邻近检测方法和组合物
阅读说明：本技术 邻近检测方法和组合物 (Proximity detection methods and compositions ) 是由 S·K·萨卡 J·Y·凯施 尹鹏 于 2019-01-25 设计创作，主要内容包括：在一些实施方案中,本文提供了用于分子靶标邻近检测的组合物和方法。(In some embodiments, provided herein are compositions and methods for the proximity detection of molecular targets.)
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2018年1月26日提交的美国临时申请号62/622731和2018年1月26日提交的美国临时申请号62/622738的权益，其中每一项均通过引用整体并入本文。
联邦政府资助的研究
本发明是在海军研究办公室授予的基金号N00014-16-1-2410和国家科学基金会授予的基金号2014188919下由政府支持完成的。政府在本发明中拥有某些权利。
背景技术
低信号和高背景是妨碍分子检测系统灵敏度和准确性的重要限制。本文提供了一种被称为“邻近度引物交换反应(ProPER)”的技术，该技术能用于在靶标检测中实现高灵敏度和准确性。通过依靠将多条链成功地靶向至单个目标靶标，可以显著降低检测背景。由ProPER产生的长串联体能用作荧光分子的支架，使ProPER能够用作信号放大形式。这允许潜在地将数十个(或更多)可检测实体(例如，荧光团)聚集到单个靶标生物分子上，例如产生随后能够在显微镜或荧光扫描仪上直接可视化的信号。
本文进一步提供了一种被称为“共拉链引物交换反应”(Co-Zipper)的技术，该技术依赖于两个结构域的协同结合与单个结构域之间的区别。这使得结合两条重合的串联体(两条核酸链)的荧光团标记的成像链能够以高特异性将许多荧光团聚集到靶分子或区域。通过依靠串联体的邻近度实现低背景-两个离散的串联体脱靶结合的概率极低。这种高特异性与通过将成像剂重复结合到串联体而实现的线性扩增的组合使得Co-Zipper能够例如应用于高度特异和高度灵敏的生物标志物检测(例如诊断)和成像。
本文提供了基于邻近度的方法和组合物，其使得能够对分子靶标和分子靶标相互作用进行高度特异(例如高分辨率、低背景)的检测。本公开内容的方法依赖于彼此紧密邻近(例如，彼此在100纳米(nm)内、在75nm内、在50nm内、在25nm内、在10nm内、或在5nm内)的核酸分子(在某些情况下，串联体分子)的重合检测。在一些实施方案中，本文提供的方法建立在被称为引物交换反应(PER)的催化反应上。引物交换反应依赖于催化发夹，其用于附加引物序列以通过串联重复所需序列结构域来创建串联体。参见，例如2017年8月24日公开的国际公开号WO 2017/143006，其通过引用整体并入本文。应当理解，可以使用引物交换反应来产生任何包含串联重复序列的链(例如，串联体链和/或串联体形成链)。此外，在一些实施方案中，使用滚环扩增反应或任何其他原位或体外核酸合成方法产生任何包含串联重复序列的链可能是有利的。
在一些方面，本公开内容提供了在本文中被称为“邻近度引物交换反应”或“ProPER”的方法(和相关的组合物)，其通过依赖于固定的引物链和固定的发夹链(在本文中分别被称为串联体形成链和催化链)的空间邻近度来推进PER串联反应。ProPER系统被设计为使得可检测信号取决于局部串联体的形成，该局部串联体仅在所述串联体形成链和所述催化链共定位(这表明与链连接的基底的共定位)时才产生。例如，图4描绘了与催化链(右)紧密邻近的串联体形成链(左)，导致附加到串联体形成链上的结构域“a”的串联重复序列。在包含互补结构域“a*”的重复序列的经标记的“成像”链的杂交和可视化后，能检测该串联体形成链的存在。
在其他方面，本公开内容提供了在本文中被称为“共拉链反应”或“Co-Zipper”的方法(和相关的组合物)，其被设计为使得可检测信号取决于两个不同的串联体链的共定位，这表明与链连接的基底的共定位。例如，图11A描绘了与包含结构域“b”的串联重复序列的第二串联体(左)紧密邻近的包含结构域“a”的串联重复序列的第一串联体链(右)。在包含互补结构域“a*”和互补结构域“b*”的经标记的“成像”链的杂交和可视化后，能检测两个串联体链的存在。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含具有茎和环的发夹的催化链，其中所述催化链能够与第一靶结合分子结合；包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物结构域能够与茎结合，从而使发夹线性化，任选地，其中串联体形成链能够与第一靶结合分子结合；和能够与串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链。在一些实施方案中，串联体形成链能够与第二靶结合分子结合。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：第一链，其包含结构域“X*”、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“a”；第二链，其包含结构域“Y*”和结构域“a”；经标记的成像链，其包含第一结构域“a*”和第二结构域“a*”；和任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域“X*”、结构域“Y*”和结构域“a*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”和结构域“a”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于靶标链上，和结构域“Y”位于靶标链上。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含第一组串联重复序列的第一串联体链，其中所述第一串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；和包含第二组串联重复序列的第二串联体链，任选地，其中所述第二串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；和能够同时与第一串联体链的串联重复序列和第二串联体链的串联重复序列结合的经标记的成像链。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：包含结构域X*以及结构域a的串联重复序列的第一串联体链；包含结构域Y*以及结构域b的串联重复序列的第二串联体链；和包含结构域a*和结构域b*的经标记的成像链，其中结构域X*、结构域Y*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中结构域X位于靶标链上，和结构域Y位于靶标链上。
其他方面提供了一种筛选靶分子的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本文提供的任何组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子的存在。
其他方面提供了一种检测靶分子的方法，该方法包括使靶分子与本文提供的任何组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测靶分子。
其他方面还提供了一种筛选两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本文提供的任何组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子之间的相互作用的存在。
进一步的方面提供了一种检测两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使第一靶分子和第二靶分子与本文提供的任何组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测第一靶分子和第二靶分子之间的相互作用。
附图说明
图1A-1B提供了邻近度引物交换反应(ProPER)的实验验证。图1A是示意图，其中在结构域“X”和“Y”之间具有10个核苷酸的接头区域的靶标链(也称为夹板链)用作基底以共定位包含引物“a”的串联体形成链与催化链。图1B是在Cy5通道下扫描的TBE-尿素PAGE变性凝胶，以可视化使用ProPER进行的串联。
图2A-2B提供了接头距离对ProPER的效用的影响的评估。图2A是示意图，其中在结构域“X”和“Y”之间具有可变长度(0至18个核苷酸)的接头区域的靶分子用作基底以共定位包含引物“a”的串联体形成链与催化链。图2B是在Cy5通道下扫描的TBE-尿素PAGE变性凝胶，以可视化使用ProPER进行的串联。结构域X和结构域Y之间的距离为0、5、10、15和18个核苷酸。
图3A-3D提供了显示ProPER的示例应用的示意图。图3A显示了用于检测核酸靶标(DNA/RNA)的ProPER的实例，其中串联体形成链和催化链被设计为仅在靶标链存在的情况下共定位。图3B显示了用于靶向缀合至结合至目标蛋白质的抗体的接头链(也称为桥链)的ProPER的实例。图3C显示了用于检测单个靶蛋白的ProPER的实例。串联体形成链与结合靶蛋白的一种抗体连接，催化链与结合相同靶蛋白的不同区域(例如表位)的另一种抗体连接。图3D显示了ProPER的一个实例，其用于检测例如在相同生物分子复合物中的两个不同靶蛋白之间的相互作用。串联体形成链与结合一种靶蛋白的一种抗体连接，催化链与结合另一种靶蛋白的另一种抗体连接。
图4是示意图，其显示了ProPER产生的串联体能够随后与互补的荧光成像链杂交，例如与所示的双结构域a*a*链杂交。荧光信号的强度反映了所产生的串联体的长度，并且可以将荧光可视化，例如，批量地(例如，可以将靶标和串联体固定在表面上，并测量荧光的总水平)或使用显微镜观察以揭示串联体的空间定位。
图5是显示使用ProPER的生物标志物检测方法的示意图。
图6A-6B提供了显示ProPER在多重邻近检测中的使用的示意图。图6A是示出通过使用邻近串联体形成链的其他发夹而特异性实现的靶结合的示意图。例如，位于“a”引物结构域的两个发夹可能产生包含序列“a”-“b”的重复序列的串联体。图6B是显示使用三个发夹来产生具有序列“a”-“b”-“c”的重复序列的串联体的示意图。发夹的数量能够进一步增加，以获取更多信息和特异性。
图7A-7B提供了使用柔性PER串联体接头的邻近度依赖性PER。图7A是展示使用重复的体外PER以产生具有一条串联体形成链的长串联体，随后使用逐步的PER发夹以将新的串联体形成链序列附加到该串联体上的示意图。图7B是显示FISH反应的示意图，该反应结合了包含42聚体的“桥”突出端的探针序列与互补的体外制备的PER串联体和催化发夹链。探针沿着靶核酸以平铺的方式结合到靶区域，其中一些结合到催化发夹链，而另一些结合到串联体。然后进行邻近度依赖性的PER以延伸串联体形成链，并且将荧光团成像剂与该两种串联体序列杂交以进行成像。
图8A-8C提供了具有柔性PER串联体接头的邻近度依赖性PER的荧光成像结果。图8A显示了使用如图7A-7B中所述的体外PER随后邻近度依赖性原位PER策略靶向总共18个中的一个200kb斑点(斑点X)。下方的Cy3标记的探针杂交至斑点X以及剩余的17个200kb斑点，以照亮整个染色体。所有DNA使用DAPI成像。图8B-8C是代表性的视野，其显示了488和647通道的预期的共定位。它们进一步显示了在较大的Cy3标记的染色体内该共定位区域的定位。
图9A-9B提供了使用邻近度依赖性PER的分支策略。图9A是显示用交替序列平铺的体外合成的探针串联体的示意图，所述交替序列用作PER引物和发夹结合链的支架以将许多引物和发夹定位在彼此附近。然后使用邻近度依赖性PER来创建新的邻近度依赖性的串联体序列，其能够与荧光标记的成像链杂交。图9B显示了在固定的EY.T4细胞中使用靶向Cbx5 mRNA的探针的分支邻近度依赖性PER策略的实验验证。PER信号在647通道中可视化，并且DAPI染色实现细胞核的可视化。比例尺：10微米。
图10A-10B提供了用于相同靶标的重合检测的邻近度依赖性PER的荧光成像结果，如在HeLa细胞培养物中使用细胞蛋白成像所证明的。图10A显示了通过一抗和二抗对核纤层蛋白A的可视化。第一行显示了来自荧光引物的Cy5信号。中间一行显示了来自结合邻近度延伸的串联体的成像剂的ATTO565信号。下面一行显示了两个图像(Cy5，ATTO565)和DAPI的覆盖图。比例尺：20μm。图10B显示了通过一抗和二抗对TOM20的可视化。这些行的组织方式如图10A所示。
图11A-11D提供了显示Co-Zipper的示例应用的示意图。图11A显示了用于检测核酸靶标(DNA/RNA)的Co-Zipper的实例，其中串联体形成链和催化链被设计为仅在靶标链存在的情况下共定位。图11B显示了用于靶向与结合目标蛋白质的抗体缀合的接头链(也称为桥链)的Co-Zipper的实例。图11C显示了用于检测单个靶蛋白的Co-Zipper的实例。第一串联体链与结合靶蛋白的一种抗体连接，第二串联体链与结合相同靶蛋白的不同区域(例如表位)的另一种抗体连接。图11D显示了用于检测例如在相同生物分子复合物中的两个不同靶蛋白之间的相互作用的Co-Zipper的实例。第一串联体链与结合一种靶蛋白的一种抗体连接，第二串联体链与结合另一种靶蛋白的另一种抗体连接。
图12显示了用于在小鼠胚胎成纤维细胞中使用靶向重复序列的不同片段的DNA原位杂交探针检测主要卫星重复序列的Co-Zipper的应用。最上面一行的左图和中图显示了阴性对照，其中仅一种携带FISH探针的串联体被杂交，然后应用邻近度成像剂。最上面一行的右图显示了当两个探针紧密邻近地存在时，来自邻近度成像剂的信号。下面的一行显示了阴性对照(左图)，其中在添加邻近度成像剂和共定位阳性对照(中图和右图)以及随后用互补成像剂(与结合两种串联体的成像链相反)检测每个串联体之前，省去两种FISH探针。
图13显示了用于在固定的HeLa细胞上使用DNA缀合的小鼠和兔二抗检测相互作用蛋白核纤层蛋白A和核纤层蛋白B的Co-Zipper的应用。最上面一行的左图和中图显示了阴性对照，其中仅结合单一抗体，然后应用邻近度成像剂。最上面一行中的右图显示了在两种抗体存在的情况下来自邻近度成像剂的信号。由于两个靶标在核膜中的共定位，因此仅可见核信号。下面的一行显示了阴性对照(左图)，其中在添加邻近度成像剂和共定位阳性对照(中图和右图)以及随后用互补成像剂(与结合两种串联体的成像链相反)检测每个串联体之前，省去两种二抗。
图14A-14B是展示在Co-Zipper中杂交链反应(HCR)的效用的示意图。图14A是HCR的示意图。将DNA的起始链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链反应，其中发夹形成长的双链串联体。通常，将荧光团缀合到发夹上提供线性扩增。对于Co-Zipper改编，在发夹之一中附加额外的立足点结构域(序列“a”)，而不是荧光团。图14B是显示了由邻近度成像剂(“a*”+“b*”)实现的由HCR形成的双链组件的共检测的示意图。延伸出双链HCR产物的单链立足点结构域(“a”和“b”)只有在两个结构域彼此紧密邻近时才能保持与成像链的稳定结合。
发明详述
如本文所使用的“链”是单链(未配对)核酸(例如，DNA和/或RNA)。本文提供的任何链(例如，催化链，串联体形成链，第一串联体链，第二串联体链，接头链，引物链和/或成像链)的长度可以变化。在一些实施方案中，链的长度是5-10000个核苷酸(5nm-10μm)。例如，链的长度可以为5-10000、5-5000、5-1000、5-500、5-450、5-400、5-350、5-300、5-250、5-200、5-150、5-100、5-50、10-10000、10-5000、10-1000、10-500、10-450、10-400、10-350、10-300、10-250、10-200、10-150、10-100、10-50、20-10000、20-5000、20-1000、20-500、20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-10000、30-5000、30-1000、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-10000、40-5000、40-1000、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-10000、50-5000、50-1000、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-10000、60-5000、60-1000、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-10000、70-5000、70-1000、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-10000、80-5000、80-1000、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-10000、90-5000、90-1000、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-10000、100-5000、100-1000、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
本文提供的任何链可以用能够直接检测链(例如，通过荧光显微镜或其他成像方法)的分子进行修饰。此类“修饰分子”的非限制性实例包括荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺。
“结构域”仅仅是较长核酸内的连续核苷酸片段的定义。因此，链可具有多个结构域。本文提供的任何结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，结构域(例如，茎结构域，环结构域，引物结构域，结构域“a”，结构域“a*”，结构域“X”，结构域“X*”，结构域“Y”和/或结构域“Y*”)的长度为3-100个核苷酸。例如，结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48、49或50个核苷酸。
应当理解，如本文所提供的结构域可以通过互补核苷酸碱基配对彼此结合(杂交)。因此，本文提供的任何一个实施方案的结构域“a”可以包含与结构域“a*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列。类似地，本文提供的任何一个实施方案的结构域“b”可以包含与结构域“b*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“w”可以包含与结构域“w*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“z”可以包含与结构域“z*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“1”可以包含与结构域“1*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“2”可以包含与结构域“2*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“3”可以包含与结构域“3*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“4”可以包含与结构域“4*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“X”可以包含与结构域“X*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“Y”结构域可以包含与结构域“Y*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列。
邻近度引物交换反应(ProPER)
邻近度引物交换反应(ProPER)利用依赖于串联体形成链和催化链的空间邻近度的串联反应，当共定位时，它们相互作用以产生长的局部的串联体。串联体的产生指示固定的靶标的存在或两个或多个固定的靶标之间的相互作用的存在。在一些实施方案中，基于邻近度的检测的操作依赖于反应条件，例如盐和温度。其他条件(例如串联体形成链和催化链结合的区域(例如，图1A-1B中的结构域“Y*”和“X*”)之间的距离)也会影响串联效率。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子，包含具有茎和环的发夹的催化链，其中所述催化链能够与所述第一靶结合分子结合，包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子结合，以及能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链。
本公开内容的其他方面提供了一种组合物，其包含：第一链，其包含结构域“X*”、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“a”；第二链，其包含结构域“Y*”和结构域“a”；经标记的成像链，其包含第一结构域a*和第二结构域a*，其中结构域“X*”、结构域“Y*”和结构域“a*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”和结构域“a”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于靶标链上，和结构域“Y”位于靶标链上。
本公开内容的其他方面还提供了一种组合物，其包含：(a)经标记的探针链，其中每个探针链包含结构域“a”和结构域“b”，(b)串联体链，其中每个串联体包含结构域“b*”、一组串联重复序列和引物结构域，(c)催化链，其中每个催化链包含结构域“b*”、茎和环，并且其中所述引物结构域包含与所述茎的序列互补的序列，(d)第一经标记的成像链，其包含与所述串联体链的串联重复序列互补的序列，(e)第二经标记的成像链，其包含与所述串联体链的引物结构域互补的序列，任选地(f)聚合酶，任选地链置换聚合酶，和/或dNTP，以及任选地(g)包含结构域“a*”的靶标链，其中结构域“a”和结构域“b”各自包含分别与结构域“a*”和结构域“b*”的序列互补的序列。
催化链
在一些实施方案中，催化链包含具有茎(茎结构域)和环(环结构域)的发夹。即，催化链是通过茎上的分子内结合形成发夹状的单链核酸。图1A提供了在5’至3’方向上包含结构域“a”、环、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“X*”的催化链的实例。结构域“a”内的核苷酸序列与结构域“a*”内的核苷酸序列互补，因此结构域“a”能够与结构域“a*”结合(杂交)以形成具有中间有环的茎。
催化链和催化链内的结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，催化链的长度是20-500个核苷酸。例如，催化链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，催化链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
茎的长度可以变化。在一些实施方案中，茎的长度为3-100个核苷酸。例如，茎的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为3-100个核苷酸。例如，环的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，环的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方案中，催化链包含终止聚合的分子或修饰。通过链置换聚合酶的串联体形成链(与催化链结合)的引物结构域的延伸通过所述催化链中终止聚合的分子或修饰的存在而终止。终止聚合的分子或修饰(“终止子”)通常位于催化分子的茎结构域中，使得聚合终止通过所述茎结构域的所述引物的延伸。对于以发夹形式布置的催化链，终止聚合的分子或修饰可以位于所述茎结构域和所述环之间。在一些实施方案中，所述终止聚合的分子是合成的非DNA接头，例如三甘醇间隔子，例如Int Spacer 9(iSp9)或Spacer 18(Integrated DNA Technologies(IDT))。应当理解，可以如本文所提供地使用任何终止通过聚合酶的聚合的非天然接头。此类分子和修饰的其他非限制性实例包括三碳键(/iSpC3/)(IDT)、ACRYDITETM(IDT)、腺苷酰化、叠氮化物、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG(IDT)、I-LINKERTM(IDT)和3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)及其变体。通常但并非总是如此，短的接头(例如，iSp9)导致更快的反应时间。
在一些实施方案中，所述终止聚合的分子是单个或成对的非天然核苷酸序列，例如iso-dG和iso-dC(IDT)，它们分别为胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体。Iso-dC将与Iso-dG碱基配对(氢键)，但不与dG碱基配对。类似地，Iso-dG将与Iso-dC碱基配对，但不与dC碱基配对。通过成对地在所述发夹的相对侧掺入这些核苷酸，在所述终止子位置处，所述聚合酶将被终止，因为它在溶液中没有互补的核苷酸添加到该位置。
在一些实施方案中，通过将反应中的dNTP浓度(例如，从200μM)降低至100μM、10μM、1μM或更小来改善“终止子”修饰的执行效率。
包含终止聚合的分子或修饰通常在催化链的茎结构域中产生“凸起”，因为分子或修饰未配对(与另一个分子结合)。因此，在一些实施方案中，催化分子被设计成包括(与所述分子或修饰相对地)单个核苷酸(例如胸腺嘧啶)、至少两个相同的核苷酸(例如胸腺嘧啶二聚体(TT)或三聚体(TTT))或非天然的修饰。
串联体形成链
在一些实施方案中，串联体形成链包含引物结构域的串联重复序列。序列的“串联重复序列”是特定序列的相邻重复。例如，序列ATCGATCG是ATCG的串联重复序列。串联体形成链中的串联重复序列的数目(例如，引物结构域的数目)可以变化。在一些实施方案中，串联体形成链包含2-100个串联重复序列。例如，串联体形成链可包含2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联体形成链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21，22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46，47、48、49或50个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。在一些实施方案中，串联体形成链包含引物结构域的两个或更多个串联重复序列。
串联体形成链和串联体形成链内的引物结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为1nm-10μm。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为20-500个核苷酸。例如，串联体形成链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
