收集
所述样品可以是患者血液样品或其他生物样品。
步骤2：RNA提取
可使用各种RNA提取方法，如a)基于纸的提取或b)磁珠提取。
对于基于纸的提取，使用胶水或蜡将纸或膜附着至试管帽的内部。将溶解缓冲液添加至样品中至1x的最终浓度。将管倒置，并将帽与提取物一起孵育1分钟，然后将帽转移至具有洗涤缓冲液的另一个管，并连续倒置1分钟。最后，将帽转移至另一个含有等温反应混合物的管。将管倒置，并与混合物一起孵育另一分钟以洗脱RNA。
对于磁珠提取，类似于基于纸的提取方法，将溶解缓冲液添加至样品中至1x的最终浓度。然后将含有磁珠的溶液添加至样品中，并混合直至均匀。将使用磁铁将磁珠和与所述磁珠结合的核酸收集至管的侧面，并除去溶解废物。随后的洗涤步骤将类似地进行；将洗涤缓冲液添加至管中，振荡所述管以使混合物均匀，并使用磁铁将磁珠再次收集至管的侧面。在最终步骤，将RNA从珠粒洗脱到水中或直接洗脱到等温扩增反应混合物中。
步骤3)等温扩增反应
如果意图检测的靶标被发现在初始样品中处于低浓度，则可能有必要将靶RNA扩增至与传感器兼容的水平。这将使用等温或接近等温的扩增方法(如NASBA)来完成。反应孵育可在智能手机控制的孵育器中进行。
步骤4)无细胞反应
然后可将扩增的RNA直接添加至无细胞反应物中，所述无细胞反应物将含有被设计为仅在识别靶RNA时表达显著水平的海藻糖酶的传感器。海藻糖酶然后将催化海藻糖(在反应中提供)分解成葡萄糖单体。反应孵育可在智能手机控制的孵育器中进行。
步骤5)葡萄糖计
然后可在葡萄糖试纸上测试无细胞反应物，预期阳性样品将产生可通过葡萄糖计读取的葡萄糖水平的显著增加。
步骤6)分析结果
可使用智能手机app来解释葡萄糖计数据(并任选地将数据转发给家庭医生或公共健康监测程序，+/-匿名)。这是任选地与控制步骤3)和4)中使用的孵育箱相同的app。
实施例7：使用再循环帽纸提取(ReCap)或磁珠的核酸提取。
进行实验以研究使用纸或膜从样品中捕获核酸。Zou等人(2017)(特此以引用的方式并入)先前描述了纤维素纸用于核酸纯化的用途。
将纸粘附至管的帽，并在初始裂解阶段捕获核酸。然后将具有捕获的核酸的帽转移至洗涤管，所述洗涤管除去下游反应的任何潜在抑制剂，其包括来自血液样品的任何残留葡萄糖。最后阶段涉及将核酸洗脱到扩增反应中。
还进行实验以研究使用磁性提取从样品中捕获核酸。
方法和试剂
在溶解步骤期间使用最终浓度为1x的缓冲液。4x缓冲液允许在溶解步骤添加更多样品。
表2：用于ReCap和用于磁珠提取的缓冲液：A)和B)列出用于溶解的提取缓冲液#3的不同组成。C)列出洗涤缓冲液的组成。注意，这些缓冲液用于ReCap提取和基于磁珠的提取。对于RNA提取，将缓冲液修改为含有0.5％v/v的鼠RNA酶抑制剂(NEB)。
ReCap制作
代替使用纸作为松散的纸盘或检棒(dipstick)，使用将纸粘附至管帽内侧的管。使用Whatman滤纸和聚醚砜(PES)膜对这种方法进行了测试，使用热胶和石蜡两者来粘附纸/膜。在理论上，这种方法可用于任何类型和体积的带帽的管(50mL、15mL、2mL、1.5mL、条带PCR管等)。
使用以下方案步骤：
1.设置溶解、洗涤和洗脱管。如果缓冲液含有RNA酶I抑制剂，则将管放在冰上。
a.将溶解管置于ReCap管中，添加适当浓度的提取缓冲液，以使得添加样品后提取缓冲液的最终浓度将是1x。
b.在洗涤管中，添加200μL洗涤缓冲液
c.在洗脱管中，设置扩增反应混合物(例如–PCR反应或NASBA扩增反应)。此管应保持在冰上。
2.溶解：
a.在ReCap管中，将待用提取缓冲液提取的样品合并至1x的最终浓度。
b.通过将管倒置1分钟进行混合。
c.通过轻轻敲打柜台上的管来收集可能仍粘附至盖的任何液体。
3.洗涤
a.将ReCap盖转移至洗涤管
b.通过将管倒置1分钟进行混合。
c.通过轻轻敲打柜台上的管来收集可能仍粘附至盖的任何液体。
4.洗脱
a.将ReCap盖转移至洗脱管
b.通过将管倒置1分钟进行混合。
c.通过轻轻敲打柜台上的管来收集可能仍粘附至盖的任何液体。
d.移除ReCap盖，以使用传统盖。这是重要的，因为需要大量加热的任何反应都可能使ReCap中使用的粘合剂融化。
5.扩增
a.PCR：以标准PCR方案运行反应。例如，使用如表3所列的NEB Q5聚合酶方案测定ReCap。
b.等温反应：使用如表4所列的NASBA反应测定ReCap。
表3：PCR扩增方案。
表4：等温NASBA方案。
NASBA反应在62℃下运行2分钟，此时添加了酶混合物，并且反应在41℃下运行1小时。
ReCap提取和扩增
将mRFP1质粒DNA模板的10^0至10^10个拷贝掺入提取缓冲液中，与纸结合，洗涤，且然后洗脱到50μL PCR反应物中。在PCR+对照中，DNA模板的10^0至10^10个拷贝直接添加至Q5聚合酶PCR反应中。5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行。如图13所示，ReCap方法能够捕获低至PCR灵敏度极限(10^7个DNA拷贝)的核酸。