在一些实施方案中，引物结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，引物结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，引物结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方案中，串联体形成链的引物结构域能够与催化链的茎结合，从而使所述发夹线性化。例如，参考图1A，串联体形成链的引物结构域“a”(左)能够与催化链的茎的结构域“a*”结合，并且在存在链置换聚合酶和dNTP的情况下，所述催化链“打开”(茎区域解离)，并作为将结构域“a”的串联重复序列附加到所述串联体形成链上的模板。所述催化链的茎随后重组。此循环重复以形成结构域“a”的串联重复序列的串联体。
探针链
在一些实施方案中，探针链包含可检测标记(例如荧光团)、与靶标链结合的结构域和与串联体链结合的结构域。在一些实施方案中，探针链包含结构域“a”和结构域“b”，使得所述探针链与包含结构域“a*”的靶标链结合，并与包含结构域“b”的串联体链结合。探针链的长度可以变化。在一些实施方案中，探针链的长度为3-50个核苷酸。例如，探针链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，探针链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
ProPER成像链
在一些实施方案中，成像链是短链，其能够与串联体形成链的串联重复序列结合(参见，例如图4)。在一些实施方案中，成像链包含可检测标记，例如荧光团。成像链的长度可以变化。在一些实施方案中，成像链的长度为5-200个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3-50个核苷酸。例如，成像链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，成像链包含第一结构域“a*”和第二结构域“a*”，使得所述成像链与包含结构域“a”的串联重复序列的串联体形成链结合。
可以在本文中用作例如探针链和/或成像链的标记的荧光团的实例包括但不限于羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexa fluor、氨基香豆素、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexafluor 488、荧光素FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexafluor 546、Alexa fluor 555、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、别藻蓝蛋白、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7和Cy7.5。可以使用其他荧光分子。
在一些实施方案中，成像链(或本文所述的任何其他链)可以被选自以下的部分标记(例如，连接)：荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、酪酰胺。本文还涵盖其他可检测的修饰基团。
成像链可以例如直接在串联体或串联体形成链上检测，或可以通过去杂交作用(例如，通过修饰缓冲离子成分或添加化学试剂(例如甲酰胺或DMSO)或通过加热)释放以通过适合于特定修饰的各种读出方法进行检测。检测方法包括但不限于显微镜观察、荧光扫描、流式细胞术、质谱流式细胞术、基于质量的质谱检测、磁性方法、基于聚集溶液的方法(例如，诸如SYBR green的嵌入染料)、化学下拉法、酶促测定和/或测序。
组合物
本公开内容的ProPER组合物由以下编号的段落描述：
1.一种组合物，其包含：
与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；
包含具有茎和环的发夹的催化链，其中所述催化链能够与第一靶结合分子结合；
包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子结合；以及
能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链。参见，例如图3B。
2.段落1所述的组合物，其进一步包含聚合酶，任选地链置换聚合酶，和/或dNTP。
3.段落1或2所述的组合物，其进一步包含过量(例如，过量2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍)的催化链，所述串联体形成链的引物能够与所述催化链结合。
4.段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
5.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链包含引物结构域的两个或更多个串联重复序列。
6.段落1-5中任一段所述的组合物，其中所述串联重复序列的长度为5nm至1000nm。
7.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链能够与第一靶结合分子结合。
8.段落1-7中任一段所述的组合物，其中所述催化链和串联体形成链通过中间接头与所述第一靶结合分子结合。
9.段落1-8中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子与第一接头链连接，所述第一接头链包含能够与所述催化链结合的第一结构域。
10.段落9所述的组合物，其中所述第一接头链进一步包含能够与所述串联体形成链结合的第二结构域。参见，例如图3B。
11.段落10所述的组合物，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
12.段落10所述的组合物，其中所述第一结构域和/或所述第二结构域的长度为1nm至10μm。
13.段落9-12中任一段所述的组合物，其中所述第一接头链的长度为1nm至10μm。
14.段落1-13中任一段所述的组合物，其进一步包含第一靶分子，任选地，其中靶分子为DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中靶分子存在于经固定的组织中。
15.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链能够与第二靶结合分子结合。参见，例如图3C。
16.段落15所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与包含第二结构域的第二接头链连接，所述串联体形成链能够与所述第二结构域结合。参见，例如图3C。
17.段落9-16中任一段所述的组合物，其中第一接头链的长度为1nm至10μm。
18.段落16或17所述的组合物，其中所述第二接头链的长度为1nm至10μm。
19.段落17或18所述的组合物，其进一步包含第二靶结合分子。
20.段落19所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与所述第一靶分子特异性结合，任选地，其中所述第一靶结合分子和所述第二靶结合分子与所述第一靶分子结合的区域不同。参见，例如图3C。
21.段落16-20中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽为抗体。
22.段落16-21中任一段所述的组合物，其中所述经标记的成像链包含选自荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺的可检测标记。
23.段落15-21中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与第二靶分子特异性结合，任选地，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中所述第二靶分子存在于经固定的组织中。参见，例如图3D。
24.段落23所述的组合物，其进一步包含第二靶分子。
25.一种组合物，其包含：靶结合分子，其与(i)包含具有茎和环的发夹的催化链和(ii)包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链连接，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化；和能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链；以及任选地，由所述靶结合分子结合的靶标。参见，例如图3B。
26.一种组合物，其包含：催化链，其包含具有茎和环的发夹；包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化；以及经标记的成像链，其能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合，以及任选地靶标链，其能够与所述催化链和串联体形成链结合。参见，例如图3A。
27.一种组合物，其包含：第一链，其包含结构域“X*”、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“a”；第二链，其包含结构域“Y*”和结构域“a”；经标记的成像链，其包含第一结构域“a*”和第二结构域“a*”；和任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域“X*”、结构域“Y*”和结构域“a*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”和结构域“a”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于靶标链上，和结构域“Y”位于靶标链上。参见，例如图3A。
28.段落27所述的组合物，其包含聚合酶和/或dNTP。
29.段落27或28所述的组合物，其中结构域“X”和结构域“Y”位于相同靶标链上，以及任选地，其中结构域“X”和结构域“Y”彼此相隔10μm或更小或100nm或更小的距离。参见，例如图3A。
30.段落29所述的组合物，其中所述靶标链与靶结合分子连接，任选地，其中所述靶结合分子是多肽，以及任选地，其中所述多肽是抗体。
31.段落27所述的组合物，其中结构域X位于第一靶标链上，以及结构域Y位于第二靶标链上。
32.段落31所述的组合物，其中所述第一靶标链与第一靶结合分子连接，以及所述第二靶标链与第二靶结合分子连接，任选地，其中所述第一靶结合分子是第一多肽和/或所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体和/或所述第二多肽是第二抗体。参见，例如图3C。
33.段落32所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至相同靶分子，或其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至不同的靶分子。参见，例如图3C和3D。
34.一种组合物，其包含：第一催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第一催化链能够与第一靶结合分子结合；第二催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第二催化链能够与第二靶结合分子结合；任选地第三催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第三催化链能够与第三靶结合分子结合，包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述第一催化链、所述第二催化链以及任选地所述第三催化链的茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子或第二靶结合分子结合；以及第一、第二和任选地第三经标记的成像链，其各自能够与所述串联体形成链的串联重复序列结合。参见，例如图6B。
方法
一些方面提供了一种筛选靶分子的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的ProPER组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子的存在。
其他方面提供了一种检测靶分子的方法，该方法包括使所述靶分子与本公开内容的ProPER组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测靶分子。
其他方面还提供了一种筛选两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的ProPER组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子之间的相互作用的存在。
进一步的方面提供了一种检测两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使第一靶分子和第二靶分子与本公开内容的ProPER组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测所述第一靶分子和所述第二靶分子之间的相互作用。
另一个方面提供了一种方法，该方法包括使靶标链与包含具有茎和环的发夹的催化链、包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链、能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链和聚合酶和/或dNTP接触，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，其中所述靶标链包含能够与所述催化链结合的第一结构域和能够与所述串联体形成链结合的第二结构域，以及任选地，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
其他方面提供了一种分子检测方法，其包括：(a)使与靶标链连接的表面与(i)包含具有茎和环的发夹的催化链和(ii)包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链接触，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中组合物包含过量的催化链，并且其中所述催化链和所述串联体形成链与所述靶标链结合；(b)任选地，洗涤所述表面；(c)在存在聚合酶和/或dNTP的情况下，在与所述靶标链结合的串联体形成链上产生所述引物结构域的其他串联重复序列；(d)使(c)的串联体形成链与能够与所述串联体形成链的串联重复序列结合的经标记的成像链接触；(e)任选地，洗涤(d)的表面；和(f)检测经标记的成像链。参见，例如图5，
鉴于其高特异性，以及线性扩增带来的灵敏度，ProPER的应用前景广阔。图3A-3D显示了如何将该方法用于特异性检测DNA、RNA和蛋白质靶标，以及如何将该方法用于研究在低于衍射极限的范围内发生的相互作用，例如生物分子复合物中蛋白质与蛋白质的结合。这两种应用在疾病诊断方法的开发以及更基础的生物学研究中都具有巨大的潜力。
高度特异和灵敏的生物标志物检测。在一些实施方案中，由于ProPER的快速、特异和灵敏的生物标志物检测，能够将其用于诊断应用。图5显示了示例工作流程。组分之一(在这种情况下为引物)附接在表面(其可以是纸、玻璃、塑料或另一种基底)上。然后，其余组分(靶标链和发夹链)结合到该基底结合的组分上。例如，可以将血清或其他含有目标核酸分析物的液体与发夹预混合，或者可以通过结合和洗涤步骤在基底上依次引入这些寡核苷酸。一旦形成了引物-靶标-发夹复合物，就可以通过抽吸和重新悬浮将额外的发夹链洗掉。接下来，运行ProPER以产生串联体，各自针对已结合的每个目标靶分子。引入荧光链以结合串联体以及然后将多余的未结合的链洗掉。最后，使用两种策略之一读取荧光输出：批量荧光或斑点计数。对于批量荧光，能够使用基于LED或激光的扫描仪(例如酶标仪)在表面上读取总荧光水平。可替代地，能够例如使用显微镜或自动计数器来计数单个荧光斑点的数量，并且能够将斑点的密度定量地映射到原始分析物的浓度估计值。
相互作用伴侣检测。在一些实施方案中，ProPER能用于在溶液中或原位检测相互作用伴侣。在该实例中，引物和发夹附接到不同的目标分子上，并且仅在它们紧密邻近时才产生输出。由于ProPER对于每一轮扩增会都需要组分的邻近，因此，预期更高的Kd值转换为更长的串联体(其产生更高的信号)。ProPER提供的动力学信号放大将具有更高的灵敏度或更低的背景以及生物分子相互作用的直接输出的特征。
低背景原位成像。在一些实施方案中，ProPER用作用于原位成像的方法。引物和发夹能使用图3A-3D中描绘的策略之一共定位以靶向DNA/RNA/蛋白质并在经固定的组织样品中原位生长串联体。通过在互补荧光链与这些局部串联体杂交之后对荧光进行成像(参见，图4)，能够知道这些靶向的生物分子在目标样品中的相对位置。此外，由于依赖于引物和发夹的邻近度，与正常的原位探针靶向和扩增(其通常仅依赖于定位在靶标上的一条探针链而不是两条)相比，预期背景显著降低。
示例性ProPER特征
特异性检测：在一些实施方案中，串联依赖于两种组分与靶标链/蛋白质/复合物的成功结合，因此与仅具有特异于靶标的一个检测事件的方法相比，相互作用的特异性增加。这种“双重检查”对降低背景具有非线性影响，因为引物和发夹两者结合错误靶标但彼此邻近的概率现在非常低。如果只有单个组分(引物/发夹)与错误的基底结合，则不会产生信号。在一些实施方案中，能够通过改变引物/发夹结合其靶标的方式和/或通过依赖额外的邻近相互作用(检测事件)来进一步提高特异性。
多重邻近度检查：不仅多次检查引物/发夹与靶标结合的特异性，而且还通过串联过程多次检查邻近度本身。每个PER步骤取决于引物与发夹的邻近度，因此串联体的长度反映了成功检查邻近度的次数(邻近事件)。因此，串联是一种类型的“邻近度校对”。使用ProPER，检测和邻近反应两者都是高度特异的，导致非常低的错误率。
扩增：由于反应的输出是一条长链，因此它用作线性扩增的一种形式。串联体能够用作例如荧光链的支架基底(例如图4)，其能够用于将许多荧光团聚集到单个串联体上。这为基于表面和基于固定样品的应用提供了高度灵敏、简单且经济高效的读出方法。
其他实施方案
在一些实施方案中，靶标、引物、发夹和其他(例如抗体)组分可以一起退火(例如，通过在1小时内从80℃冷却至20℃)，或者它们可以等温地组合在一起(例如，在室温、37℃、46℃等)。它们也可以在改善其对靶标链的特异性的条件下结合，例如使用标准的ISH(原位杂交)缓冲液(例如SSCT和PBS)，通常添加甲酰胺。
在一些实施方案中，组分的结合可以扩散地(在溶液中)进行，或者用一种或多种附接到基底的组分来进行。例如，可以固定组织样品(靶标)，以及随后引物和发夹链与其结合。备选地，引物或发夹链中的一个可以与表面结合(实例参见图5)，而其他链随后与表面结合的链杂交。
在一些实施方案中，靶向区域X/X*和Y/Y*的结合可以是瞬时的(使得平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者它们可以更强地结合(例如数分钟到数小时或更久的结合)。除了改变结合缓冲液条件之外，还可以通过使用保护链和立足点介导的链置换[5]或立足点交换[6](需要靶标链与现有链竞争)来使这种相互作用更加特异性。
在一些实施方案中，图5中的表面可以是纸、玻璃、塑料或能够以某种方式附接寡聚体的任何其他基底。链可以通过吸收或干燥而结合到表面上，或者通过例如使用生物素标记的引物组分和链霉亲和素包被的表面来使它们化学结合。
在一些实施方案中，反应和可视化工作流程可以完全扩散地进行(例如，从图5中除去表面)，并且能够通过现有的扩散方法(例如分子信标[7]和FRET配对置换(参见，例如[8]))或通过基于凝胶的测定来读取串联长度。
在一些实施方案中，引物和发夹链本身可以直接与抗体缀合(即没有中间桥链)。
在一些实施方案中，额外的序列修饰(例如间隔子)可以被包括在链中，以帮助实现柔性并且允许它们在一系列构型下能够到达彼此的位置。
在一些实施方案中，还能通过使用在延伸反应期间掺入的荧光团标记的dNTP来实现荧光读出，从而使串联体本身是发荧光的。
在一些实施方案中，能够检测任意数量的邻近发夹，以进一步提高靶标结合的特异性。在图7A-7B中显示了实现这一点的一种方法。图7A显示了如何能够使用两个发夹来产生5’-a b a b…a b-3’形式的串联体，与重复单元互补的荧光链(例如5’-b*a*-3’)能够与之结合以产生荧光输出。图7B显示了具有3个发夹的类似设置，其产生了5’-a b c a b c…a b c-3’形式的串联体。例如，使荧光链与序列5’-c*b*a*-3’杂交，将实现串联体的特定荧光输出。发夹的数量能够任意增加，以便对于成功且重复的串联必须在空间上邻近的分子数量为n+1，其中n是发夹的数量。
在一些实施方案中，能够进行多元化输出，例如通过使用多个正交串联ProPER序列，所述ProPER序列被同时扩增并映射到不同的荧光颜色。
共拉链反应
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含第一组串联重复序列的第一串联体链，其中所述第一串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及包含第二组串联重复序列的第二串联体链，任选地，其中所述第二串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及能够同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链。
本公开内容的其他方面提供了一种组合物，其包含：包含结构域X*以及结构域a的串联重复序列的第一串联体链；包含结构域Y*以及结构域b的串联重复序列的第二串联体链；和包含结构域a*和结构域b*的经标记的成像链，其中结构域X*、结构域Y*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中结构域X位于靶标链上，和结构域Y位于靶标链上。
串联体链
在一些实施方案中，串联体链包含一组串联重复序列。如本文所述，序列的“串联重复序列”是特定序列的相邻重复。应当理解，“第一组”串联重复序列不同于“第二组”串联重复序列。例如，第一组串联重复序列可以包括序列ATCGA的串联重复序列，而第二组串联重复序列可以包括序列TACGT的串联重复序列。因此，“第一串联体链”的序列不同于“第二串联体链”的序列。
第一和/或第二串联体链的长度可以变化。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为1nm-10μm。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为20-500个核苷酸。例如，第一和/或第二串联体链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100，125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
串联体链中串联重复序列的数目可以变化。在一些实施方案中，串联体链包含2-100个串联重复序列。例如，串联体链可包含2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个串联重复序列。在一些实施方案中，串联体链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48、49或50个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，如本文所提供的，可以使用杂交链反应来合成如本文所提供的串联体链，例如如图14A和14B所示。将DNA的引物链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链反应，其中发夹形成长的双链串联体。在图14A和14B的实例中，从双链HCR产物突出的单链“立足点”结构域(“a”和“b”)只有在两者彼此紧密邻近时才能保持稳定的结合。因此，在一些实施方案中，组合物包括组合物A，其包含第一引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域“X*”、结构域“1”和结构域“w”；第一发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“w”、结构域“2”、结构域“w*”和结构域“1*”；第二发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“a”、结构域“2*”、结构域“w*”、结构域“1”和结构域“w”；第二引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域“Y*”、结构域“3”和结构域“z”；第三发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“z”、结构域“4”、结构域“z*”和结构域“3*”；第四发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“b”、结构域“4*”、结构域“z*”、结构域“3”和结构域“z”；经标记的成像链，其在任选地5′至3′上包含结构域“a*”和结构域“b*”；和任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域“X*”、结构域“Y*”、结构域“1*”、结构域“2*”、结构域“3*”、结构域“4*”、结构域“w*”、结构域“z*”、结构域“a*”和结构域“b*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”、结构域“1”、结构域“2”、结构域“3”、结构域“4”、结构域“w”、结构域“z”、结构域“a”和结构域“b”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于第一接头链上，和结构域“Y”任选地位于第一接头链上。
引物链的长度可以变化。在一些实施方案中，引物链的长度为3-100个核苷酸。例如，引物链的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，引物链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
发夹链的长度可以变化。在一些实施方案中，发夹链的长度为20-500个核苷酸。例如，发夹链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，发夹链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
共拉链反应成像链
在一些实施方案中，成像链是短链，其能同时结合第一串联体链的串联重复序列和第二串联体链的串联重复序列(参见，例如图11A)。在一些实施方案中，成像链包含可检测标记，例如荧光团。成像链的长度可以变化。在一些实施方案中，成像链的长度为5-200个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3-50个核苷酸。例如，成像链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，成像链包含第一结构域“b*”和第二结构域“a*”，使得成像链结合包含结构域“a”的串联重复序列的第一串联体链，并结合包含结构域“b”的串联重复序列的第二串联体链。
可在本文中使用的荧光团的实例包括但不限于羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexafluor、氨基香豆素、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、荧光素FITC、Alexafluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、TexasRed、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、别藻蓝蛋白、Alexa fluor 647、Cy5、Alexafluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7和Cy7.5。可以使用其他荧光分子。
在一些实施方案中，成像链(或本文所述的任何其他链)可以被选自以下的部分标记(例如，连接)：荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、酪酰胺。本文还涵盖其他可检测的修饰基团。
成像链可以例如直接在串联体或串联体形成链上检测，或可以通过去杂交作用(例如，通过修饰缓冲离子成分或添加化学试剂(如甲酰胺或DMSO)或通过加热)释放以通过适合于特定修饰的各种读出方法进行检测。检测方法包括但不限于显微镜观察、荧光扫描、流式细胞术、质谱流式细胞术、基于质量的质谱检测、磁性方法、基于聚集溶液的方法(例如，诸如SYBR green的嵌入染料)、化学下拉法、酶促测定和/或测序。
组合物
本公开内容的Co-Zipper组合物由以下编号的段落描述：
1.一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含第一组串联重复序列的第一串联体链，其中所述第一串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及包含第二组串联重复序列的第二串联体链，任选地，其中所述第二串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及能够同时与所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列结合的经标记的成像链。参见，例如图11B。
2.段落1所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
3.段落1或2所述的组合物，其中所述第一串联体链包含两个或更多个串联重复序列和/或所述第二串联体链包含两个或更多个串联重复序列。
4.段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述第一和/或第二串联体的串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
5.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述第二串联体能够与所述第一靶结合分子结合。参见，例如图11B。
6.段落1-5中任一段所述的组合物，其中所述第一串联体链和所述第二串联体链通过中间接头与所述第一靶结合分子结合。
7.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子与第一接头链连接，所述第一接头链包含能够与所述第一串联体链结合的第一结构域。
8.段落7所述的组合物，其中所述第一接头链进一步包含能够与所述第二串联体链结合的第二结构域。参见，例如图11B。
9.段落8所述的组合物，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
10.段落9所述的组合物，其中所述第一结构域和/或所述第二结构域的长度为1nm至10μm。
11.段落1-10中任一段所述的组合物，其进一步包含第一靶分子，任选地，其中靶分子为DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中靶分子存在于经固定的组织中。
12.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述第二串联体链能够与第二靶结合分子结合。参见，例如图11C。
13.段落12所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与包含能够与所述第二串联体链结合的第二结构域的第二接头链连接。参见，例如图11C。
14.段落7-13中任一段所述的组合物，其中所述第一接头链的长度为1nm至10μm。
15.段落14或15所述的组合物，其中所述第二接头链的长度为1nm至10μm。
16.段落12-15中任一段所述的组合物，其进一步包含第二靶结合分子。
17.段落16所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与所述第一靶分子特异性结合，任选地，其中所述第一靶结合分子和所述第二靶结合分子与所述第一靶分子结合的区域不同。参见，例如图11C。
18.段落12-17中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
19.段落1-18中任一段所述的组合物，其中所述经标记的成像链包含选自荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺的可检测标记。
20.段落16-19中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与第二靶分子特异性结合，任选地，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中所述第二靶分子存在于经固定的组织中。参见，例如图11D。
21.段落20所述的组合物，其进一步包含所述第二靶分子。
22.一种组合物，其包含：与(i)包含第一组串联重复序列的第一串联体链和(ii)包含第二组串联重复序列的第二串联体链连接的靶结合分子；同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链；以及任选地由所述靶结合分子结合的靶标。参见，例如图11B。
23.一种组合物，其包含：第一串联体链，其包含第一组串联重复序列；第二串联体链，其包含第二组串联重复序列；能够同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链，以及任选地能够与所述第一串联链和所述第二串联链结合的靶标链。参见，例如图11A。
24.一种组合物，其包含：包含结构域X*和结构域a的串联重复序列的第一串联体链；包含结构域Y*和结构域b的串联重复序列的第二串联体链；和包含结构域a*和结构域b*的经标记的成像链，其中结构域X*、结构域Y*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域X位于靶标链上，和结构域Y位于靶标链上。参见，例如图11A。
25.段落24所述的组合物，其中结构域X和结构域Y位于相同的靶标链上，以及任选地，其中结构域X和结构域Y彼此相隔10μm或更小或100nm或更小的距离。参见，例如图11B。
26.段落25所述的组合物，其中所述靶标链与靶结合分子连接，任选地，其中所述靶结合分子是多肽，以及任选地，其中所述多肽是抗体。
27.段落24所述的组合物，其中结构域X位于第一靶标链上，以及结构域Y位于第二靶标链上。参见，例如图11C。
28.段落27所述的组合物，其中所述第一靶标链与第一靶结合分子连接，以及所述第二靶标链与第二靶结合分子连接，任选地，其中所述第一靶结合分子是第一多肽和/或所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体和/或所述第二多肽是第二抗体。
29.段落28所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至相同靶分子，或其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至不同的靶分子。
30.一种组合物，其包含第一引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域X*、结构域1和结构域w；第一发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域w、结构域2、结构域w*和结构域1*；第二发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域a、结构域2*、结构域w*、结构域1和结构域w；第二引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域Y*、结构域3和结构域z；第三发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域z、结构域4、结构域z*和结构域3*；第四发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域b、结构域4*、结构域z*、结构域3和结构域z；经标记的成像链，其在任选地5′至3′上包含结构域a*和结构域b*；以及任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域X*、结构域Y*、结构域1*、结构域2*、结构域3*、结构域4*、结构域w*、结构域z*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域1、结构域2、结构域3、结构域4、结构域w、结构域z、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中结构域X位于第一接头链上，以及结构域Y任选地位于所述第一接头链上。参见，例如图14A。
31.段落30所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第一接头链。
32.段落30或31所述的组合物，其中所述第一接头链与特异性结合至第一靶分子的第一靶结合分子连接。
33.段落32所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是第一多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体。
34.段落32或33所述的组合物，其中所述第一靶分子是DNA、RNA或蛋白质。
35.段落30-34中任一段所述的组合物，其中结构域Y位于所述第一接头链上。
36.段落30-35中任一段所述的组合物，其中结构域Y位于第二接头链上。
37.段落36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二接头链。
38.段落36或37所述的组合物，其中所述第二接头链与第二靶结合分子连接。
39.段落38所述的组合物，其中所述第二靶结合分子特异性结合至第一靶分子。
40.段落38或39所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第二多肽是第二抗体。
41.段落40所述的组合物，其中所述第二靶结合分子特异性结合至第二靶分子。
42.段落41所述的组合物，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质。
方法
一些方面提供了一种筛选靶分子的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的Co-Zipper组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子的存在。
其他方面提供了一种检测靶分子的方法，该方法包括使靶分子与本公开内容的Co-Zipper组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测靶分子。
其他方面还提供了一种筛选两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的Co-Zipper组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子之间相互作用的存在。
进一步的方面提供了一种检测两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使第一靶分子和第二靶分子与本公开内容的Co-Zipper组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测所述第一靶分子和所述第二靶分子之间的相互作用。
另外的方面提供了一种方法，该方法包括使靶标链与包含第一组串联重复序列的第一串联体链、包含第二组串联重复序列的第二串联体链和能够同时与所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列结合的经标记的成像链接触，其中所述靶标链包含能够与第一串联体结合的第一结构域和能够与第二串联体结合的第二结构域，以及任选地，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
Co-Zipper的高特异性和增强的信号背景比灵敏度开启了许多有希望的应用。图11A-11D显示了其能用于特异性检测DNA、RNA和蛋白质靶标的不同方法，以及如何可以将其用于研究相互作用，例如生物分子复合物中蛋白质与蛋白质的结合。这些应用在基础生物学研究和疾病诊断和医学成像方法的开发中具有巨大潜力。
高特异性和低背景原位成像。Co-Zipper是用于以高特异性和低背景成像靶标的有价值的方法。通过PER或滚环扩增产生的串联体能用于原位靶向经固定的细胞或组织样品中的DNA/RNA/蛋白质。在这种情况下，用不同的引物(用于直接检测)或桥序列(用于间接检测)标记靶向相同靶标的探针(图11A)。仅当两个串联体紧密邻近时才生成输出。图12显示了原位应用的实例。靶向小鼠胚胎成纤维细胞的主要卫星重复序列中两个重复序列的FISH探针在3'处附加PER引物，并在体外通过PER预延伸为正交串联体。然后将它们用于原位杂交实验，然后添加仅当结合到两个串联体时才产生强信号的邻近度成像链，因为它们被设计为非常弱地结合单个串联体，如阴性对照所示。
相互作用伴侣检测。Co-Zipper能用于在溶液中或原位检测相互作用伴侣。在这种情况下，直接地或通过使用互补桥序列将串联体标记在不同的目标分子上(图11D)。仅当两个串联体紧密邻近时才生成输出。图13显示了原位应用的实例。两个核纤层蛋白(Lamin)A和B通过针对它们的一抗随后通过与两个正交桥序列缀合的同源二抗进行检测。通过PER在体外将两个附加有桥互补物的正交引物预延伸至串联体中。免疫染色后，将串联体同时应用于样品上并与桥杂交。随后添加邻近度成像剂，其揭示了两种蛋白质共定位的位置(核纤层)，并且当省略抗体中的一种时未发出信号。与通过邻近度成像剂获得的非常特异的核信号相比，其中成像剂稳定结合单个串联体的对照在细胞质中显示明显的染色。
多重检测。通过使用正交串联体，Co-Zipper可轻松实现多重检测。能够通过将针对每个靶标或配对的唯一串联体与通用串联体组合来完成多重检测。可替代地，它还使得可以通过能被邻近度成像剂利用的组合检测系统以较少数量的正交序列设计达到更高水平的多重检测。这允许通过使用n个正交串联体达到n*(n-1)/2个正交二进制系统。同样，能将替代位点用于检测邻近度探针。
高度特异和灵敏的生物标志物检测。Co-Zipper能用于溶液中的和原位的诊断应用。它提供的快速、特异和灵敏的检测能力使得能够对组织样品中的由于高背景和低信号而通常难以成像的低丰度生物标志物进行高可信度的原位成像。
示例性的Co-Zipper特征
特异性检测：由于一个或多个靶标的检测依赖于荧光探针与不同串联体的成功结合，因此与仅具有特异于靶标的一个检测事件的方法相比，检测的特异性增加。该重合检测以非线性方式减少背景。
多重邻近度检查：在荧光探针杂交的每个步骤检查两个串联体的邻近度，因为每个杂交步骤依赖于两个串联体的邻近度，因此信号放大水平反映了物理邻近度。因此，检测变得非常特异，从而仅对邻近串联体产生放大信号。
放大的信号：串联体在以高精度检测到的靶标上提供强大的信号放大。
其他实施方案
在一些实施方案中，能够在溶液中、在固定的表面和基底上、以夹心形式或原位进行Co-Zipper测定。它们可以用于检测蛋白质、RNA、DNA以及其他生物标志物、分析物、小分子、病毒、全细胞或细胞碎片或能够使用核酸探针直接或间接(使用第二探针)标记的任何其他靶标。用于特异性标记的探针可以是抗体、纳米抗体或其他亲和力结合物，例如亲和体或适配体、RNA或DNA原位杂交探针、配体、重组标签、非天然氨基酸或核苷酸或小分子。
在一些实施方案中，代替在PER或RCA的情况下的串联重复序列的串联体，具有散布的重复序列或独特序列的DNA标签可以用于标记，并且能够由邻近度成像剂检测。在这种情况下，能够设计多于一种邻近度成像剂来同时结合所述串联体。
在一些实施方案中，能够采用单链或双链分支DNA结构或双链DNA组装体来代替单链串联体。这样的结构能够例如通过杂交链反应(HCR)[11]在发夹之一上添加立足点结构域来制备(图14A)。在这种情况下，单链的立足点结构域能够从每个结构中突出，仅当它们紧密邻近时才能保持邻近度成像剂的稳定结合，而不能靠它们自身保持稳定结合(图14B)。
在一些实施方案中，能够根据实验条件和期望的应用来修改邻近度成像剂的串联体长度和杂交长度。改变杂交长度或缓冲液条件或温度能够进行结合时间的调节。串联体和邻近度成像剂上互补区域a/a*和b/b*的结合可以是瞬时的(使得平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者它们可以更强地结合(例如数分钟到数小时或更久的结合)。短的结合时间可用于邻近度成像剂的特异性但瞬时的杂交，以实现重复采样或单分子检测实验和高分辨率成像。
在一些实施方案中，除了改变结合缓冲液的条件、温度或杂交长度外，还可通过使用保护链和立足点介导的链置换[9]或需要邻近度成像剂与现有链竞争的立足点交换[10]来更特异地控制邻近度成像剂和串联体之间的相互作用。
在一些实施方案中，能够通过使用串联体中的多个正交序列同时检测多个靶标。能够在光谱上(通过使用具有不同荧光团的邻近度成像剂)或顺序地实现多重检测。通过调整简单的洗涤条件，可以通过邻近度成像剂的可编程移除来实现顺序检测。可以通过改变盐浓度、甲酰胺含量、改变温度或酶解来实现移除。还可以通过编程为在每一轮中检测不同配对的邻近度成像剂序列以成对的方式顺序检测多个靶标。
在一些实施方案中，多向相互作用检测：除了检测成对相互作用，Co-Zipper还能够被修改以检测多向相互作用。这能够通过更改设计以使邻近度探针能够仅在多个串联体紧密邻近时才稳定结合来实现。
在一些实施方案中，靶标、串联体、探针(例如抗体)和其他组分(桥，夹板等)可以一起退火，或者它们可以等温地组合在一起(例如，在室温、37℃、46℃等)。它们也可以在改善其对靶标链的特异性的条件下结合，例如使用标准的ISH(原位杂交)缓冲液(如SSCT和PBS)，通常添加甲酰胺。这种结合可以扩散地(在溶液中)进行，或者通过使用一种或多种附接到基底上的组分来进行。例如，一个串联体(具有或不具有靶标)可以与表面结合，而另一个随后与夹板或相同或不同的靶标杂交。
在一些实施方案中，能够使用在与靶标混合的溶液中扩散地或在固定于表面(珠、纸、水凝胶、玻璃、塑料、纳米颗粒)上或原位施加于靶标上的邻近度成像剂来检测串联体。
在一些实施方案中，串联体本身可以直接与抗体或其他探针缀合(即没有中间桥链)，或者能够在标记之前、同时或之后将探针上的引物延伸成串联体。
在一些实施方案中，在邻近度成像剂中可以包括诸如间隔子的额外序列修饰，以在不同配置下调节到达距离。
在一些实施方案中，还能通过使用在延伸反应期间掺入的荧光团标记的dNTP来实现荧光读出，从而使串联体本身是发荧光的。在这种情况下，邻近串联体上的荧光团之间的FRET可以用作输出[FRET1]。能够将如在HCR的情况下的类似方法应用于双链结构。
靶结合分子
在一些实施方案中，链(例如，催化链、串联体形成链和/或串联体链)能够结合(或结合至)靶结合分子。靶结合分子可以是任何生物分子，例如多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，靶结合分子是多肽。在一些实施方案中，靶结合分子是蛋白质(例如，全长蛋白质或肽)。在一些实施方案中，靶结合分子是抗体，例如单克隆抗体。术语“抗体”涵盖完整抗体和抗体片段(例如，scFv)。
靶结合分子与靶分子之间的结合相互作用可以是瞬时的(例如，平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者分子可以更稳定或牢固地结合(例如，平均停留时间在数分钟到数小时或更久的数量级上)。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10纳秒、1至50纳秒、25至100纳秒、50至250纳秒或250至1000纳秒。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10秒、1至50秒、25至100秒、50至250秒或250至1000秒。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10分钟、1至50分钟、25至100分钟、50至250分钟或250至1000分钟。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10小时、1至50小时、25至100小时、50至250小时或250至1000小时。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的结合亲和力为5nM至1000nM、5nM至500nM、250nM至750nM、500nM至1000nM、1至100μM、1至50μM、1至25μM、1至10μM或1至5μM。除了改变结合缓冲液条件外，结合亲和力和/或停留时间还能通过使用保护链和立足点介导的链置换[5]或立足点交换[6](需要靶标链与现有链竞争)来改变。
接头链
在一些实施方案中，链(例如，催化链、串联体形成链和/或串联体链)能直接或通过中间接头间接地结合靶结合分子。在一些实施方案中，所述中间接头是接头链(例如，单链核酸)。在一些实施方案中，接头链包含能够与链结合的结构域。在一些实施方案中，接头链包含结构域“X”。在一些实施方案中，接头链包含结构域“Y”。在一些实施方案中，接头链包含结构域“X”和结构域“Y”。
接头链的长度可以变化。在一些实施方案中，接头链的长度为1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，接头链的长度为10-100个核苷酸。例如，接头链的长度可以为10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，接头链的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，接头链(例如，第一和/或第二接头链)的长度小于100个核苷酸、小于50个核苷酸或为20至50个核苷酸。
接头链的结构域(结构域“X”和/或结构域“Y”)的长度可以变化。在一些实施方案中，接头链的结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，接头链的结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，接头链的结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45，46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如，结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离是1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如，结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离小于50个核苷酸。例如，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0-50、0-40、0-30、0-20、0-10、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20或5-10个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔25个核苷酸或5至15个核苷酸。
靶分子
靶分子(例如，第一靶分子或第二靶分子)可以是任何生物分子(例如，生物标志物)，例如DNA、RNA或蛋白质(例如，抗体、纳米抗体、适配体、肽标签或其他探针分子)。靶分子的其他实例包括脂质、小分子和分子嵌合体。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)存在于经固定的组织中。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)存在于溶液(例如水性缓冲液)中。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)附接于表面(例如玻璃，纸，硝化纤维素，云母等)。在一些实施方案中，靶分子是生物分子复合物的一部分。在一些实施方案中，靶分子是诊断靶分子和/或治疗靶分子。
本公开内容中包括的描绘核酸靶标和抗体靶标的检测的实施方案是出于举例说明的目的，并不旨在限制性的。靶分子的实例包括但不限于蛋白质、糖类(例如多糖)、脂质、核酸(例如，DNA、RNA，微小RNA)和小分子。靶标可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，分子靶标是生物分子。如本文所使用的“生物分子”是由活生物体产生的任何分子，包括大分子，例如蛋白质、多糖、脂质和核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)，以及小分子，例如，主要代谢物、次要代谢物和天然产物。分子靶标(特别是生物分子)的实例包括但不限于DNA、RNA、cDNA或经历逆转录的RNA的DNA产物。
在一些实施方案中，靶分子是蛋白质靶标，例如，细胞环境蛋白(例如细胞内或膜蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于纤维蛋白，例如，细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌营养不良蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌动蛋白、血影蛋白、tau、肌联蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白和胶原蛋白)以及细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、f-脊椎蛋白、皮卡丘林和纤连蛋白)；球形蛋白，例如血浆蛋白(例如血清淀粉样蛋白P组分和血清白蛋白)，凝血因子(例如补体蛋白、C1抑制剂和C3转化酶、因子VIII、因子XIII、纤维蛋白、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关的蛋白酶抑制剂、凝血酶、Von Willebrand因子)和急性期蛋白，例如C反应蛋白；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如钙黏着蛋白、室管膜蛋白、整联蛋白、Ncam和选择素)；跨膜转运蛋白(例如CFTR、血型糖蛋白D和混杂酶)，例如离子通道(例如配体门控离子通道，例如烟碱乙酰胆碱受体和GABA a受体，以及电压门控离子通道，例如钾、钙和钠通道)，同向/反向转运蛋白(例如葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)，肽激素例如胰岛素、类胰岛素生长因子和催产素，以及类固醇激素(例如雄激素、***和孕激素)；受体，例如跨膜受体(例如G蛋白偶联受体、视紫红质)和细胞内受体(例如***受体)；DNA结合蛋白(例如组蛋白、鱼精蛋白、CI蛋白)；转录调节因子(例如c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD和P53)；免疫系统蛋白(例如免疫球蛋白，主要组织相容性抗原和T细胞受体)；营养物质储存/转运蛋白(例如铁蛋白)；伴侣蛋白；和酶。