将SYBR Green I染料添加至如图13所示的相同反应物中，并使用标准板读数器与mRFP1的0-10^10个拷贝测量终点荧光。结果在图14中示出。由于SYBR Green I是dsDNA的荧光嵌入染料，因此可使用相对荧光单位(RFU)来比较来自不同扩增反应的dsDNA的产量。
磁珠提取和扩增
作为ReCap提取的替代方案，使用基于磁珠的提取方法与来自Genesig Easy DNA/RNA提取试剂盒的(管3)磁珠以及来自ReCap纸提取方法的缓冲液(表2中列出)进行了实验。使用以下方案步骤：
1.溶解
a.添加样品和提取缓冲液至1x的最终浓度。添加如在试剂盒中提供的等体积的管3(含磁珠的溶液)。
b.振荡管并等待15分钟
c.磁化并移除所有液体
2.洗涤
a.添加200μL洗涤缓冲液。
b.振荡管并等待30秒
c.磁化并移除所有液体。
3.洗脱
a.在适当体积的水或扩增混合物中洗脱。
与针对ReCap进行的实验类似，将mRFP1质粒的10^0-10^10个拷贝添加至50μL提取缓冲液，与磁珠结合，洗涤并洗脱到Q5聚合酶PCR缓冲液中。在1％琼脂糖凝胶上运行反应产物。如图15所示，观察到在PCR检测范围(10^7-10^10)内使用磁珠的成功提取。
等温扩增和无细胞反应
在使用合成电路进行检测之前用于扩增核酸的扩增方法优选地是等温或接近等温的(即NASBA)。使用Zika传感器进行实验(参见Pardee等人2016，特此以引用的方式并入)，以研究ReCap纸提取与NASBA的用途。
将Zika病毒触发物3RNA的10^10个拷贝掺入50μL提取缓冲液中，与纸结合，洗涤，且洗脱到25μL NASBA反应物中。然后以与含Zika支点传感器的1.8μL无细胞反应物1:7的比例添加NASBA反应物，所述无细胞反应物仅在识别Zika RNA触发物时才产生LacZ酶。所产生LacZ酶然后裂解底物(CPRG)以产生氯酚红，其可在570nM处检测到。
如图16所示，ReCap提取与NASBA扩增和无细胞支点感测相容。
实施例8：使用合成生物电路对汞进行环境感测
使用合成生物电路的葡萄糖计介导的感测也可用于检测环境分析物，如金属。具体地说，传感器和方法可用于环境监测和修复，以及用于检测/勘探有价值的金属，如贵重或稀土元素。
感测环境汞的当前方法依赖于昂贵的设备，如原子吸收(AA)光谱、高压液相色谱(HPLC)和质谱MS，以确定水、组织和土壤样品中存在的汞污染水平。
为了检测汞，样品可包括水、组织和土壤样品。提取方法取决于样品的类型。例如，对于基于土壤的提取，离心和过滤方法的组合是常用的(参见例如，Reis等人2014)。为了从组织样品中提取汞，可将样品冻干并微波处理(参见例如，Hinojosa Reyes等人2009)。
为了从水中提取汞，最通常使样品经受凝聚/过滤方法。
如图17所示，可使用基于基因电路的传感器测试所提取的样品，所述基于基因电路的传感器响应于汞的存在而产生绿色荧光或海藻糖酶。
汞传感器是使用Tn21启动子设计的，所述启动子在没有汞的情况下被MerR阻遏因子结合并螯合。一旦存在汞，阻遏因子就将解除结合并暴露Tn21启动子，从而允许通过大肠杆菌RNA聚合酶(RNAP)转录下游基因。在将Tn21-MerR基因调控系统与海藻糖酶偶联以用于葡萄糖计之前，使用deGFP荧光报告基因测试传感器设计。在汞存在下，海藻糖酶催化海藻糖分解为葡萄糖单体。用葡萄糖计在葡萄糖试纸上测量所产生的葡萄糖水平。任选地，智能手机app帮助解释来自葡萄糖计的结果且帮助数据分析。
所有公布、生物序列或序列标识符、专利和专利申请都以引用的方式整体并入本文，其程度就如同特定地和个别地指示将每一个别公布、生物序列、专利或专利申请以引用的方式整体并入本文一般。
参考文献
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<210> 1
<211> 1730
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 1
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agaggagata tagaatgaga caatggaacc tggcggcagc gcaaaagatg cgtaaagatt 120
ataaagatga tgatgataaa ggacatcatc atcatcatca cagcagcggc gagaacctgt 180
acttccaatc ctctggaggt gggggttctg gaacagcggt acggatagat tatgcaagcg 240
ggttaactga tcgcgaaaac tctatgttca aagaaatcca gttgtcaggc gtttttgccg 300