在一些实施方案中，靶分子(或上文讨论的靶结合分子)是抗体。如本文所使用的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(例如“抗原结合部分”)或其单链。术语“抗体”包括但不限于包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。抗体可以是多克隆或单克隆的；异种的，同种异体的或同基因的；或其修饰形式(例如，人源化，嵌合的)。如本文所使用的抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能能够通过全长抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341：544546，1989)；或(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，从而使它们成为蛋白单链，其中VH和VL区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人，Science 242：423 426，1988；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。这样的单链抗体也包括在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
在一些实施方案中，靶分子存在于组织样品中，任选地在经固定的组织中。在一些实施方案中，可以用温和的固定试剂或在温和的固定条件下(即，保存组织的试剂或条件)处理组织。在一些实施方案中，靶分子存在于溶液(例如水溶液)中。在一些实施方案中，靶分子附接至固体支持物或固体表面。
本公开内容的组合物和方法可以用于检测单个靶分子或多个靶分子，例如，属于相同分子复合物的多个靶分子。在一些实施方案中，多个靶分子可以是属于相同蛋白质复合物的多种蛋白质，例如，属于介体复合物或任何其他转录复合物的多种蛋白质。在一些实施方案中，多个靶分子可以是混合物中的多种抗体，例如，混合物中的两种或更多种不同的抗体。
在一些实施方案中，使用本文提供的任何方法检测两个或更多个靶标。在一些实施方案中，可以通过增加能够直接或间接结合靶分子的催化分子的数量来增加在单个反应中检测的靶标的数量。在一些实施方案中，在单个反应中检测至少2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的靶分子。在一些实施方案中，在单个反应中检测1-5、1-10、1-20、1-50或1-100个不同的靶分子。
任何两个靶标之间(或靶标或接头链的两个结构域或序列之间)的距离可以为1nm-10μm。例如，检测的任何两个分子或结构域之间的距离可以为1nm-100nm、1nm-500nm、1nm-1μm或1nm-5μm。
靶标链
在一些实施方案中，链(例如催化链、串联体形成链和/或串联体链)可以直接与靶标链(例如，DNA或RNA)结合。在一些实施方案中，靶标链包含目标序列(结构域)，链被设计成与该目标序列结合。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“X”(例如，包含第一目标序列)。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“Y”(例如，包含第二目标序列)。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“X”和结构域“Y”。
靶标链的结构域(结构域“X”和/或结构域“Y”)的长度可以变化。在一些实施方案中，靶标链的长度为1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，靶标链的结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，靶标链的结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，靶标链的结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离是1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，靶标链的两个结构域之间的距离(例如结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离小于50个核苷酸。例如，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0-50、0-40、0-30、0-20、0-10、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20或5-10个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔少于25个核苷酸或5至15个核苷酸。
核酸
应当理解，本公开内容的核酸不是天然存在的。因此，核酸可以被称为“工程化的核酸”。“工程化的核酸”是自然界中不存在的核酸(例如，至少两个核苷酸共价连接在一起，并且在某些情况下，含有磷酸二酯键，称为磷酸二酯“骨架”)。工程化的核酸包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是通过连接核酸(例如分离的核酸、合成核酸或其组合)而构建的分子，并且在一些实施方案中，能够在活细胞中复制。“合成核酸”是被扩增或化学地或通过其他方式合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其他方式修饰，但能够与天然存在的核酸分子碱基配对(也称为“结合”，例如瞬时或稳定地)的核酸。重组和合成核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。
如本文所使用的术语“互补的”是指两个核苷酸或两组核苷酸彼此精确配对/结合的能力。例如，如果第一序列或链的单个核苷酸能够与第二序列或链的相应位置处的核苷酸氢键合，则认为碱基在该位置处彼此互补。核碱基配对可包括经典的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对。
尽管工程化的核酸总体上不是天然存在的，但它可能包括野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化的核酸包含获自不同生物体的核苷酸序列(例如获自不同物种)。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸包括鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列、病毒核苷酸序列或前述序列中任何两个或更多个的组合。在一些实施方案中，工程化的核酸含有一个或多个随机碱基。
在一些实施方案中，本公开内容的工程化的核酸可以包含除磷酸二酯骨架以外的骨架。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸可包含磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-methylphophoroamidite键、肽核酸或前述键中的任何两种或更多种的组合。工程化的核酸可以是指定的单链(ss)或双链(ds)，或者工程化的核酸可以包含单链和双链序列的一部分。在一些实施方案中，工程化的核酸包含三链序列的一部分，或其他非Watson-Crick碱基配对，例如G-四联体，G-四链体和i-基序。工程化的核酸可以包含DNA(例如，基因组DNA，cDNA或基因组DNA和cDNA的组合)、RNA或杂合分子，例如，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如，人工或天然的)的任何组合，以及两种或多种碱基的任意组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。
可以使用标准分子生物学方法(参见，例如Green和Sambrook,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring Harbor Press)产生本公开内容的工程化的核酸。在一些实施方案中，使用GIBSON
其他反应组分和条件
在一些实施方案中，组合物包含和/或方法利用聚合酶，例如链置换聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶(DNAP)，例如具有DNA链置换活性的DNA聚合酶(链置换聚合酶)。“链置换”描述置换合成过程中遇到的下游DNA的能力。可以如本文所提供地使用的具有DNA链置换活性的聚合酶的实例包括但不限于phi29DNA聚合酶(例如，NEB#M0269)，大片段Bst DNA聚合酶(例如，NEB#M0275)或大片段Bsu DNA聚合酶(例如NEB#M0330)。可以使用具有链置换活性的其他聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是RNA聚合酶。
在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：补充有纯化的牛血清白蛋白(BSA)的1X反应缓冲液(例如50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT)，pH 7.5，在30℃下孵育。
在一些实施方案中，聚合酶是大片段Bst DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％
在一些实施方案中，聚合酶是Bsu DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT)，pH 7.9，在37℃下孵育。
引物交换反应组合物或系统中特定链和dNTP的浓度可以基于例如特定应用和该特定应用所需的动力学而变化。
本文所述的反应中链的浓度可以是例如5nM至1000nM。在一些实施方案中，本文所述的反应中的链的浓度是5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、5-60、5-70、5-80、5-90、5-100、5-125、5-150、5-200、10-50、10-75、10-100、10-150、10-200、25-75、25-100、25-125或25-200nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10-200、10-300、10-400、10-500、10-600、10-70、10-800、10-900或10-100nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90或100nM。反应中链的浓度可以小于5nM或大于1000nM。反应中链的浓度可以小于10nM或大于1000nM。
在一些实施方案中，在本文所述的反应中，任何两条链(例如，催化链与串联体形成链，或第一串联体链与第二串联体链)的比例可以为约1：1。
反应(例如，ProPER或Co-Zipper)中特定类型的链的数目是非限制性的。反应可包含例如1-1010条链。在一些实施方案中，反应包含1-10、1-102、1-103、1-104、1-105、1-106、1-107、1-108、1-109、1-1010或更多条特定类型的链(例如，串联体形成链、催化链和/或串联体链)。在一些实施方案中，反应包含1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95或10-100条链。在一些实施方案中，反应包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、28、19、20、21、22、23、24或25条链。
例如，可以通过改变温度、时间、缓冲液/盐条件和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)的浓度来控制反应(例如，引物交换反应)的动力学。聚合酶像大多数酶一样，对许多缓冲液条件敏感，包括离子强度、pH和存在的金属离子类型(例如，钠离子对镁离子)。因此，进行反应的温度可以在例如4℃至65℃(例如4℃、25℃、37℃、42℃或65℃)之间变化。在一些实施方案中，进行反应的温度为4-25℃、4-30℃、4-35℃、4-40℃、4-45℃、4-50℃、4-55℃、4-60℃、10-25℃、10-30℃、10-35℃、10-40℃、10-45℃、10-50℃、10-55℃、10-60℃、25-30℃、25-35℃、25-40℃、25-45℃、25-50℃、25-55℃、25-60℃、25-65℃、35-40℃、35-45℃、35-50℃、35-55℃、35-60℃或35-65℃。在一些实施方案中，反应在室温下进行，而在其他实施方案中，反应在37℃下进行。
反应可以进行(孵育)30分钟(min)至24小时(hr)。在一些实施方案中，反应进行10min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、7hr、8hr、9hr、10hr、11hr、12hr、18hr或24hr。
脱氧核糖核苷酸(dNTP)是驱动本文的反应(例如，引物交换反应)的“燃料”。因此，在一些实施方案中，反应的动力学取决于反应中dNTP的浓度。初次反应中的dNTP的浓度可以为例如2-1000μM。在一些实施方案中，反应中的dNTP浓度为2-10μM、2-15μM、2-20μM、2-25μM、2-30μM、2-35μM、2-40μM、2-45μM、2-50μM、2-55μM、2-60μM、2-65μM、2-70μM、2-75μM、2-80μM、2-85μM、2-90μM、2-95μM、2-100μM、2-110μM、2-120μM、2-130μM、2-140μM、2-150μM、2-160μM、2-170μM、2-180μM、2-190μM、2-200μM、2-250μM、2-300μM、2-350μM、2-400μM、2-450μM、2-500μM、2-600μM、2-700μM、2-800μM、2-900μM或2-1000μM。例如，反应中的dNTP浓度可以为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、105μM、110μM、115μM、120μM、125μM、130μM、135μM、140μM、145μM、150μM、155μM、160μM、165μM、170μM、175μM、180μM、185μM、190μM、195μM或200μM。在一些实施方案中，pr反应中的dNTP浓度为10-20μM、10-30μM、10-40μM、10-50μM、10-60μM、10-70μM、10-80μM、10-90μM或10-100μM。
在一些实施方案中，使用dNTP变体。例如，本文的反应可使用热启动/clean ampdNTP、硫代磷酸酯dNTP或荧光dNTP。可以使用其他dNTP变体。由于一些经修饰的dNTP相比正常(未经修饰的)DNA-DNA结合不太有利，因此催化链反向置换过程可能会随着它们的使用而增加。类似地，在一些实施方案中，可以使用由不同类型的核酸(例如，LNA、RNA或散布的修饰碱基，例如甲基dC或Super T IDT修饰)组成的催化链，以通过形成相对于催化链而言比合成的引物结构域更强的键来提高反应速度。
实施例
实施例1：邻近度引物交换反应(ProPER)的实验验证。
用于检测生物分子(例如用于疾病诊断或组织成像)的令人信服的方法要求反应应当(1)对目标靶标高度特异，并且(2)足够灵敏以检测少量或单拷贝的生物分子。我们提出了在实现这两个目标方面均具有独特优势的邻近度引物交换反应(ProPER)。通过依靠将多条链成功靶向至单个目标靶标，能够显著降低检测背景。此外，在串联过程中反复检查这种邻近度，进一步确保特异性相互作用。通过ProPER串联产生的长链能用作荧光分子的支架，使得ProPER能够用作信号放大形式。这允许潜在地将数十个或更多个荧光团聚集到单个靶生物分子上，产生随后能在显微镜或荧光扫描仪上直接可视化的信号。因此，该方法高度特异且高度灵敏，并且有可能优于现有的用于检测和成像生物分子的方法。
为了通过实验验证该系统，执行了优化过程(图1A-1B)。串联体形成链和催化发夹组分位于相同核酸(“夹板”)链上，在它们的杂交区域之间具有10个核苷酸的接头，并在溶液中保持空间邻近性(图1A)。将2nM Cy5标记的串联体形成链与2nM催化发夹链和2nM夹板链(如果存在)组合。在进行PER串联之前，加入Bst链置换聚合酶和适当的dNTP持续1小时，以及然后将聚合酶在80℃下热灭活20分钟。然后在15％TBE-尿素PAGE变性凝胶上运行8个反应，并在Cy5通道下扫描以可视化串联。反应在补充2.5mM至10mM最终浓度的镁(MgSO4)的1xPBS缓冲液中进行，并且反应在37.0℃至45.8℃运行，如凝胶泳道下方所示(图1B)。在理想条件下，不存在夹板链(靶标)则不产生串联，而包含夹板链导致产生长的串联体。测试的第四个条件，具体是在45.8℃且存在2.5mM镁的情况下，在不存在夹板的情况下几乎不产生引物的串联(左起第四个泳道)，而存在夹板的相同条件产生几百个碱基长的长串联体(凝胶中最右边的泳道)。
实施例2：ProPER中的接头距离评估
为了评估系统在一定范围的接头距离上的灵活性，进行了初始测试，其中引物和发夹组分的杂交区域(图1A中的结构域Y*和X*)之间的距离在0至18个核苷酸之间变化(图2A)。将2nM Cy5标记的串联体形成链与2nM催化发夹链和2nM夹板“靶标”链(如果存在)组合。在进行PER串联之前，加入Bst链置换聚合酶和适当的dNTP持续1小时，以及然后将聚合酶在80℃下热灭活20分钟。然后在15％TBE-尿素PAGE变性凝胶上运行6个反应(加上最后一个仅具有各自在1xPBS中稀释至2nM的引物和发夹的泳道的基准反应)，并在Cy5通道下进行扫描以可视化串联。反应在补充2.5mM最终浓度的镁(MgSO4)的1xPBS缓冲液中进行，并且反应在45.8℃下运行。对于所测试的5个距离的范围，在特定的凝胶实验条件下，串联效率被证明非常高且彼此之间没有区别(图2B)。具体而言，在没有夹板链存在的情况下发生的串连可忽略不计，而所有测试的夹板都产生了非常长(数百个碱基)的串联体。因此，该系统在一定范围的邻近度距离内具有灵活性。
实施例3：ProPER的应用
ProPER的应用在固定的靶标上在溶液中扩散地进行以用于体外诊断，并在固定于样品的链上原位进行以用于低背景荧光成像。首先，邻近度引物交换反应(ProPER)用于检测核酸靶标(DNA/RNA)，其中串联体形成链和催化发夹链被设计为仅在靶标(“夹板”)链存在的情况下共定位(图3A)。靶序列在溶液中测试、固定并原位检测。接下来，ProPER用于靶向与靶向目标蛋白质的抗体缀合的桥链(图3B)。第三，ProPER用于非常特异地检测单个蛋白质，其中串联体形成链与靶向该蛋白质的一种抗体连接，并且催化发夹与靶向该蛋白质上的不同位点的另一种抗体连接(图3C)。最后，使用ProPER检测两种蛋白质的邻近度，其中串联体形成链和催化发夹组分定位于靶向相同生物分子复合物中的蛋白质的抗体(图3D)。
实施例4：ProPER中的荧光读出
由ProPER产生的串联体与互补的荧光成像链杂交，例如使用图4所示的双结构域a*a*链。荧光信号的强度反映了所产生的串联体的长度。荧光还批量地可视化(例如，当将靶标和串联体固定在表面上并测量荧光的总水平时)或使用显微镜可视化以揭示串联体的空间定位。
实施例5：使用ProPER的生物标志物检测。
为了检测生物标志物，将一种组分(串联体形成链或催化发夹)附接到表面(其可以是纸、玻璃、塑料或另一种基底)上。然后，剩余的组分结合到该基底结合的组分上。例如，可以将血清或其他含有目标核酸分析物的流体与催化发夹预混合，或者可以通过在基底上的一系列结合和洗涤步骤顺序引入链。一旦形成了引物-靶标-发夹复合物，就可以通过抽吸和重新悬浮将额外的发夹链洗掉。接下来，可以进行ProPER以产生串联体，各自针对已结合的每个目标靶分子。引入荧光成像链以结合串联体以及然后将多余的未结合的成像链洗掉。最后，使用两种策略之一读取荧光输出：批量荧光或斑点计数。对于批量荧光，能够使用基于LED或激光的扫描仪(例如酶标仪)在表面上读取总荧光水平。可替代地，能够例如使用显微镜或自动计数器来计数单个荧光斑点的数量，并且能够将斑点的密度定量地映射到原始分析物的浓度估计值(图5)。
实施例6：使用ProPER进行多重邻近检测。
ProPER可用于评估是否能够检测任意数量的邻近发夹，以进一步提高靶标结合的特异性。实现这种增加的特异性的一种方法在图6A-6B中显示。图6A证明了使用两个催化发夹来生成5’-a b a b…a b-3’形式的串联体，其与互补于重复单元(例如5’-b*a*-3’)的荧光成像链结合以产生荧光输出。图6B显示了具有3个发夹的类似设置，其产生5’-a b c a bc…a b c-3’形式的串联体。将荧光链与序列5'-c*b*a*-3'杂交实现串联体的特定荧光输出。发夹的数量可以任意增加，以便对于成功且重复的串联在空间上邻近的分子数量为n+1，其中n表示发夹的数量。
实施例7：使用柔性的PER串联体接头的邻近度依赖性PER
使用ProPER方法的变型和长的柔性接头进一步证实了邻近检测(图7A-7B)。首先，使用重复的体外PER反应在42聚体的“桥”链的3'末端与第一串联体形成链生成长的串联体(图7A)。然后，引入逐步的PER发夹以将不同的第二PER引物序列附加到这些PER串联体的3'末端。通过将含有42聚体桥序列的Cy3标记的成像链与延伸的PER串联体和催化发夹链(两者均包含互补的42聚体序列以使它们与串联体形成链杂交)的混合物组合来进行原位杂交(图7B)。这导致PER串联体形成链和催化发夹(其与沿着基因组基因座平铺的链结合)的混合物。然后，如前所述，通过将聚合酶和dNTP引入缓冲液中原位进行邻近度依赖性PER反应。然后在成像之前杂交靶向在串联体形成链上的第一个(体外)和第二个(原位)引物结构域序列的荧光标记的成像链。邻近度依赖性PER的此变型(其使用在邻近度依赖性PER引物链上的柔性接头)具有多个优点。首先，由于可以通过改变体外PER条件来编程接头长度，因此引物能够达到的距离可以允许测量不同的距离。而且，能够使用与邻近度依赖性PER串联体序列相同的荧光成像剂结合方法对该接头进行成像，使得能够同时可视化基础探针序列和邻近度依赖性反应。这能够用于双色共定位以验证仅在还存在探针的情况下才会发生邻近度依赖性PER信号，并告知与发夹不邻近的探针在何处结合。可替代地，不同大小的接头能够通过化学DNA合成进行预合成，其中引物位点位于3’处，但是，在这一步骤中使用PER使合成更加灵活以用于满足多种需求，并且更具成本效益。
图7A-7B所示的实验的结果显示于图8A-8C中。使用靶向沿人染色体X分布的18200kb斑点的Cy3标记的FISH探针(以黄色显示)，并且仅针对靶向这些斑点中的一个(斑点X)的探针进行邻近度依赖性PER反应(图8A)。用于代表性染色体分布的不同通道组合和间期细胞显示在图8B-8C。正如预期的那样，绿色(488通道，主要的体外PER串联信号)和品红色(647通道，邻近度依赖性原位PER串联信号)共定位在一个区域中。此外，该区域包含在较大的黄色信号(Cy3通道，整个X染色体信号)中，进一步验证了PER信号在正确的染色体上可见。
实施例8：使用分支策略的邻近度依赖性PER。
使用分支策略的邻近度依赖性PER的另一个变型(其能够将许多串联体形成链或催化发夹定位在每个探针序列上)已通过实验验证(图9A-9B)。类似于上面图7A-7B中描述的先前描述的体外合成策略，使用体外PER反应将串联体形成链延伸成长的串联体(图9A)。在沿靶RNA序列平铺的交替串联体形成链上合成了两个不同的串联体序列。这些序列之一充当要结合的在3'末端包含第三引物的序列的支架。另一个序列具有互补催化发夹链的许多结合位点。进行原位邻近度依赖性PER以延伸第三引物结构域序列，并将荧光标记的成像链与这些合成的链杂交。选择Cbx5 mRNA转录物作为靶标，并在成像链上用Alexa 647染料在其中读出邻近度依赖性信号(图9B)。如预期的那样，显示分布在整个细胞质中的RNA点的邻近度依赖性信号仅在实验条件下可见(647)，而在阴性对照条件下(仅包含串联体形成链)不可见。
实施例9：用于重合检测的邻近度依赖性PER
如图10A-B所示的基于重合检测的信号放大通过使用携带以下两个对接位点的DNA缀合的抗体在细胞中对蛋白质可视化进行验证：i)用于捕获串联体形成链，和ii)用于捕获催化链/发夹。在示范中，靶向定位核膜的核纤层蛋白A(图10A)或定位线粒体的TOM20(图10B)。抗体缀合至25聚体“桥”链(催化发夹捕获链通过柔性接头链的对接位点)，然后缀合至42聚体桥链(串联体形成链捕获链通过柔性接头的对接位点)。通过将串联体形成链和催化链的捕获链与Cy5标记的串联体形成链组合来进行原位杂交。然后，如前所述，通过将聚合酶和dNTP引入缓冲液中，进行邻近度依赖性PER反应。然后在成像之前杂交靶向扩增的串联体的Atto565-Fluor成像剂。在催化链和串联体形成链以及具有结合位点的抗体均存在的情况下，Cy5通道(绿色，引物上的荧光团)和ATTO565通道(品红色)(代表邻近度依赖性原位PER串联体信号)仅在进行邻近度延伸的样品中可以一起看到。当阴性对照实验中省略抗体或捕获链时，未检测到串联。在存在引物捕获序列的条件下见到了引物的荧光信号。显示DAPI信号以证明仅当两条链均被捕获时才存在被特异性标记的细胞。除省略对照链外，对于所有样品均采用相同的反应条件。
邻近度依赖性PER的此变型促进重合检测以减少可能由非特异性探针或SNA链结合产生的非特异性背景，并提高成像的信噪比。
实施例10.Co-Zipper策略
低信号和高背景是妨碍检测系统灵敏度和准确性的重要限制。创建多个输出位置的信号放大方法(例如具有重复的荧光团结合位点的串联体)能够提供信号的改善，但由于探针的非特异性，通常也导致较高的背景和/或较低的准确性。通过依赖于两个结构域的协同结合与单个结构域之间的区别，结合两个重合的串联体的荧光团标记的成像链能用于以极高的特异性将许多荧光团聚集到该区域。通过依赖于串联体的邻近度实现低背景，因为两个串联体均错误定位到相同(亚衍射极限)位置的可能性极低。这种高特异性与通过将成像剂重复结合到串联体而实现的线性扩增的组合使得Co-Zipper能够应用于高度特异和高度灵敏的生物标志物检测(诊断)和成像。
在此，提出了一种涉及AND-门逻辑的基于邻近度的分子检测法，其中两个组分需要紧密邻近才能生成荧光信号(Co-Zipper策略)。理想情况下，此AND-门将应用于检测的每个步骤以获得最大的特异性。对于串联蛋白信号放大，这可以通过荧光团缀合的邻近度成像链共检测两条串联体链来实现，所述荧光团缀合的邻近度成像链仅在结合两个串联体(分别由重复序列a和b组成)时才稳定地杂交(图11A)。为了实现结合两个串联体所需的邻近度，包含短(8-10nt)的a*和b*结构域的成像链被设计为弱结合每个串联体，而以稳定结合的方式结合串联体对。以这种方式，每个荧光团标记的链的协同结合需要两个串联体的邻近，从而允许重合检测和放大的信号。这种拉链状的共检测结构的形成构成了Co-Zipper策略的基础。Co-Zipper还可用于靶向与靶向目标蛋白质的抗体缀合的夹板桥链。夹板桥容纳紧密邻近的两个串联体，所述两个串联体被同时检测以降低背景(图11B)。为了通过使用两种抗体(每种抗体携带结合不同串联体的桥，靶向蛋白质上的不同位点或修饰)非常特异地检测目标靶标(例如单个蛋白)，还使用了Co-Zipper(图11C)。为了使用Co-Zipper评估两种蛋白质的邻近度，可以使用靶向相同生物分子复合物中的蛋白质的抗体。Co-Zipper的所有形式均可在溶液中、在固定的靶标上进行以用于体外诊断，以及在固定至样品的链上原位进行以进行低背景高信号荧光成像。
对于荧光成像，Co-Zipper能用于三个主要目的：(1)抑制非特异性探针背景：在次级探针后跟随主要探针用于检测的情况下，由于来自两者的非特异性背景而发生错误传播。可以通过只有在两个次级探针同时结合时才能进行检测来实现背景抑制。两个探针都需要紧密邻近地存在以产生信号(图11B)。(2)具有降低的背景和增加的特异性的所需靶标的检测：这能通过同时用两个主要探针标记相同靶分子来实现。两个探针都需要紧密邻近地存在以产生信号(图11C)。(3)在溶液中或在其天然环境中共定位的相互作用伴侣的检测：这是通过使用靶向不同生物分子的不同探针来实现的，所述探针需要同时紧密邻近地存在以产生信号(图22D)。
实施例11.Co-Zipper的原位应用
使用靶向小鼠胚胎成纤维细胞的主要卫星重复序列中的两个重复序列的FISH探针证明了Co-Zipper的原位应用。这两个重复序列在其3'末端附加有PER引物，并在体外使用PER预延伸为两个正交的串联体。然后将所得的串联体用于使用成像链的原位杂交实验，该成像链只有在与两个串联体结合时才产生强信号，因为成像链被设计为以瞬时/弱亲和力结合每个单个串联体，如阴性对照所示(图12)。
实施例12.Co-Zipper的原位应用
两个核纤层蛋白Lamin A和B被一抗结合，然后被与两个正交桥核酸序列缀合的同源二抗结合。使用PER在体外将两个附加有与桥序列互补的序列的正交引物预延伸成串联体。免疫染色后，将串联体同时应用于样品上并与桥杂交。随后添加成像链以揭示两种蛋白质共定位的位置(即核纤层)。当省略一种抗体时未观察到信号。额外的对照使用稳定结合单个串联体的成像剂，并且其与结合两个串联体的成像链获得的非常特异的核信号相比，在细胞质中显示明显的染色(图13)。
实施例13.Co-Zipper的应用
可以采用双链DNA组件。这样的结构能够例如通过杂交链反应(HCR)[19]在发夹之一上添加立足点结构域来制备(图14A)。将DNA的起始链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链式反应，其中发夹形成长的双链串联体。通常，将荧光团缀合到发夹上提供线性扩增。对于Co-Zipper改编，在发夹之一中附加额外的立足点结构域(序列a)，而不是荧光团。在这种情况下，允许单链立足点结构域从每个结构中突出，以只有在它们彼此紧密邻近时才能保持邻近度成像链的稳定结合。通过邻近度成像剂(a*+b*)使得能够对由杂交链反应(HCR)形成的双链组件进行共检测。从双链HCR产物中突出的单链立足点结构域(a和b)只有在两者彼此紧密邻近时才保持邻近度成像链的稳定结合(图14B)。
参考资料
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数值之前的术语“大约”和“基本上”是指所述数值的±10％。
在提供值的范围的情况下，本文具体考虑和描述了该范围的上端和下端之间的每个值。
具体实施方式
图1A-1B提供了邻近度引物交换反应(ProPER)的实验验证。图1A是示意图，其中在结构域“X”和“Y”之间具有10个核苷酸的接头区域的靶标链(也称为夹板链)用作基底以共定位包含引物“a”的串联体形成链与催化链。图1B是在Cy5通道下扫描的TBE-尿素PAGE变性凝胶，以可视化使用ProPER进行的串联。
图2A-2B提供了接头距离对ProPER的效用的影响的评估。图2A是示意图，其中在结构域“X”和“Y”之间具有可变长度(0至18个核苷酸)的接头区域的靶分子用作基底以共定位包含引物“a”的串联体形成链与催化链。图2B是在Cy5通道下扫描的TBE-尿素PAGE变性凝胶，以可视化使用ProPER进行的串联。结构域X和结构域Y之间的距离为0、5、10、15和18个核苷酸。
图3A-3D提供了显示ProPER的示例应用的示意图。图3A显示了用于检测核酸靶标(DNA/RNA)的ProPER的实例，其中串联体形成链和催化链被设计为仅在靶标链存在的情况下共定位。图3B显示了用于靶向缀合至结合至目标蛋白质的抗体的接头链(也称为桥链)的ProPER的实例。图3C显示了用于检测单个靶蛋白的ProPER的实例。串联体形成链与结合靶蛋白的一种抗体连接，催化链与结合相同靶蛋白的不同区域(例如表位)的另一种抗体连接。图3D显示了ProPER的一个实例，其用于检测例如在相同生物分子复合物中的两个不同靶蛋白之间的相互作用。串联体形成链与结合一种靶蛋白的一种抗体连接，催化链与结合另一种靶蛋白的另一种抗体连接。
图4是示意图，其显示了ProPER产生的串联体能够随后与互补的荧光成像链杂交，例如与所示的双结构域a*a*链杂交。荧光信号的强度反映了所产生的串联体的长度，并且可以将荧光可视化，例如，批量地(例如，可以将靶标和串联体固定在表面上，并测量荧光的总水平)或使用显微镜观察以揭示串联体的空间定位。
图5是显示使用ProPER的生物标志物检测方法的示意图。
图6A-6B提供了显示ProPER在多重邻近检测中的使用的示意图。图6A是示出通过使用邻近串联体形成链的其他发夹而特异性实现的靶结合的示意图。例如，位于“a”引物结构域的两个发夹可能产生包含序列“a”-“b”的重复序列的串联体。图6B是显示使用三个发夹来产生具有序列“a”-“b”-“c”的重复序列的串联体的示意图。发夹的数量能够进一步增加，以获取更多信息和特异性。
图7A-7B提供了使用柔性PER串联体接头的邻近度依赖性PER。图7A是展示使用重复的体外PER以产生具有一条串联体形成链的长串联体，随后使用逐步的PER发夹以将新的串联体形成链序列附加到该串联体上的示意图。图7B是显示FISH反应的示意图，该反应结合了包含42聚体的“桥”突出端的探针序列与互补的体外制备的PER串联体和催化发夹链。探针沿着靶核酸以平铺的方式结合到靶区域，其中一些结合到催化发夹链，而另一些结合到串联体。然后进行邻近度依赖性的PER以延伸串联体形成链，并且将荧光团成像剂与该两种串联体序列杂交以进行成像。
图8A-8C提供了具有柔性PER串联体接头的邻近度依赖性PER的荧光成像结果。图8A显示了使用如图7A-7B中所述的体外PER随后邻近度依赖性原位PER策略靶向总共18个中的一个200kb斑点(斑点X)。下方的Cy3标记的探针杂交至斑点X以及剩余的17个200kb斑点，以照亮整个染色体。所有DNA使用DAPI成像。图8B-8C是代表性的视野，其显示了488和647通道的预期的共定位。它们进一步显示了在较大的Cy3标记的染色体内该共定位区域的定位。
图9A-9B提供了使用邻近度依赖性PER的分支策略。图9A是显示用交替序列平铺的体外合成的探针串联体的示意图，所述交替序列用作PER引物和发夹结合链的支架以将许多引物和发夹定位在彼此附近。然后使用邻近度依赖性PER来创建新的邻近度依赖性的串联体序列，其能够与荧光标记的成像链杂交。图9B显示了在固定的EY.T4细胞中使用靶向Cbx5 mRNA的探针的分支邻近度依赖性PER策略的实验验证。PER信号在647通道中可视化，并且DAPI染色实现细胞核的可视化。比例尺：10微米。
图10A-10B提供了用于相同靶标的重合检测的邻近度依赖性PER的荧光成像结果，如在HeLa细胞培养物中使用细胞蛋白成像所证明的。图10A显示了通过一抗和二抗对核纤层蛋白A的可视化。第一行显示了来自荧光引物的Cy5信号。中间一行显示了来自结合邻近度延伸的串联体的成像剂的ATTO565信号。下面一行显示了两个图像(Cy5，ATTO565)和DAPI的覆盖图。比例尺：20μm。图10B显示了通过一抗和二抗对TOM20的可视化。这些行的组织方式如图10A所示。
图11A-11D提供了显示Co-Zipper的示例应用的示意图。图11A显示了用于检测核酸靶标(DNA/RNA)的Co-Zipper的实例，其中串联体形成链和催化链被设计为仅在靶标链存在的情况下共定位。图11B显示了用于靶向与结合目标蛋白质的抗体缀合的接头链(也称为桥链)的Co-Zipper的实例。图11C显示了用于检测单个靶蛋白的Co-Zipper的实例。第一串联体链与结合靶蛋白的一种抗体连接，第二串联体链与结合相同靶蛋白的不同区域(例如表位)的另一种抗体连接。图11D显示了用于检测例如在相同生物分子复合物中的两个不同靶蛋白之间的相互作用的Co-Zipper的实例。第一串联体链与结合一种靶蛋白的一种抗体连接，第二串联体链与结合另一种靶蛋白的另一种抗体连接。
图12显示了用于在小鼠胚胎成纤维细胞中使用靶向重复序列的不同片段的DNA原位杂交探针检测主要卫星重复序列的Co-Zipper的应用。最上面一行的左图和中图显示了阴性对照，其中仅一种携带FISH探针的串联体被杂交，然后应用邻近度成像剂。最上面一行的右图显示了当两个探针紧密邻近地存在时，来自邻近度成像剂的信号。下面的一行显示了阴性对照(左图)，其中在添加邻近度成像剂和共定位阳性对照(中图和右图)以及随后用互补成像剂(与结合两种串联体的成像链相反)检测每个串联体之前，省去两种FISH探针。
图13显示了用于在固定的HeLa细胞上使用DNA缀合的小鼠和兔二抗检测相互作用蛋白核纤层蛋白A和核纤层蛋白B的Co-Zipper的应用。最上面一行的左图和中图显示了阴性对照，其中仅结合单一抗体，然后应用邻近度成像剂。最上面一行中的右图显示了在两种抗体存在的情况下来自邻近度成像剂的信号。由于两个靶标在核膜中的共定位，因此仅可见核信号。下面的一行显示了阴性对照(左图)，其中在添加邻近度成像剂和共定位阳性对照(中图和右图)以及随后用互补成像剂(与结合两种串联体的成像链相反)检测每个串联体之前，省去两种二抗。
图14A-14B是展示在Co-Zipper中杂交链反应(HCR)的效用的示意图。图14A是HCR的示意图。将DNA的起始链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链反应，其中发夹形成长的双链串联体。通常，将荧光团缀合到发夹上提供线性扩增。对于Co-Zipper改编，在发夹之一中附加额外的立足点结构域(序列“a”)，而不是荧光团。图14B是显示了由邻近度成像剂(“a*”+“b*”)实现的由HCR形成的双链组件的共检测的示意图。延伸出双链HCR产物的单链立足点结构域(“a”和“b”)只有在两个结构域彼此紧密邻近时才能保持与成像链的稳定结合。
发明详述
如本文所使用的“链”是单链(未配对)核酸(例如，DNA和/或RNA)。本文提供的任何链(例如，催化链，串联体形成链，第一串联体链，第二串联体链，接头链，引物链和/或成像链)的长度可以变化。在一些实施方案中，链的长度是5-10000个核苷酸(5nm-10μm)。例如，链的长度可以为5-10000、5-5000、5-1000、5-500、5-450、5-400、5-350、5-300、5-250、5-200、5-150、5-100、5-50、10-10000、10-5000、10-1000、10-500、10-450、10-400、10-350、10-300、10-250、10-200、10-150、10-100、10-50、20-10000、20-5000、20-1000、20-500、20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-10000、30-5000、30-1000、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-10000、40-5000、40-1000、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-10000、50-5000、50-1000、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-10000、60-5000、60-1000、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-10000、70-5000、70-1000、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-10000、80-5000、80-1000、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-10000、90-5000、90-1000、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-10000、100-5000、100-1000、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
本文提供的任何链可以用能够直接检测链(例如，通过荧光显微镜或其他成像方法)的分子进行修饰。此类“修饰分子”的非限制性实例包括荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺。
“结构域”仅仅是较长核酸内的连续核苷酸片段的定义。因此，链可具有多个结构域。本文提供的任何结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，结构域(例如，茎结构域，环结构域，引物结构域，结构域“a”，结构域“a*”，结构域“X”，结构域“X*”，结构域“Y”和/或结构域“Y*”)的长度为3-100个核苷酸。例如，结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48、49或50个核苷酸。
应当理解，如本文所提供的结构域可以通过互补核苷酸碱基配对彼此结合(杂交)。因此，本文提供的任何一个实施方案的结构域“a”可以包含与结构域“a*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列。类似地，本文提供的任何一个实施方案的结构域“b”可以包含与结构域“b*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“w”可以包含与结构域“w*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“z”可以包含与结构域“z*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“1”可以包含与结构域“1*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“2”可以包含与结构域“2*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“3”可以包含与结构域“3*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“4”可以包含与结构域“4*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“X”可以包含与结构域“X*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列；本文提供的任何一个实施方案的结构域“Y”结构域可以包含与结构域“Y*”的核苷酸序列互补并因此能够与之结合的核苷酸序列。
邻近度引物交换反应(ProPER)
邻近度引物交换反应(ProPER)利用依赖于串联体形成链和催化链的空间邻近度的串联反应，当共定位时，它们相互作用以产生长的局部的串联体。串联体的产生指示固定的靶标的存在或两个或多个固定的靶标之间的相互作用的存在。在一些实施方案中，基于邻近度的检测的操作依赖于反应条件，例如盐和温度。其他条件(例如串联体形成链和催化链结合的区域(例如，图1A-1B中的结构域“Y*”和“X*”)之间的距离)也会影响串联效率。
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子，包含具有茎和环的发夹的催化链，其中所述催化链能够与所述第一靶结合分子结合，包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子结合，以及能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链。
本公开内容的其他方面提供了一种组合物，其包含：第一链，其包含结构域“X*”、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“a”；第二链，其包含结构域“Y*”和结构域“a”；经标记的成像链，其包含第一结构域a*和第二结构域a*，其中结构域“X*”、结构域“Y*”和结构域“a*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”和结构域“a”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于靶标链上，和结构域“Y”位于靶标链上。
本公开内容的其他方面还提供了一种组合物，其包含：(a)经标记的探针链，其中每个探针链包含结构域“a”和结构域“b”，(b)串联体链，其中每个串联体包含结构域“b*”、一组串联重复序列和引物结构域，(c)催化链，其中每个催化链包含结构域“b*”、茎和环，并且其中所述引物结构域包含与所述茎的序列互补的序列，(d)第一经标记的成像链，其包含与所述串联体链的串联重复序列互补的序列，(e)第二经标记的成像链，其包含与所述串联体链的引物结构域互补的序列，任选地(f)聚合酶，任选地链置换聚合酶，和/或dNTP，以及任选地(g)包含结构域“a*”的靶标链，其中结构域“a”和结构域“b”各自包含分别与结构域“a*”和结构域“b*”的序列互补的序列。
催化链
在一些实施方案中，催化链包含具有茎(茎结构域)和环(环结构域)的发夹。即，催化链是通过茎上的分子内结合形成发夹状的单链核酸。图1A提供了在5’至3’方向上包含结构域“a”、环、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“X*”的催化链的实例。结构域“a”内的核苷酸序列与结构域“a*”内的核苷酸序列互补，因此结构域“a”能够与结构域“a*”结合(杂交)以形成具有中间有环的茎。
催化链和催化链内的结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，催化链的长度是20-500个核苷酸。例如，催化链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，催化链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
茎的长度可以变化。在一些实施方案中，茎的长度为3-100个核苷酸。例如，茎的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，茎的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为3-100个核苷酸。例如，环的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，环的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方案中，催化链包含终止聚合的分子或修饰。通过链置换聚合酶的串联体形成链(与催化链结合)的引物结构域的延伸通过所述催化链中终止聚合的分子或修饰的存在而终止。终止聚合的分子或修饰(“终止子”)通常位于催化分子的茎结构域中，使得聚合终止通过所述茎结构域的所述引物的延伸。对于以发夹形式布置的催化链，终止聚合的分子或修饰可以位于所述茎结构域和所述环之间。在一些实施方案中，所述终止聚合的分子是合成的非DNA接头，例如三甘醇间隔子，例如Int Spacer 9(iSp9)或Spacer 18(Integrated DNA Technologies(IDT))。应当理解，可以如本文所提供地使用任何终止通过聚合酶的聚合的非天然接头。此类分子和修饰的其他非限制性实例包括三碳键(/iSpC3/)(IDT)、ACRYDITETM(IDT)、腺苷酰化、叠氮化物、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG(IDT)、I-LINKERTM(IDT)和3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)及其变体。通常但并非总是如此，短的接头(例如，iSp9)导致更快的反应时间。
在一些实施方案中，所述终止聚合的分子是单个或成对的非天然核苷酸序列，例如iso-dG和iso-dC(IDT)，它们分别为胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体。Iso-dC将与Iso-dG碱基配对(氢键)，但不与dG碱基配对。类似地，Iso-dG将与Iso-dC碱基配对，但不与dC碱基配对。通过成对地在所述发夹的相对侧掺入这些核苷酸，在所述终止子位置处，所述聚合酶将被终止，因为它在溶液中没有互补的核苷酸添加到该位置。
在一些实施方案中，通过将反应中的dNTP浓度(例如，从200μM)降低至100μM、10μM、1μM或更小来改善“终止子”修饰的执行效率。
包含终止聚合的分子或修饰通常在催化链的茎结构域中产生“凸起”，因为分子或修饰未配对(与另一个分子结合)。因此，在一些实施方案中，催化分子被设计成包括(与所述分子或修饰相对地)单个核苷酸(例如胸腺嘧啶)、至少两个相同的核苷酸(例如胸腺嘧啶二聚体(TT)或三聚体(TTT))或非天然的修饰。
串联体形成链
在一些实施方案中，串联体形成链包含引物结构域的串联重复序列。序列的“串联重复序列”是特定序列的相邻重复。例如，序列ATCGATCG是ATCG的串联重复序列。串联体形成链中的串联重复序列的数目(例如，引物结构域的数目)可以变化。在一些实施方案中，串联体形成链包含2-100个串联重复序列。例如，串联体形成链可包含2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联体形成链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21，22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46，47、48、49或50个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。在一些实施方案中，串联体形成链包含引物结构域的两个或更多个串联重复序列。
串联体形成链和串联体形成链内的引物结构域的长度可以变化。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为1nm-10μm。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为20-500个核苷酸。例如，串联体形成链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，串联体形成链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
在一些实施方案中，引物结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，引物结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，引物结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方案中，串联体形成链的引物结构域能够与催化链的茎结合，从而使所述发夹线性化。例如，参考图1A，串联体形成链的引物结构域“a”(左)能够与催化链的茎的结构域“a*”结合，并且在存在链置换聚合酶和dNTP的情况下，所述催化链“打开”(茎区域解离)，并作为将结构域“a”的串联重复序列附加到所述串联体形成链上的模板。所述催化链的茎随后重组。此循环重复以形成结构域“a”的串联重复序列的串联体。
探针链
在一些实施方案中，探针链包含可检测标记(例如荧光团)、与靶标链结合的结构域和与串联体链结合的结构域。在一些实施方案中，探针链包含结构域“a”和结构域“b”，使得所述探针链与包含结构域“a*”的靶标链结合，并与包含结构域“b”的串联体链结合。探针链的长度可以变化。在一些实施方案中，探针链的长度为3-50个核苷酸。例如，探针链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，探针链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
ProPER成像链
在一些实施方案中，成像链是短链，其能够与串联体形成链的串联重复序列结合(参见，例如图4)。在一些实施方案中，成像链包含可检测标记，例如荧光团。成像链的长度可以变化。在一些实施方案中，成像链的长度为5-200个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3-50个核苷酸。例如，成像链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，成像链包含第一结构域“a*”和第二结构域“a*”，使得所述成像链与包含结构域“a”的串联重复序列的串联体形成链结合。
可以在本文中用作例如探针链和/或成像链的标记的荧光团的实例包括但不限于羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexa fluor、氨基香豆素、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexafluor 488、荧光素FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexafluor 546、Alexa fluor 555、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、别藻蓝蛋白、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7和Cy7.5。可以使用其他荧光分子。
在一些实施方案中，成像链(或本文所述的任何其他链)可以被选自以下的部分标记(例如，连接)：荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、酪酰胺。本文还涵盖其他可检测的修饰基团。
成像链可以例如直接在串联体或串联体形成链上检测，或可以通过去杂交作用(例如，通过修饰缓冲离子成分或添加化学试剂(例如甲酰胺或DMSO)或通过加热)释放以通过适合于特定修饰的各种读出方法进行检测。检测方法包括但不限于显微镜观察、荧光扫描、流式细胞术、质谱流式细胞术、基于质量的质谱检测、磁性方法、基于聚集溶液的方法(例如，诸如SYBR green的嵌入染料)、化学下拉法、酶促测定和/或测序。
组合物
本公开内容的ProPER组合物由以下编号的段落描述：
1.一种组合物，其包含：
与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；
包含具有茎和环的发夹的催化链，其中所述催化链能够与第一靶结合分子结合；
包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子结合；以及