attcaaaaac ctttgtggat agccatccca aattgcccct ggcggaaatc gccgagcttt 360
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agctgccgcc gagcattgcc tccggttttg tcagcgatac ctcgcgcccg gtggaaaagc 480
atatcgacat tctctgggat gtgctcaccc gccaaccgga caggcaggag gcgggaaccc 540
tgctgccctt accttacccc tatgtcgttc ccggcggccg cttccgcgaa atttactact 600
gggacagcta tttcaccatg ctcggtttgc aggcatcgaa gcgctgggat ctgatggagg 660
gtatggtgaa taatttttca cacctgatcg acaccatcgg ctttattccc aacggcaatc 720
gcacctatta cgagggccgc tcccagccgc ctttttacgc cctgatggtg gagttgctgg 780
ccaataaaca gggtgagtcg gtgctgctcg cgcatttgcc gcatttgcgc agggaatatg 840
aattctggat ggagggcgcc gctaaacttt cgcccgctgc acccgcgcat cgccgtgtgg 900
tgctgctgcc ggatggcagc atactcaatc gctactggga tgatatagcc gcgccgcgcc 960
cggaatcctt ccgcgaagac tacgaactgg cggaagccat cggcggcaac aagcgcgagc 1020
tgtaccgcca tattcgcgcg gcggcagaat ccggctggga cttcagcagc cgctggttca 1080
aagatggcaa tggcatggcc agcatccaca ccaccgatat tatcccggtg gatttgaatg 1140
cgctggtctt taacctggag cggatgctgg cccatattta tggcttgcag ggcgaccagg 1200
atcaggccac gcattactac caattggcgg agcagcgcaa acaggcgttg ctgcgctact 1260
gttggaatgc gcagcaggga tttttccacg attacgatta tgtcgccgca caacagacgc 1320
cggtcatgtc gctggcggcg gtttacccgc tttatttcag tatggtcgac cagcgcacgg 1380
gcgaccgggt cgccgaacag atagaggcgc attttatcca ggcgggcggt gtgaccacga 1440
ccctggcgac cacaggccag cagtgggacg cgcccaatgg ctgggcgccg ctgcaatggc 1500
tgaccatcca gggcctgcgc aattatcacc acaattcagc ggcggagcag atcaaacagc 1560
gctggattgc actcaaccag cgcgtttacc gcaacaccgg aaagttggtg gaaaaataca 1620
acgtctatga cctggatgtg gccggcggcg gtggcgaata tgaattacag gatggcttcg 1680
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<210> 2
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<212> RNA
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cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagt ggcgcggcga cttccagttc aacatcagcc 3000
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<210> 4
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 4
gggacagauc cacugaggcg uggaucugug aacacuaaac uaaacgacaa uguaaucaaa 60
cuaac 65
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