能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链。参见，例如图3B。
2.段落1所述的组合物，其进一步包含聚合酶，任选地链置换聚合酶，和/或dNTP。
3.段落1或2所述的组合物，其进一步包含过量(例如，过量2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍)的催化链，所述串联体形成链的引物能够与所述催化链结合。
4.段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
5.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链包含引物结构域的两个或更多个串联重复序列。
6.段落1-5中任一段所述的组合物，其中所述串联重复序列的长度为5nm至1000nm。
7.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链能够与第一靶结合分子结合。
8.段落1-7中任一段所述的组合物，其中所述催化链和串联体形成链通过中间接头与所述第一靶结合分子结合。
9.段落1-8中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子与第一接头链连接，所述第一接头链包含能够与所述催化链结合的第一结构域。
10.段落9所述的组合物，其中所述第一接头链进一步包含能够与所述串联体形成链结合的第二结构域。参见，例如图3B。
11.段落10所述的组合物，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
12.段落10所述的组合物，其中所述第一结构域和/或所述第二结构域的长度为1nm至10μm。
13.段落9-12中任一段所述的组合物，其中所述第一接头链的长度为1nm至10μm。
14.段落1-13中任一段所述的组合物，其进一步包含第一靶分子，任选地，其中靶分子为DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中靶分子存在于经固定的组织中。
15.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述串联体形成链能够与第二靶结合分子结合。参见，例如图3C。
16.段落15所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与包含第二结构域的第二接头链连接，所述串联体形成链能够与所述第二结构域结合。参见，例如图3C。
17.段落9-16中任一段所述的组合物，其中第一接头链的长度为1nm至10μm。
18.段落16或17所述的组合物，其中所述第二接头链的长度为1nm至10μm。
19.段落17或18所述的组合物，其进一步包含第二靶结合分子。
20.段落19所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与所述第一靶分子特异性结合，任选地，其中所述第一靶结合分子和所述第二靶结合分子与所述第一靶分子结合的区域不同。参见，例如图3C。
21.段落16-20中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽为抗体。
22.段落16-21中任一段所述的组合物，其中所述经标记的成像链包含选自荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺的可检测标记。
23.段落15-21中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与第二靶分子特异性结合，任选地，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中所述第二靶分子存在于经固定的组织中。参见，例如图3D。
24.段落23所述的组合物，其进一步包含第二靶分子。
25.一种组合物，其包含：靶结合分子，其与(i)包含具有茎和环的发夹的催化链和(ii)包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链连接，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化；和能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链；以及任选地，由所述靶结合分子结合的靶标。参见，例如图3B。
26.一种组合物，其包含：催化链，其包含具有茎和环的发夹；包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化；以及经标记的成像链，其能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合，以及任选地靶标链，其能够与所述催化链和串联体形成链结合。参见，例如图3A。
27.一种组合物，其包含：第一链，其包含结构域“X*”、第一结构域“a*”、第二结构域“a*”和结构域“a”；第二链，其包含结构域“Y*”和结构域“a”；经标记的成像链，其包含第一结构域“a*”和第二结构域“a*”；和任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域“X*”、结构域“Y*”和结构域“a*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”和结构域“a”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于靶标链上，和结构域“Y”位于靶标链上。参见，例如图3A。
28.段落27所述的组合物，其包含聚合酶和/或dNTP。
29.段落27或28所述的组合物，其中结构域“X”和结构域“Y”位于相同靶标链上，以及任选地，其中结构域“X”和结构域“Y”彼此相隔10μm或更小或100nm或更小的距离。参见，例如图3A。
30.段落29所述的组合物，其中所述靶标链与靶结合分子连接，任选地，其中所述靶结合分子是多肽，以及任选地，其中所述多肽是抗体。
31.段落27所述的组合物，其中结构域X位于第一靶标链上，以及结构域Y位于第二靶标链上。
32.段落31所述的组合物，其中所述第一靶标链与第一靶结合分子连接，以及所述第二靶标链与第二靶结合分子连接，任选地，其中所述第一靶结合分子是第一多肽和/或所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体和/或所述第二多肽是第二抗体。参见，例如图3C。
33.段落32所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至相同靶分子，或其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至不同的靶分子。参见，例如图3C和3D。
34.一种组合物，其包含：第一催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第一催化链能够与第一靶结合分子结合；第二催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第二催化链能够与第二靶结合分子结合；任选地第三催化链，其包含具有茎和环的发夹，任选地，其中所述第三催化链能够与第三靶结合分子结合，包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链，其中所述引物能够与所述第一催化链、所述第二催化链以及任选地所述第三催化链的茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中所述串联体形成链能够与所述第一靶结合分子或第二靶结合分子结合；以及第一、第二和任选地第三经标记的成像链，其各自能够与所述串联体形成链的串联重复序列结合。参见，例如图6B。
方法
一些方面提供了一种筛选靶分子的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的ProPER组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子的存在。
其他方面提供了一种检测靶分子的方法，该方法包括使所述靶分子与本公开内容的ProPER组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测靶分子。
其他方面还提供了一种筛选两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的ProPER组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子之间的相互作用的存在。
进一步的方面提供了一种检测两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使第一靶分子和第二靶分子与本公开内容的ProPER组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测所述第一靶分子和所述第二靶分子之间的相互作用。
另一个方面提供了一种方法，该方法包括使靶标链与包含具有茎和环的发夹的催化链、包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链、能够与所述串联体形成链的引物结构域和/或串联重复序列结合的经标记的成像链和聚合酶和/或dNTP接触，其中所述引物结构域能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，其中所述靶标链包含能够与所述催化链结合的第一结构域和能够与所述串联体形成链结合的第二结构域，以及任选地，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
其他方面提供了一种分子检测方法，其包括：(a)使与靶标链连接的表面与(i)包含具有茎和环的发夹的催化链和(ii)包含引物结构域的串联重复序列的串联体形成链接触，其中所述引物能够与所述茎结合，从而使所述发夹线性化，任选地，其中组合物包含过量的催化链，并且其中所述催化链和所述串联体形成链与所述靶标链结合；(b)任选地，洗涤所述表面；(c)在存在聚合酶和/或dNTP的情况下，在与所述靶标链结合的串联体形成链上产生所述引物结构域的其他串联重复序列；(d)使(c)的串联体形成链与能够与所述串联体形成链的串联重复序列结合的经标记的成像链接触；(e)任选地，洗涤(d)的表面；和(f)检测经标记的成像链。参见，例如图5，
鉴于其高特异性，以及线性扩增带来的灵敏度，ProPER的应用前景广阔。图3A-3D显示了如何将该方法用于特异性检测DNA、RNA和蛋白质靶标，以及如何将该方法用于研究在低于衍射极限的范围内发生的相互作用，例如生物分子复合物中蛋白质与蛋白质的结合。这两种应用在疾病诊断方法的开发以及更基础的生物学研究中都具有巨大的潜力。
高度特异和灵敏的生物标志物检测。在一些实施方案中，由于ProPER的快速、特异和灵敏的生物标志物检测，能够将其用于诊断应用。图5显示了示例工作流程。组分之一(在这种情况下为引物)附接在表面(其可以是纸、玻璃、塑料或另一种基底)上。然后，其余组分(靶标链和发夹链)结合到该基底结合的组分上。例如，可以将血清或其他含有目标核酸分析物的液体与发夹预混合，或者可以通过结合和洗涤步骤在基底上依次引入这些寡核苷酸。一旦形成了引物-靶标-发夹复合物，就可以通过抽吸和重新悬浮将额外的发夹链洗掉。接下来，运行ProPER以产生串联体，各自针对已结合的每个目标靶分子。引入荧光链以结合串联体以及然后将多余的未结合的链洗掉。最后，使用两种策略之一读取荧光输出：批量荧光或斑点计数。对于批量荧光，能够使用基于LED或激光的扫描仪(例如酶标仪)在表面上读取总荧光水平。可替代地，能够例如使用显微镜或自动计数器来计数单个荧光斑点的数量，并且能够将斑点的密度定量地映射到原始分析物的浓度估计值。
相互作用伴侣检测。在一些实施方案中，ProPER能用于在溶液中或原位检测相互作用伴侣。在该实例中，引物和发夹附接到不同的目标分子上，并且仅在它们紧密邻近时才产生输出。由于ProPER对于每一轮扩增会都需要组分的邻近，因此，预期更高的Kd值转换为更长的串联体(其产生更高的信号)。ProPER提供的动力学信号放大将具有更高的灵敏度或更低的背景以及生物分子相互作用的直接输出的特征。
低背景原位成像。在一些实施方案中，ProPER用作用于原位成像的方法。引物和发夹能使用图3A-3D中描绘的策略之一共定位以靶向DNA/RNA/蛋白质并在经固定的组织样品中原位生长串联体。通过在互补荧光链与这些局部串联体杂交之后对荧光进行成像(参见，图4)，能够知道这些靶向的生物分子在目标样品中的相对位置。此外，由于依赖于引物和发夹的邻近度，与正常的原位探针靶向和扩增(其通常仅依赖于定位在靶标上的一条探针链而不是两条)相比，预期背景显著降低。
示例性ProPER特征
特异性检测：在一些实施方案中，串联依赖于两种组分与靶标链/蛋白质/复合物的成功结合，因此与仅具有特异于靶标的一个检测事件的方法相比，相互作用的特异性增加。这种“双重检查”对降低背景具有非线性影响，因为引物和发夹两者结合错误靶标但彼此邻近的概率现在非常低。如果只有单个组分(引物/发夹)与错误的基底结合，则不会产生信号。在一些实施方案中，能够通过改变引物/发夹结合其靶标的方式和/或通过依赖额外的邻近相互作用(检测事件)来进一步提高特异性。
多重邻近度检查：不仅多次检查引物/发夹与靶标结合的特异性，而且还通过串联过程多次检查邻近度本身。每个PER步骤取决于引物与发夹的邻近度，因此串联体的长度反映了成功检查邻近度的次数(邻近事件)。因此，串联是一种类型的“邻近度校对”。使用ProPER，检测和邻近反应两者都是高度特异的，导致非常低的错误率。
扩增：由于反应的输出是一条长链，因此它用作线性扩增的一种形式。串联体能够用作例如荧光链的支架基底(例如图4)，其能够用于将许多荧光团聚集到单个串联体上。这为基于表面和基于固定样品的应用提供了高度灵敏、简单且经济高效的读出方法。
其他实施方案
在一些实施方案中，靶标、引物、发夹和其他(例如抗体)组分可以一起退火(例如，通过在1小时内从80℃冷却至20℃)，或者它们可以等温地组合在一起(例如，在室温、37℃、46℃等)。它们也可以在改善其对靶标链的特异性的条件下结合，例如使用标准的ISH(原位杂交)缓冲液(例如SSCT和PBS)，通常添加甲酰胺。
在一些实施方案中，组分的结合可以扩散地(在溶液中)进行，或者用一种或多种附接到基底的组分来进行。例如，可以固定组织样品(靶标)，以及随后引物和发夹链与其结合。备选地，引物或发夹链中的一个可以与表面结合(实例参见图5)，而其他链随后与表面结合的链杂交。
在一些实施方案中，靶向区域X/X*和Y/Y*的结合可以是瞬时的(使得平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者它们可以更强地结合(例如数分钟到数小时或更久的结合)。除了改变结合缓冲液条件之外，还可以通过使用保护链和立足点介导的链置换[5]或立足点交换[6](需要靶标链与现有链竞争)来使这种相互作用更加特异性。
在一些实施方案中，图5中的表面可以是纸、玻璃、塑料或能够以某种方式附接寡聚体的任何其他基底。链可以通过吸收或干燥而结合到表面上，或者通过例如使用生物素标记的引物组分和链霉亲和素包被的表面来使它们化学结合。
在一些实施方案中，反应和可视化工作流程可以完全扩散地进行(例如，从图5中除去表面)，并且能够通过现有的扩散方法(例如分子信标[7]和FRET配对置换(参见，例如[8]))或通过基于凝胶的测定来读取串联长度。
在一些实施方案中，引物和发夹链本身可以直接与抗体缀合(即没有中间桥链)。
在一些实施方案中，额外的序列修饰(例如间隔子)可以被包括在链中，以帮助实现柔性并且允许它们在一系列构型下能够到达彼此的位置。
在一些实施方案中，还能通过使用在延伸反应期间掺入的荧光团标记的dNTP来实现荧光读出，从而使串联体本身是发荧光的。
在一些实施方案中，能够检测任意数量的邻近发夹，以进一步提高靶标结合的特异性。在图7A-7B中显示了实现这一点的一种方法。图7A显示了如何能够使用两个发夹来产生5’-a b a b…a b-3’形式的串联体，与重复单元互补的荧光链(例如5’-b*a*-3’)能够与之结合以产生荧光输出。图7B显示了具有3个发夹的类似设置，其产生了5’-a b c a b c…a b c-3’形式的串联体。例如，使荧光链与序列5’-c*b*a*-3’杂交，将实现串联体的特定荧光输出。发夹的数量能够任意增加，以便对于成功且重复的串联必须在空间上邻近的分子数量为n+1，其中n是发夹的数量。
在一些实施方案中，能够进行多元化输出，例如通过使用多个正交串联ProPER序列，所述ProPER序列被同时扩增并映射到不同的荧光颜色。
共拉链反应
本公开内容的一些方面提供了一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含第一组串联重复序列的第一串联体链，其中所述第一串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及包含第二组串联重复序列的第二串联体链，任选地，其中所述第二串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及能够同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链。
本公开内容的其他方面提供了一种组合物，其包含：包含结构域X*以及结构域a的串联重复序列的第一串联体链；包含结构域Y*以及结构域b的串联重复序列的第二串联体链；和包含结构域a*和结构域b*的经标记的成像链，其中结构域X*、结构域Y*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中结构域X位于靶标链上，和结构域Y位于靶标链上。
串联体链
在一些实施方案中，串联体链包含一组串联重复序列。如本文所述，序列的“串联重复序列”是特定序列的相邻重复。应当理解，“第一组”串联重复序列不同于“第二组”串联重复序列。例如，第一组串联重复序列可以包括序列ATCGA的串联重复序列，而第二组串联重复序列可以包括序列TACGT的串联重复序列。因此，“第一串联体链”的序列不同于“第二串联体链”的序列。
第一和/或第二串联体链的长度可以变化。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为1nm-10μm。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为20-500个核苷酸。例如，第一和/或第二串联体链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，第一和/或第二串联体链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100，125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
串联体链中串联重复序列的数目可以变化。在一些实施方案中，串联体链包含2-100个串联重复序列。例如，串联体链可包含2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个串联重复序列。在一些实施方案中，串联体链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48、49或50个串联重复序列(例如引物结构域)。在一些实施方案中，串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，如本文所提供的，可以使用杂交链反应来合成如本文所提供的串联体链，例如如图14A和14B所示。将DNA的引物链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链反应，其中发夹形成长的双链串联体。在图14A和14B的实例中，从双链HCR产物突出的单链“立足点”结构域(“a”和“b”)只有在两者彼此紧密邻近时才能保持稳定的结合。因此，在一些实施方案中，组合物包括组合物A，其包含第一引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域“X*”、结构域“1”和结构域“w”；第一发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“w”、结构域“2”、结构域“w*”和结构域“1*”；第二发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“a”、结构域“2*”、结构域“w*”、结构域“1”和结构域“w”；第二引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域“Y*”、结构域“3”和结构域“z”；第三发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“z”、结构域“4”、结构域“z*”和结构域“3*”；第四发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域“b”、结构域“4*”、结构域“z*”、结构域“3”和结构域“z”；经标记的成像链，其在任选地5′至3′上包含结构域“a*”和结构域“b*”；和任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域“X*”、结构域“Y*”、结构域“1*”、结构域“2*”、结构域“3*”、结构域“4*”、结构域“w*”、结构域“z*”、结构域“a*”和结构域“b*”各自包含分别与结构域“X”、结构域“Y”、结构域“1”、结构域“2”、结构域“3”、结构域“4”、结构域“w”、结构域“z”、结构域“a”和结构域“b”的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域“X”位于第一接头链上，和结构域“Y”任选地位于第一接头链上。
引物链的长度可以变化。在一些实施方案中，引物链的长度为3-100个核苷酸。例如，引物链的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，引物链的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
发夹链的长度可以变化。在一些实施方案中，发夹链的长度为20-500个核苷酸。例如，发夹链的长度可以为20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-200、40-150、40-100、40-50、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、50-50、60-500、60-450、60-400、60-350、60-300、60-250、60-200、60-150、60-100、60-50、70-500、70-450、70-400、70-350、70-300、70-250、70-200、70-150、70-100、70-50、80-500、80-450、80-400、80-350、80-300、80-250、80-200、80-150、80-100、80-50、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-100、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200或100-150个核苷酸。在一些实施方案中，发夹链的长度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个核苷酸。
共拉链反应成像链
在一些实施方案中，成像链是短链，其能同时结合第一串联体链的串联重复序列和第二串联体链的串联重复序列(参见，例如图11A)。在一些实施方案中，成像链包含可检测标记，例如荧光团。成像链的长度可以变化。在一些实施方案中，成像链的长度为5-200个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度为3-50个核苷酸。例如，成像链的长度可以为3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、15-50、15-40、15-30、15-20、20-50、20-40、20-30、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，成像链的长度是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，成像链包含第一结构域“b*”和第二结构域“a*”，使得成像链结合包含结构域“a”的串联重复序列的第一串联体链，并结合包含结构域“b”的串联重复序列的第二串联体链。
可在本文中使用的荧光团的实例包括但不限于羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexafluor、氨基香豆素、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、荧光素FITC、Alexafluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、TexasRed、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、别藻蓝蛋白、Alexa fluor 647、Cy5、Alexafluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7和Cy7.5。可以使用其他荧光分子。
在一些实施方案中，成像链(或本文所述的任何其他链)可以被选自以下的部分标记(例如，连接)：荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、酪酰胺。本文还涵盖其他可检测的修饰基团。
成像链可以例如直接在串联体或串联体形成链上检测，或可以通过去杂交作用(例如，通过修饰缓冲离子成分或添加化学试剂(如甲酰胺或DMSO)或通过加热)释放以通过适合于特定修饰的各种读出方法进行检测。检测方法包括但不限于显微镜观察、荧光扫描、流式细胞术、质谱流式细胞术、基于质量的质谱检测、磁性方法、基于聚集溶液的方法(例如，诸如SYBR green的嵌入染料)、化学下拉法、酶促测定和/或测序。
组合物
本公开内容的Co-Zipper组合物由以下编号的段落描述：
1.一种组合物，其包含：与第一靶分子特异性结合的第一靶结合分子；包含第一组串联重复序列的第一串联体链，其中所述第一串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及包含第二组串联重复序列的第二串联体链，任选地，其中所述第二串联体链能够与所述第一靶结合分子结合；以及能够同时与所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列结合的经标记的成像链。参见，例如图11B。
2.段落1所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
3.段落1或2所述的组合物，其中所述第一串联体链包含两个或更多个串联重复序列和/或所述第二串联体链包含两个或更多个串联重复序列。
4.段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述第一和/或第二串联体的串联重复序列的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
5.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述第二串联体能够与所述第一靶结合分子结合。参见，例如图11B。
6.段落1-5中任一段所述的组合物，其中所述第一串联体链和所述第二串联体链通过中间接头与所述第一靶结合分子结合。
7.段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述第一靶结合分子与第一接头链连接，所述第一接头链包含能够与所述第一串联体链结合的第一结构域。
8.段落7所述的组合物，其中所述第一接头链进一步包含能够与所述第二串联体链结合的第二结构域。参见，例如图11B。
9.段落8所述的组合物，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
10.段落9所述的组合物，其中所述第一结构域和/或所述第二结构域的长度为1nm至10μm。
11.段落1-10中任一段所述的组合物，其进一步包含第一靶分子，任选地，其中靶分子为DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中靶分子存在于经固定的组织中。
12.段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述第二串联体链能够与第二靶结合分子结合。参见，例如图11C。
13.段落12所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与包含能够与所述第二串联体链结合的第二结构域的第二接头链连接。参见，例如图11C。
14.段落7-13中任一段所述的组合物，其中所述第一接头链的长度为1nm至10μm。
15.段落14或15所述的组合物，其中所述第二接头链的长度为1nm至10μm。
16.段落12-15中任一段所述的组合物，其进一步包含第二靶结合分子。
17.段落16所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与所述第一靶分子特异性结合，任选地，其中所述第一靶结合分子和所述第二靶结合分子与所述第一靶分子结合的区域不同。参见，例如图11C。
18.段落12-17中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是多肽，任选地，其中所述多肽是抗体。
19.段落1-18中任一段所述的组合物，其中所述经标记的成像链包含选自荧光团、量子点、聚合物点、金属离子、生物素、辣根过氧化物酶、磁性颗粒和酪酰胺的可检测标记。
20.段落16-19中任一段所述的组合物，其中所述第二靶结合分子与第二靶分子特异性结合，任选地，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质，以及任选地，其中所述第二靶分子存在于经固定的组织中。参见，例如图11D。
21.段落20所述的组合物，其进一步包含所述第二靶分子。
22.一种组合物，其包含：与(i)包含第一组串联重复序列的第一串联体链和(ii)包含第二组串联重复序列的第二串联体链连接的靶结合分子；同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链；以及任选地由所述靶结合分子结合的靶标。参见，例如图11B。
23.一种组合物，其包含：第一串联体链，其包含第一组串联重复序列；第二串联体链，其包含第二组串联重复序列；能够同时结合所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列的经标记的成像链，以及任选地能够与所述第一串联链和所述第二串联链结合的靶标链。参见，例如图11A。
24.一种组合物，其包含：包含结构域X*和结构域a的串联重复序列的第一串联体链；包含结构域Y*和结构域b的串联重复序列的第二串联体链；和包含结构域a*和结构域b*的经标记的成像链，其中结构域X*、结构域Y*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其中结构域X位于靶标链上，和结构域Y位于靶标链上。参见，例如图11A。
25.段落24所述的组合物，其中结构域X和结构域Y位于相同的靶标链上，以及任选地，其中结构域X和结构域Y彼此相隔10μm或更小或100nm或更小的距离。参见，例如图11B。
26.段落25所述的组合物，其中所述靶标链与靶结合分子连接，任选地，其中所述靶结合分子是多肽，以及任选地，其中所述多肽是抗体。
27.段落24所述的组合物，其中结构域X位于第一靶标链上，以及结构域Y位于第二靶标链上。参见，例如图11C。
28.段落27所述的组合物，其中所述第一靶标链与第一靶结合分子连接，以及所述第二靶标链与第二靶结合分子连接，任选地，其中所述第一靶结合分子是第一多肽和/或所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体和/或所述第二多肽是第二抗体。
29.段落28所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至相同靶分子，或其中所述第一多肽和所述第二多肽特异性结合至不同的靶分子。
30.一种组合物，其包含第一引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域X*、结构域1和结构域w；第一发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域w、结构域2、结构域w*和结构域1*；第二发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域a、结构域2*、结构域w*、结构域1和结构域w；第二引物链，其在任选地5′至3′上包含结构域Y*、结构域3和结构域z；第三发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域z、结构域4、结构域z*和结构域3*；第四发夹链，其在任选地5′至3′上包含结构域b、结构域4*、结构域z*、结构域3和结构域z；经标记的成像链，其在任选地5′至3′上包含结构域a*和结构域b*；以及任选地聚合酶和/或dNTP，其中结构域X*、结构域Y*、结构域1*、结构域2*、结构域3*、结构域4*、结构域w*、结构域z*、结构域a*和结构域b*各自包含分别与结构域X、结构域Y、结构域1、结构域2、结构域3、结构域4、结构域w、结构域z、结构域a和结构域b的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中结构域X位于第一接头链上，以及结构域Y任选地位于所述第一接头链上。参见，例如图14A。
31.段落30所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第一接头链。
32.段落30或31所述的组合物，其中所述第一接头链与特异性结合至第一靶分子的第一靶结合分子连接。
33.段落32所述的组合物，其中所述第一靶结合分子是第一多肽，以及任选地，其中所述第一多肽是第一抗体。
34.段落32或33所述的组合物，其中所述第一靶分子是DNA、RNA或蛋白质。
35.段落30-34中任一段所述的组合物，其中结构域Y位于所述第一接头链上。
36.段落30-35中任一段所述的组合物，其中结构域Y位于第二接头链上。
37.段落36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二接头链。
38.段落36或37所述的组合物，其中所述第二接头链与第二靶结合分子连接。
39.段落38所述的组合物，其中所述第二靶结合分子特异性结合至第一靶分子。
40.段落38或39所述的组合物，其中所述第二靶结合分子是第二多肽，以及任选地，其中所述第二多肽是第二抗体。
41.段落40所述的组合物，其中所述第二靶结合分子特异性结合至第二靶分子。
42.段落41所述的组合物，其中所述第二靶分子是DNA、RNA或蛋白质。
方法
一些方面提供了一种筛选靶分子的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的Co-Zipper组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子的存在。
其他方面提供了一种检测靶分子的方法，该方法包括使靶分子与本公开内容的Co-Zipper组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测靶分子。
其他方面还提供了一种筛选两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使怀疑包含靶分子的组合物与本公开内容的Co-Zipper组合物接触，并检测经标记的成像链的存在或不存在，其中经标记的成像链的存在表明靶分子之间相互作用的存在。
进一步的方面提供了一种检测两个靶分子之间的相互作用的方法，该方法包括使第一靶分子和第二靶分子与本公开内容的Co-Zipper组合物接触并检测经标记的成像链，从而检测所述第一靶分子和所述第二靶分子之间的相互作用。
另外的方面提供了一种方法，该方法包括使靶标链与包含第一组串联重复序列的第一串联体链、包含第二组串联重复序列的第二串联体链和能够同时与所述第一串联体链的串联重复序列和所述第二串联体链的串联重复序列结合的经标记的成像链接触，其中所述靶标链包含能够与第一串联体结合的第一结构域和能够与第二串联体结合的第二结构域，以及任选地，其中所述第一结构域与所述第二结构域相隔1nm至10μm。
Co-Zipper的高特异性和增强的信号背景比灵敏度开启了许多有希望的应用。图11A-11D显示了其能用于特异性检测DNA、RNA和蛋白质靶标的不同方法，以及如何可以将其用于研究相互作用，例如生物分子复合物中蛋白质与蛋白质的结合。这些应用在基础生物学研究和疾病诊断和医学成像方法的开发中具有巨大潜力。
高特异性和低背景原位成像。Co-Zipper是用于以高特异性和低背景成像靶标的有价值的方法。通过PER或滚环扩增产生的串联体能用于原位靶向经固定的细胞或组织样品中的DNA/RNA/蛋白质。在这种情况下，用不同的引物(用于直接检测)或桥序列(用于间接检测)标记靶向相同靶标的探针(图11A)。仅当两个串联体紧密邻近时才生成输出。图12显示了原位应用的实例。靶向小鼠胚胎成纤维细胞的主要卫星重复序列中两个重复序列的FISH探针在3'处附加PER引物，并在体外通过PER预延伸为正交串联体。然后将它们用于原位杂交实验，然后添加仅当结合到两个串联体时才产生强信号的邻近度成像链，因为它们被设计为非常弱地结合单个串联体，如阴性对照所示。
相互作用伴侣检测。Co-Zipper能用于在溶液中或原位检测相互作用伴侣。在这种情况下，直接地或通过使用互补桥序列将串联体标记在不同的目标分子上(图11D)。仅当两个串联体紧密邻近时才生成输出。图13显示了原位应用的实例。两个核纤层蛋白(Lamin)A和B通过针对它们的一抗随后通过与两个正交桥序列缀合的同源二抗进行检测。通过PER在体外将两个附加有桥互补物的正交引物预延伸至串联体中。免疫染色后，将串联体同时应用于样品上并与桥杂交。随后添加邻近度成像剂，其揭示了两种蛋白质共定位的位置(核纤层)，并且当省略抗体中的一种时未发出信号。与通过邻近度成像剂获得的非常特异的核信号相比，其中成像剂稳定结合单个串联体的对照在细胞质中显示明显的染色。
多重检测。通过使用正交串联体，Co-Zipper可轻松实现多重检测。能够通过将针对每个靶标或配对的唯一串联体与通用串联体组合来完成多重检测。可替代地，它还使得可以通过能被邻近度成像剂利用的组合检测系统以较少数量的正交序列设计达到更高水平的多重检测。这允许通过使用n个正交串联体达到n*(n-1)/2个正交二进制系统。同样，能将替代位点用于检测邻近度探针。
高度特异和灵敏的生物标志物检测。Co-Zipper能用于溶液中的和原位的诊断应用。它提供的快速、特异和灵敏的检测能力使得能够对组织样品中的由于高背景和低信号而通常难以成像的低丰度生物标志物进行高可信度的原位成像。
示例性的Co-Zipper特征
特异性检测：由于一个或多个靶标的检测依赖于荧光探针与不同串联体的成功结合，因此与仅具有特异于靶标的一个检测事件的方法相比，检测的特异性增加。该重合检测以非线性方式减少背景。
多重邻近度检查：在荧光探针杂交的每个步骤检查两个串联体的邻近度，因为每个杂交步骤依赖于两个串联体的邻近度，因此信号放大水平反映了物理邻近度。因此，检测变得非常特异，从而仅对邻近串联体产生放大信号。
放大的信号：串联体在以高精度检测到的靶标上提供强大的信号放大。
其他实施方案
在一些实施方案中，能够在溶液中、在固定的表面和基底上、以夹心形式或原位进行Co-Zipper测定。它们可以用于检测蛋白质、RNA、DNA以及其他生物标志物、分析物、小分子、病毒、全细胞或细胞碎片或能够使用核酸探针直接或间接(使用第二探针)标记的任何其他靶标。用于特异性标记的探针可以是抗体、纳米抗体或其他亲和力结合物，例如亲和体或适配体、RNA或DNA原位杂交探针、配体、重组标签、非天然氨基酸或核苷酸或小分子。
在一些实施方案中，代替在PER或RCA的情况下的串联重复序列的串联体，具有散布的重复序列或独特序列的DNA标签可以用于标记，并且能够由邻近度成像剂检测。在这种情况下，能够设计多于一种邻近度成像剂来同时结合所述串联体。
在一些实施方案中，能够采用单链或双链分支DNA结构或双链DNA组装体来代替单链串联体。这样的结构能够例如通过杂交链反应(HCR)[11]在发夹之一上添加立足点结构域来制备(图14A)。在这种情况下，单链的立足点结构域能够从每个结构中突出，仅当它们紧密邻近时才能保持邻近度成像剂的稳定结合，而不能靠它们自身保持稳定结合(图14B)。
在一些实施方案中，能够根据实验条件和期望的应用来修改邻近度成像剂的串联体长度和杂交长度。改变杂交长度或缓冲液条件或温度能够进行结合时间的调节。串联体和邻近度成像剂上互补区域a/a*和b/b*的结合可以是瞬时的(使得平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者它们可以更强地结合(例如数分钟到数小时或更久的结合)。短的结合时间可用于邻近度成像剂的特异性但瞬时的杂交，以实现重复采样或单分子检测实验和高分辨率成像。
在一些实施方案中，除了改变结合缓冲液的条件、温度或杂交长度外，还可通过使用保护链和立足点介导的链置换[9]或需要邻近度成像剂与现有链竞争的立足点交换[10]来更特异地控制邻近度成像剂和串联体之间的相互作用。
在一些实施方案中，能够通过使用串联体中的多个正交序列同时检测多个靶标。能够在光谱上(通过使用具有不同荧光团的邻近度成像剂)或顺序地实现多重检测。通过调整简单的洗涤条件，可以通过邻近度成像剂的可编程移除来实现顺序检测。可以通过改变盐浓度、甲酰胺含量、改变温度或酶解来实现移除。还可以通过编程为在每一轮中检测不同配对的邻近度成像剂序列以成对的方式顺序检测多个靶标。
在一些实施方案中，多向相互作用检测：除了检测成对相互作用，Co-Zipper还能够被修改以检测多向相互作用。这能够通过更改设计以使邻近度探针能够仅在多个串联体紧密邻近时才稳定结合来实现。
在一些实施方案中，靶标、串联体、探针(例如抗体)和其他组分(桥，夹板等)可以一起退火，或者它们可以等温地组合在一起(例如，在室温、37℃、46℃等)。它们也可以在改善其对靶标链的特异性的条件下结合，例如使用标准的ISH(原位杂交)缓冲液(如SSCT和PBS)，通常添加甲酰胺。这种结合可以扩散地(在溶液中)进行，或者通过使用一种或多种附接到基底上的组分来进行。例如，一个串联体(具有或不具有靶标)可以与表面结合，而另一个随后与夹板或相同或不同的靶标杂交。
在一些实施方案中，能够使用在与靶标混合的溶液中扩散地或在固定于表面(珠、纸、水凝胶、玻璃、塑料、纳米颗粒)上或原位施加于靶标上的邻近度成像剂来检测串联体。
在一些实施方案中，串联体本身可以直接与抗体或其他探针缀合(即没有中间桥链)，或者能够在标记之前、同时或之后将探针上的引物延伸成串联体。
在一些实施方案中，在邻近度成像剂中可以包括诸如间隔子的额外序列修饰，以在不同配置下调节到达距离。
在一些实施方案中，还能通过使用在延伸反应期间掺入的荧光团标记的dNTP来实现荧光读出，从而使串联体本身是发荧光的。在这种情况下，邻近串联体上的荧光团之间的FRET可以用作输出[FRET1]。能够将如在HCR的情况下的类似方法应用于双链结构。
靶结合分子
在一些实施方案中，链(例如，催化链、串联体形成链和/或串联体链)能够结合(或结合至)靶结合分子。靶结合分子可以是任何生物分子，例如多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，靶结合分子是多肽。在一些实施方案中，靶结合分子是蛋白质(例如，全长蛋白质或肽)。在一些实施方案中，靶结合分子是抗体，例如单克隆抗体。术语“抗体”涵盖完整抗体和抗体片段(例如，scFv)。
靶结合分子与靶分子之间的结合相互作用可以是瞬时的(例如，平均停留时间在数分钟或更短的数量级上)，或者分子可以更稳定或牢固地结合(例如，平均停留时间在数分钟到数小时或更久的数量级上)。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10纳秒、1至50纳秒、25至100纳秒、50至250纳秒或250至1000纳秒。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10秒、1至50秒、25至100秒、50至250秒或250至1000秒。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10分钟、1至50分钟、25至100分钟、50至250分钟或250至1000分钟。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的平均停留时间为1至10小时、1至50小时、25至100小时、50至250小时或250至1000小时。在一些实施方案中，靶结合分子与靶分子之间的结合亲和力为5nM至1000nM、5nM至500nM、250nM至750nM、500nM至1000nM、1至100μM、1至50μM、1至25μM、1至10μM或1至5μM。除了改变结合缓冲液条件外，结合亲和力和/或停留时间还能通过使用保护链和立足点介导的链置换[5]或立足点交换[6](需要靶标链与现有链竞争)来改变。
接头链
在一些实施方案中，链(例如，催化链、串联体形成链和/或串联体链)能直接或通过中间接头间接地结合靶结合分子。在一些实施方案中，所述中间接头是接头链(例如，单链核酸)。在一些实施方案中，接头链包含能够与链结合的结构域。在一些实施方案中，接头链包含结构域“X”。在一些实施方案中，接头链包含结构域“Y”。在一些实施方案中，接头链包含结构域“X”和结构域“Y”。
接头链的长度可以变化。在一些实施方案中，接头链的长度为1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，接头链的长度为10-100个核苷酸。例如，接头链的长度可以为10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，接头链的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，接头链(例如，第一和/或第二接头链)的长度小于100个核苷酸、小于50个核苷酸或为20至50个核苷酸。
接头链的结构域(结构域“X”和/或结构域“Y”)的长度可以变化。在一些实施方案中，接头链的结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，接头链的结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，接头链的结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45，46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如，结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离是1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如，结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离小于50个核苷酸。例如，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0-50、0-40、0-30、0-20、0-10、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20或5-10个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔25个核苷酸或5至15个核苷酸。
靶分子
靶分子(例如，第一靶分子或第二靶分子)可以是任何生物分子(例如，生物标志物)，例如DNA、RNA或蛋白质(例如，抗体、纳米抗体、适配体、肽标签或其他探针分子)。靶分子的其他实例包括脂质、小分子和分子嵌合体。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)存在于经固定的组织中。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)存在于溶液(例如水性缓冲液)中。在一些实施方案中，靶分子(或靶结合分子)附接于表面(例如玻璃，纸，硝化纤维素，云母等)。在一些实施方案中，靶分子是生物分子复合物的一部分。在一些实施方案中，靶分子是诊断靶分子和/或治疗靶分子。
本公开内容中包括的描绘核酸靶标和抗体靶标的检测的实施方案是出于举例说明的目的，并不旨在限制性的。靶分子的实例包括但不限于蛋白质、糖类(例如多糖)、脂质、核酸(例如，DNA、RNA，微小RNA)和小分子。靶标可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，分子靶标是生物分子。如本文所使用的“生物分子”是由活生物体产生的任何分子，包括大分子，例如蛋白质、多糖、脂质和核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)，以及小分子，例如，主要代谢物、次要代谢物和天然产物。分子靶标(特别是生物分子)的实例包括但不限于DNA、RNA、cDNA或经历逆转录的RNA的DNA产物。
在一些实施方案中，靶分子是蛋白质靶标，例如，细胞环境蛋白(例如细胞内或膜蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于纤维蛋白，例如，细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌营养不良蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌动蛋白、血影蛋白、tau、肌联蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白和胶原蛋白)以及细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、f-脊椎蛋白、皮卡丘林和纤连蛋白)；球形蛋白，例如血浆蛋白(例如血清淀粉样蛋白P组分和血清白蛋白)，凝血因子(例如补体蛋白、C1抑制剂和C3转化酶、因子VIII、因子XIII、纤维蛋白、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关的蛋白酶抑制剂、凝血酶、Von Willebrand因子)和急性期蛋白，例如C反应蛋白；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如钙黏着蛋白、室管膜蛋白、整联蛋白、Ncam和选择素)；跨膜转运蛋白(例如CFTR、血型糖蛋白D和混杂酶)，例如离子通道(例如配体门控离子通道，例如烟碱乙酰胆碱受体和GABA a受体，以及电压门控离子通道，例如钾、钙和钠通道)，同向/反向转运蛋白(例如葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)，肽激素例如胰岛素、类胰岛素生长因子和催产素，以及类固醇激素(例如雄激素、***和孕激素)；受体，例如跨膜受体(例如G蛋白偶联受体、视紫红质)和细胞内受体(例如***受体)；DNA结合蛋白(例如组蛋白、鱼精蛋白、CI蛋白)；转录调节因子(例如c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD和P53)；免疫系统蛋白(例如免疫球蛋白，主要组织相容性抗原和T细胞受体)；营养物质储存/转运蛋白(例如铁蛋白)；伴侣蛋白；和酶。
在一些实施方案中，靶分子(或上文讨论的靶结合分子)是抗体。如本文所使用的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(例如“抗原结合部分”)或其单链。术语“抗体”包括但不限于包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。抗体可以是多克隆或单克隆的；异种的，同种异体的或同基因的；或其修饰形式(例如，人源化，嵌合的)。如本文所使用的抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能能够通过全长抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341：544546，1989)；或(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，从而使它们成为蛋白单链，其中VH和VL区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人，Science 242：423 426，1988；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。这样的单链抗体也包括在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
在一些实施方案中，靶分子存在于组织样品中，任选地在经固定的组织中。在一些实施方案中，可以用温和的固定试剂或在温和的固定条件下(即，保存组织的试剂或条件)处理组织。在一些实施方案中，靶分子存在于溶液(例如水溶液)中。在一些实施方案中，靶分子附接至固体支持物或固体表面。
本公开内容的组合物和方法可以用于检测单个靶分子或多个靶分子，例如，属于相同分子复合物的多个靶分子。在一些实施方案中，多个靶分子可以是属于相同蛋白质复合物的多种蛋白质，例如，属于介体复合物或任何其他转录复合物的多种蛋白质。在一些实施方案中，多个靶分子可以是混合物中的多种抗体，例如，混合物中的两种或更多种不同的抗体。
在一些实施方案中，使用本文提供的任何方法检测两个或更多个靶标。在一些实施方案中，可以通过增加能够直接或间接结合靶分子的催化分子的数量来增加在单个反应中检测的靶标的数量。在一些实施方案中，在单个反应中检测至少2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的靶分子。在一些实施方案中，在单个反应中检测1-5、1-10、1-20、1-50或1-100个不同的靶分子。
任何两个靶标之间(或靶标或接头链的两个结构域或序列之间)的距离可以为1nm-10μm。例如，检测的任何两个分子或结构域之间的距离可以为1nm-100nm、1nm-500nm、1nm-1μm或1nm-5μm。
靶标链
在一些实施方案中，链(例如催化链、串联体形成链和/或串联体链)可以直接与靶标链(例如，DNA或RNA)结合。在一些实施方案中，靶标链包含目标序列(结构域)，链被设计成与该目标序列结合。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“X”(例如，包含第一目标序列)。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“Y”(例如，包含第二目标序列)。在一些实施方案中，靶标链包含结构域“X”和结构域“Y”。
靶标链的结构域(结构域“X”和/或结构域“Y”)的长度可以变化。在一些实施方案中，靶标链的长度为1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，靶标链的结构域的长度为3-100个核苷酸。例如，靶标链的结构域的长度可以为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，靶标链的结构域的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，结构域的长度为20个核苷酸或更短，或5至15个核苷酸。
在一些实施方案中，接头链的两个结构域之间的距离(例如结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离是1-10000个核苷酸，或1nm-10μm。在一些实施方案中，靶标链的两个结构域之间的距离(例如结构域“X”和结构域“Y”之间)的距离小于50个核苷酸。例如，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0-50、0-40、0-30、0-20、0-10、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、3-50、3-40、3-30、3-20、3-10、4-50、4-40、4-30、4-20、4-10、5-50、5-40、5-30、5-20或5-10个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)可以与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，一个结构域(例如，结构域“X”)与另一个结构域(例如，结构域“Y”)相隔少于25个核苷酸或5至15个核苷酸。
核酸
应当理解，本公开内容的核酸不是天然存在的。因此，核酸可以被称为“工程化的核酸”。“工程化的核酸”是自然界中不存在的核酸(例如，至少两个核苷酸共价连接在一起，并且在某些情况下，含有磷酸二酯键，称为磷酸二酯“骨架”)。工程化的核酸包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是通过连接核酸(例如分离的核酸、合成核酸或其组合)而构建的分子，并且在一些实施方案中，能够在活细胞中复制。“合成核酸”是被扩增或化学地或通过其他方式合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其他方式修饰，但能够与天然存在的核酸分子碱基配对(也称为“结合”，例如瞬时或稳定地)的核酸。重组和合成核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。
如本文所使用的术语“互补的”是指两个核苷酸或两组核苷酸彼此精确配对/结合的能力。例如，如果第一序列或链的单个核苷酸能够与第二序列或链的相应位置处的核苷酸氢键合，则认为碱基在该位置处彼此互补。核碱基配对可包括经典的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对。
尽管工程化的核酸总体上不是天然存在的，但它可能包括野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化的核酸包含获自不同生物体的核苷酸序列(例如获自不同物种)。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸包括鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列、病毒核苷酸序列或前述序列中任何两个或更多个的组合。在一些实施方案中，工程化的核酸含有一个或多个随机碱基。
在一些实施方案中，本公开内容的工程化的核酸可以包含除磷酸二酯骨架以外的骨架。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸可包含磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-methylphophoroamidite键、肽核酸或前述键中的任何两种或更多种的组合。工程化的核酸可以是指定的单链(ss)或双链(ds)，或者工程化的核酸可以包含单链和双链序列的一部分。在一些实施方案中，工程化的核酸包含三链序列的一部分，或其他非Watson-Crick碱基配对，例如G-四联体，G-四链体和i-基序。工程化的核酸可以包含DNA(例如，基因组DNA，cDNA或基因组DNA和cDNA的组合)、RNA或杂合分子，例如，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如，人工或天然的)的任何组合，以及两种或多种碱基的任意组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。
可以使用标准分子生物学方法(参见，例如Green和Sambrook,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring Harbor Press)产生本公开内容的工程化的核酸。在一些实施方案中，使用GIBSON
其他反应组分和条件
在一些实施方案中，组合物包含和/或方法利用聚合酶，例如链置换聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶(DNAP)，例如具有DNA链置换活性的DNA聚合酶(链置换聚合酶)。“链置换”描述置换合成过程中遇到的下游DNA的能力。可以如本文所提供地使用的具有DNA链置换活性的聚合酶的实例包括但不限于phi29DNA聚合酶(例如，NEB#M0269)，大片段Bst DNA聚合酶(例如，NEB#M0275)或大片段Bsu DNA聚合酶(例如NEB#M0330)。可以使用具有链置换活性的其他聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是RNA聚合酶。
在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：补充有纯化的牛血清白蛋白(BSA)的1X反应缓冲液(例如50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT)，pH 7.5，在30℃下孵育。
在一些实施方案中，聚合酶是大片段Bst DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％
在一些实施方案中，聚合酶是Bsu DNA聚合酶。在这样的实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT)，pH 7.9，在37℃下孵育。
引物交换反应组合物或系统中特定链和dNTP的浓度可以基于例如特定应用和该特定应用所需的动力学而变化。
本文所述的反应中链的浓度可以是例如5nM至1000nM。在一些实施方案中，本文所述的反应中的链的浓度是5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、5-60、5-70、5-80、5-90、5-100、5-125、5-150、5-200、10-50、10-75、10-100、10-150、10-200、25-75、25-100、25-125或25-200nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10-200、10-300、10-400、10-500、10-600、10-70、10-800、10-900或10-100nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nM。在一些实施方案中，反应中的链的浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90或100nM。反应中链的浓度可以小于5nM或大于1000nM。反应中链的浓度可以小于10nM或大于1000nM。
在一些实施方案中，在本文所述的反应中，任何两条链(例如，催化链与串联体形成链，或第一串联体链与第二串联体链)的比例可以为约1：1。
反应(例如，ProPER或Co-Zipper)中特定类型的链的数目是非限制性的。反应可包含例如1-1010条链。在一些实施方案中，反应包含1-10、1-102、1-103、1-104、1-105、1-106、1-107、1-108、1-109、1-1010或更多条特定类型的链(例如，串联体形成链、催化链和/或串联体链)。在一些实施方案中，反应包含1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95或10-100条链。在一些实施方案中，反应包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、28、19、20、21、22、23、24或25条链。
例如，可以通过改变温度、时间、缓冲液/盐条件和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)的浓度来控制反应(例如，引物交换反应)的动力学。聚合酶像大多数酶一样，对许多缓冲液条件敏感，包括离子强度、pH和存在的金属离子类型(例如，钠离子对镁离子)。因此，进行反应的温度可以在例如4℃至65℃(例如4℃、25℃、37℃、42℃或65℃)之间变化。在一些实施方案中，进行反应的温度为4-25℃、4-30℃、4-35℃、4-40℃、4-45℃、4-50℃、4-55℃、4-60℃、10-25℃、10-30℃、10-35℃、10-40℃、10-45℃、10-50℃、10-55℃、10-60℃、25-30℃、25-35℃、25-40℃、25-45℃、25-50℃、25-55℃、25-60℃、25-65℃、35-40℃、35-45℃、35-50℃、35-55℃、35-60℃或35-65℃。在一些实施方案中，反应在室温下进行，而在其他实施方案中，反应在37℃下进行。
反应可以进行(孵育)30分钟(min)至24小时(hr)。在一些实施方案中，反应进行10min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、7hr、8hr、9hr、10hr、11hr、12hr、18hr或24hr。
脱氧核糖核苷酸(dNTP)是驱动本文的反应(例如，引物交换反应)的“燃料”。因此，在一些实施方案中，反应的动力学取决于反应中dNTP的浓度。初次反应中的dNTP的浓度可以为例如2-1000μM。在一些实施方案中，反应中的dNTP浓度为2-10μM、2-15μM、2-20μM、2-25μM、2-30μM、2-35μM、2-40μM、2-45μM、2-50μM、2-55μM、2-60μM、2-65μM、2-70μM、2-75μM、2-80μM、2-85μM、2-90μM、2-95μM、2-100μM、2-110μM、2-120μM、2-130μM、2-140μM、2-150μM、2-160μM、2-170μM、2-180μM、2-190μM、2-200μM、2-250μM、2-300μM、2-350μM、2-400μM、2-450μM、2-500μM、2-600μM、2-700μM、2-800μM、2-900μM或2-1000μM。例如，反应中的dNTP浓度可以为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、105μM、110μM、115μM、120μM、125μM、130μM、135μM、140μM、145μM、150μM、155μM、160μM、165μM、170μM、175μM、180μM、185μM、190μM、195μM或200μM。在一些实施方案中，pr反应中的dNTP浓度为10-20μM、10-30μM、10-40μM、10-50μM、10-60μM、10-70μM、10-80μM、10-90μM或10-100μM。
在一些实施方案中，使用dNTP变体。例如，本文的反应可使用热启动/clean ampdNTP、硫代磷酸酯dNTP或荧光dNTP。可以使用其他dNTP变体。由于一些经修饰的dNTP相比正常(未经修饰的)DNA-DNA结合不太有利，因此催化链反向置换过程可能会随着它们的使用而增加。类似地，在一些实施方案中，可以使用由不同类型的核酸(例如，LNA、RNA或散布的修饰碱基，例如甲基dC或Super T IDT修饰)组成的催化链，以通过形成相对于催化链而言比合成的引物结构域更强的键来提高反应速度。
实施例
实施例1：邻近度引物交换反应(ProPER)的实验验证。
用于检测生物分子(例如用于疾病诊断或组织成像)的令人信服的方法要求反应应当(1)对目标靶标高度特异，并且(2)足够灵敏以检测少量或单拷贝的生物分子。我们提出了在实现这两个目标方面均具有独特优势的邻近度引物交换反应(ProPER)。通过依靠将多条链成功靶向至单个目标靶标，能够显著降低检测背景。此外，在串联过程中反复检查这种邻近度，进一步确保特异性相互作用。通过ProPER串联产生的长链能用作荧光分子的支架，使得ProPER能够用作信号放大形式。这允许潜在地将数十个或更多个荧光团聚集到单个靶生物分子上，产生随后能在显微镜或荧光扫描仪上直接可视化的信号。因此，该方法高度特异且高度灵敏，并且有可能优于现有的用于检测和成像生物分子的方法。
为了通过实验验证该系统，执行了优化过程(图1A-1B)。串联体形成链和催化发夹组分位于相同核酸(“夹板”)链上，在它们的杂交区域之间具有10个核苷酸的接头，并在溶液中保持空间邻近性(图1A)。将2nM Cy5标记的串联体形成链与2nM催化发夹链和2nM夹板链(如果存在)组合。在进行PER串联之前，加入Bst链置换聚合酶和适当的dNTP持续1小时，以及然后将聚合酶在80℃下热灭活20分钟。然后在15％TBE-尿素PAGE变性凝胶上运行8个反应，并在Cy5通道下扫描以可视化串联。反应在补充2.5mM至10mM最终浓度的镁(MgSO4)的1xPBS缓冲液中进行，并且反应在37.0℃至45.8℃运行，如凝胶泳道下方所示(图1B)。在理想条件下，不存在夹板链(靶标)则不产生串联，而包含夹板链导致产生长的串联体。测试的第四个条件，具体是在45.8℃且存在2.5mM镁的情况下，在不存在夹板的情况下几乎不产生引物的串联(左起第四个泳道)，而存在夹板的相同条件产生几百个碱基长的长串联体(凝胶中最右边的泳道)。
实施例2：ProPER中的接头距离评估
为了评估系统在一定范围的接头距离上的灵活性，进行了初始测试，其中引物和发夹组分的杂交区域(图1A中的结构域Y*和X*)之间的距离在0至18个核苷酸之间变化(图2A)。将2nM Cy5标记的串联体形成链与2nM催化发夹链和2nM夹板“靶标”链(如果存在)组合。在进行PER串联之前，加入Bst链置换聚合酶和适当的dNTP持续1小时，以及然后将聚合酶在80℃下热灭活20分钟。然后在15％TBE-尿素PAGE变性凝胶上运行6个反应(加上最后一个仅具有各自在1xPBS中稀释至2nM的引物和发夹的泳道的基准反应)，并在Cy5通道下进行扫描以可视化串联。反应在补充2.5mM最终浓度的镁(MgSO4)的1xPBS缓冲液中进行，并且反应在45.8℃下运行。对于所测试的5个距离的范围，在特定的凝胶实验条件下，串联效率被证明非常高且彼此之间没有区别(图2B)。具体而言，在没有夹板链存在的情况下发生的串连可忽略不计，而所有测试的夹板都产生了非常长(数百个碱基)的串联体。因此，该系统在一定范围的邻近度距离内具有灵活性。
实施例3：ProPER的应用
ProPER的应用在固定的靶标上在溶液中扩散地进行以用于体外诊断，并在固定于样品的链上原位进行以用于低背景荧光成像。首先，邻近度引物交换反应(ProPER)用于检测核酸靶标(DNA/RNA)，其中串联体形成链和催化发夹链被设计为仅在靶标(“夹板”)链存在的情况下共定位(图3A)。靶序列在溶液中测试、固定并原位检测。接下来，ProPER用于靶向与靶向目标蛋白质的抗体缀合的桥链(图3B)。第三，ProPER用于非常特异地检测单个蛋白质，其中串联体形成链与靶向该蛋白质的一种抗体连接，并且催化发夹与靶向该蛋白质上的不同位点的另一种抗体连接(图3C)。最后，使用ProPER检测两种蛋白质的邻近度，其中串联体形成链和催化发夹组分定位于靶向相同生物分子复合物中的蛋白质的抗体(图3D)。
实施例4：ProPER中的荧光读出
由ProPER产生的串联体与互补的荧光成像链杂交，例如使用图4所示的双结构域a*a*链。荧光信号的强度反映了所产生的串联体的长度。荧光还批量地可视化(例如，当将靶标和串联体固定在表面上并测量荧光的总水平时)或使用显微镜可视化以揭示串联体的空间定位。
实施例5：使用ProPER的生物标志物检测。
为了检测生物标志物，将一种组分(串联体形成链或催化发夹)附接到表面(其可以是纸、玻璃、塑料或另一种基底)上。然后，剩余的组分结合到该基底结合的组分上。例如，可以将血清或其他含有目标核酸分析物的流体与催化发夹预混合，或者可以通过在基底上的一系列结合和洗涤步骤顺序引入链。一旦形成了引物-靶标-发夹复合物，就可以通过抽吸和重新悬浮将额外的发夹链洗掉。接下来，可以进行ProPER以产生串联体，各自针对已结合的每个目标靶分子。引入荧光成像链以结合串联体以及然后将多余的未结合的成像链洗掉。最后，使用两种策略之一读取荧光输出：批量荧光或斑点计数。对于批量荧光，能够使用基于LED或激光的扫描仪(例如酶标仪)在表面上读取总荧光水平。可替代地，能够例如使用显微镜或自动计数器来计数单个荧光斑点的数量，并且能够将斑点的密度定量地映射到原始分析物的浓度估计值(图5)。
实施例6：使用ProPER进行多重邻近检测。
ProPER可用于评估是否能够检测任意数量的邻近发夹，以进一步提高靶标结合的特异性。实现这种增加的特异性的一种方法在图6A-6B中显示。图6A证明了使用两个催化发夹来生成5’-a b a b…a b-3’形式的串联体，其与互补于重复单元(例如5’-b*a*-3’)的荧光成像链结合以产生荧光输出。图6B显示了具有3个发夹的类似设置，其产生5’-a b c a bc…a b c-3’形式的串联体。将荧光链与序列5'-c*b*a*-3'杂交实现串联体的特定荧光输出。发夹的数量可以任意增加，以便对于成功且重复的串联在空间上邻近的分子数量为n+1，其中n表示发夹的数量。
实施例7：使用柔性的PER串联体接头的邻近度依赖性PER
使用ProPER方法的变型和长的柔性接头进一步证实了邻近检测(图7A-7B)。首先，使用重复的体外PER反应在42聚体的“桥”链的3'末端与第一串联体形成链生成长的串联体(图7A)。然后，引入逐步的PER发夹以将不同的第二PER引物序列附加到这些PER串联体的3'末端。通过将含有42聚体桥序列的Cy3标记的成像链与延伸的PER串联体和催化发夹链(两者均包含互补的42聚体序列以使它们与串联体形成链杂交)的混合物组合来进行原位杂交(图7B)。这导致PER串联体形成链和催化发夹(其与沿着基因组基因座平铺的链结合)的混合物。然后，如前所述，通过将聚合酶和dNTP引入缓冲液中原位进行邻近度依赖性PER反应。然后在成像之前杂交靶向在串联体形成链上的第一个(体外)和第二个(原位)引物结构域序列的荧光标记的成像链。邻近度依赖性PER的此变型(其使用在邻近度依赖性PER引物链上的柔性接头)具有多个优点。首先，由于可以通过改变体外PER条件来编程接头长度，因此引物能够达到的距离可以允许测量不同的距离。而且，能够使用与邻近度依赖性PER串联体序列相同的荧光成像剂结合方法对该接头进行成像，使得能够同时可视化基础探针序列和邻近度依赖性反应。这能够用于双色共定位以验证仅在还存在探针的情况下才会发生邻近度依赖性PER信号，并告知与发夹不邻近的探针在何处结合。可替代地，不同大小的接头能够通过化学DNA合成进行预合成，其中引物位点位于3’处，但是，在这一步骤中使用PER使合成更加灵活以用于满足多种需求，并且更具成本效益。
图7A-7B所示的实验的结果显示于图8A-8C中。使用靶向沿人染色体X分布的18200kb斑点的Cy3标记的FISH探针(以黄色显示)，并且仅针对靶向这些斑点中的一个(斑点X)的探针进行邻近度依赖性PER反应(图8A)。用于代表性染色体分布的不同通道组合和间期细胞显示在图8B-8C。正如预期的那样，绿色(488通道，主要的体外PER串联信号)和品红色(647通道，邻近度依赖性原位PER串联信号)共定位在一个区域中。此外，该区域包含在较大的黄色信号(Cy3通道，整个X染色体信号)中，进一步验证了PER信号在正确的染色体上可见。
实施例8：使用分支策略的邻近度依赖性PER。
使用分支策略的邻近度依赖性PER的另一个变型(其能够将许多串联体形成链或催化发夹定位在每个探针序列上)已通过实验验证(图9A-9B)。类似于上面图7A-7B中描述的先前描述的体外合成策略，使用体外PER反应将串联体形成链延伸成长的串联体(图9A)。在沿靶RNA序列平铺的交替串联体形成链上合成了两个不同的串联体序列。这些序列之一充当要结合的在3'末端包含第三引物的序列的支架。另一个序列具有互补催化发夹链的许多结合位点。进行原位邻近度依赖性PER以延伸第三引物结构域序列，并将荧光标记的成像链与这些合成的链杂交。选择Cbx5 mRNA转录物作为靶标，并在成像链上用Alexa 647染料在其中读出邻近度依赖性信号(图9B)。如预期的那样，显示分布在整个细胞质中的RNA点的邻近度依赖性信号仅在实验条件下可见(647)，而在阴性对照条件下(仅包含串联体形成链)不可见。
实施例9：用于重合检测的邻近度依赖性PER
如图10A-B所示的基于重合检测的信号放大通过使用携带以下两个对接位点的DNA缀合的抗体在细胞中对蛋白质可视化进行验证：i)用于捕获串联体形成链，和ii)用于捕获催化链/发夹。在示范中，靶向定位核膜的核纤层蛋白A(图10A)或定位线粒体的TOM20(图10B)。抗体缀合至25聚体“桥”链(催化发夹捕获链通过柔性接头链的对接位点)，然后缀合至42聚体桥链(串联体形成链捕获链通过柔性接头的对接位点)。通过将串联体形成链和催化链的捕获链与Cy5标记的串联体形成链组合来进行原位杂交。然后，如前所述，通过将聚合酶和dNTP引入缓冲液中，进行邻近度依赖性PER反应。然后在成像之前杂交靶向扩增的串联体的Atto565-Fluor成像剂。在催化链和串联体形成链以及具有结合位点的抗体均存在的情况下，Cy5通道(绿色，引物上的荧光团)和ATTO565通道(品红色)(代表邻近度依赖性原位PER串联体信号)仅在进行邻近度延伸的样品中可以一起看到。当阴性对照实验中省略抗体或捕获链时，未检测到串联。在存在引物捕获序列的条件下见到了引物的荧光信号。显示DAPI信号以证明仅当两条链均被捕获时才存在被特异性标记的细胞。除省略对照链外，对于所有样品均采用相同的反应条件。
邻近度依赖性PER的此变型促进重合检测以减少可能由非特异性探针或SNA链结合产生的非特异性背景，并提高成像的信噪比。
实施例10.Co-Zipper策略
低信号和高背景是妨碍检测系统灵敏度和准确性的重要限制。创建多个输出位置的信号放大方法(例如具有重复的荧光团结合位点的串联体)能够提供信号的改善，但由于探针的非特异性，通常也导致较高的背景和/或较低的准确性。通过依赖于两个结构域的协同结合与单个结构域之间的区别，结合两个重合的串联体的荧光团标记的成像链能用于以极高的特异性将许多荧光团聚集到该区域。通过依赖于串联体的邻近度实现低背景，因为两个串联体均错误定位到相同(亚衍射极限)位置的可能性极低。这种高特异性与通过将成像剂重复结合到串联体而实现的线性扩增的组合使得Co-Zipper能够应用于高度特异和高度灵敏的生物标志物检测(诊断)和成像。
在此，提出了一种涉及AND-门逻辑的基于邻近度的分子检测法，其中两个组分需要紧密邻近才能生成荧光信号(Co-Zipper策略)。理想情况下，此AND-门将应用于检测的每个步骤以获得最大的特异性。对于串联蛋白信号放大，这可以通过荧光团缀合的邻近度成像链共检测两条串联体链来实现，所述荧光团缀合的邻近度成像链仅在结合两个串联体(分别由重复序列a和b组成)时才稳定地杂交(图11A)。为了实现结合两个串联体所需的邻近度，包含短(8-10nt)的a*和b*结构域的成像链被设计为弱结合每个串联体，而以稳定结合的方式结合串联体对。以这种方式，每个荧光团标记的链的协同结合需要两个串联体的邻近，从而允许重合检测和放大的信号。这种拉链状的共检测结构的形成构成了Co-Zipper策略的基础。Co-Zipper还可用于靶向与靶向目标蛋白质的抗体缀合的夹板桥链。夹板桥容纳紧密邻近的两个串联体，所述两个串联体被同时检测以降低背景(图11B)。为了通过使用两种抗体(每种抗体携带结合不同串联体的桥，靶向蛋白质上的不同位点或修饰)非常特异地检测目标靶标(例如单个蛋白)，还使用了Co-Zipper(图11C)。为了使用Co-Zipper评估两种蛋白质的邻近度，可以使用靶向相同生物分子复合物中的蛋白质的抗体。Co-Zipper的所有形式均可在溶液中、在固定的靶标上进行以用于体外诊断，以及在固定至样品的链上原位进行以进行低背景高信号荧光成像。
对于荧光成像，Co-Zipper能用于三个主要目的：(1)抑制非特异性探针背景：在次级探针后跟随主要探针用于检测的情况下，由于来自两者的非特异性背景而发生错误传播。可以通过只有在两个次级探针同时结合时才能进行检测来实现背景抑制。两个探针都需要紧密邻近地存在以产生信号(图11B)。(2)具有降低的背景和增加的特异性的所需靶标的检测：这能通过同时用两个主要探针标记相同靶分子来实现。两个探针都需要紧密邻近地存在以产生信号(图11C)。(3)在溶液中或在其天然环境中共定位的相互作用伴侣的检测：这是通过使用靶向不同生物分子的不同探针来实现的，所述探针需要同时紧密邻近地存在以产生信号(图22D)。
实施例11.Co-Zipper的原位应用
使用靶向小鼠胚胎成纤维细胞的主要卫星重复序列中的两个重复序列的FISH探针证明了Co-Zipper的原位应用。这两个重复序列在其3'末端附加有PER引物，并在体外使用PER预延伸为两个正交的串联体。然后将所得的串联体用于使用成像链的原位杂交实验，该成像链只有在与两个串联体结合时才产生强信号，因为成像链被设计为以瞬时/弱亲和力结合每个单个串联体，如阴性对照所示(图12)。
实施例12.Co-Zipper的原位应用
两个核纤层蛋白Lamin A和B被一抗结合，然后被与两个正交桥核酸序列缀合的同源二抗结合。使用PER在体外将两个附加有与桥序列互补的序列的正交引物预延伸成串联体。免疫染色后，将串联体同时应用于样品上并与桥杂交。随后添加成像链以揭示两种蛋白质共定位的位置(即核纤层)。当省略一种抗体时未观察到信号。额外的对照使用稳定结合单个串联体的成像剂，并且其与结合两个串联体的成像链获得的非常特异的核信号相比，在细胞质中显示明显的染色(图13)。
实施例13.Co-Zipper的应用
可以采用双链DNA组件。这样的结构能够例如通过杂交链反应(HCR)[19]在发夹之一上添加立足点结构域来制备(图14A)。将DNA的起始链(1+x)添加到两种发夹的亚稳态混合物中触发杂交事件的链式反应，其中发夹形成长的双链串联体。通常，将荧光团缀合到发夹上提供线性扩增。对于Co-Zipper改编，在发夹之一中附加额外的立足点结构域(序列a)，而不是荧光团。在这种情况下，允许单链立足点结构域从每个结构中突出，以只有在它们彼此紧密邻近时才能保持邻近度成像链的稳定结合。通过邻近度成像剂(a*+b*)使得能够对由杂交链反应(HCR)形成的双链组件进行共检测。从双链HCR产物中突出的单链立足点结构域(a和b)只有在两者彼此紧密邻近时才保持邻近度成像链的稳定结合(图14B)。
参考资料
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在提供值的范围的情况下，本文具体考虑和描述了该范围的上端和下端之间的每个值。