阅读说明：本技术 一种自组装一体化纳米复合材料、制备方法及其应用 (Self-assembly integrated nano composite material, preparation method and application thereof ) 是由 李贺 谭啸峰 肖运帷 李琰 曾钰婷 宫金迪 庞小龙 周靖凯 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种自组装一体化纳米复合材料,包括组分3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)。其中,TMB的负载量为700～800mg/g,GOD和HRP的质量比为1：0.5～5。该纳米复合材料通过疏水性的TMB分子从有机相转移到水相时,其能够在疏水作用下自发的组装成形貌均一纳米粒子,并且与水相中的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶通过氢键和范德华力与其形成一体化的纳米粒子,有效的实现了酶和显色底物的一体化整合。该纳米粒子中TMB的负载量高达700～800mg/g,能大幅提高检测体系对葡萄糖的响应信号,从而增加检测的准确性和稳定性以及灵敏度。线性范围宽为50μM-10mM(R<Sub>2</Sub>＝0.99),检测限低至15μM,具有实现简单、快速可视化、高灵敏和特异性检测等优点。(The invention relates to a self-assembly integrated nano composite material which comprises components of 3,3 ', 5, 5' -tetramethyl benzidine (TMB), Glucose Oxidase (GOD) and horseradish peroxidase (HRP). Wherein the loading amount of TMB is 700-800 mg/g, and the mass ratio of GOD to HRP is 1:0.5 to 5. When the nano composite material is transferred from an organic phase to an aqueous phase through hydrophobic TMB molecules, the nano composite material can be spontaneously assembled into nano particles with uniform appearance under the hydrophobic action, and forms integrated nano particles with glucose oxidase and horseradish peroxidase in the aqueous phase through hydrogen bonds and van der Waals force,effectively realizes the integrated integration of the enzyme and the chromogenic substrate. The loading amount of TMB in the nanoparticles is up to 700-800 mg/g, and the response signal of a detection system to glucose can be greatly improved, so that the accuracy, stability and sensitivity of detection are improved. The linear range is wide and is 50 mu M-10mM (R) 2 0.99), the detection limit is as low as 15 mu M, and the method has the advantages of simple realization, quick visualization, high sensitivity, specific detection and the like.)

一种自组装一体化纳米复合材料、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物传感检测技术领域，涉及一种自组装一体化纳米复合材料、制备方法及其应用，具体涉及自组装方法一体化制备一种酶/显色底物信号分子复合纳米材料、制备方法及其应用。

背景技术

目前，糖尿病患病人数在全球范围持续增长，据估计到2045年将达到6.29亿人。据最新的调查研究显示，中国18岁及以上成人糖尿病患病率已高达11.6％，糖尿病前期的患病率更是达到了惊人的50.1％。这意味着，每10位中国成年人中，就有6位血糖不正常。按照这一比例，我国糖尿病患者人数已达1.14亿人，糖尿病前期人数接近5亿人。糖尿病已经成为我国最为重要和棘手的公共卫生问题之一，所以葡萄糖的快速检测对人体健康有着重大的意义。

目前，葡萄糖的快速检测采用传统的葡萄糖比色检测技术。该检测技术一般基于两步的酶的串联反应，即葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成双氧水，再在辣根过氧化物酶的催化作用下，外源性加入一些显色底物(如TMB，OPD，ABTS等)产生颜色变化来反映葡萄糖浓度的大小。通常这两个步骤是分开操作的，这就造成了步骤繁琐，人工成本增加，且容易造成酶失活等问题。

因此，葡萄糖的快速检测亟需一种能对葡萄糖或者生物分子进行高灵敏度的检测，从而得到一个快速简便的检测结果的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自组装一体化纳米复合材料，该纳米复合材料能够用于检测葡萄糖，纳米复合材料与葡萄糖发生串联反应致使显色物质变色，从而根据颜色的变化程度来判定葡萄糖的浓度。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种一体化复合纳米粒子，包括以下组分：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。

所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)通过分子间作用力(过氢键和范德华力与)形成一体化复合纳米粒子，即TMB-GOD-HRP纳米粒子(TMB-GOD-HRP NPs)。

所述TMB-GOD-HRP纳米粒子中TMB的负载量700～800mg/g。

优选的，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的质量比为1:0.5～5。

本发明将葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺形成一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP NPs，TMB-GOD-HRP NPs粒子形态及该粒子葡萄糖检测反应机理见图1，该纳米粒子能直接与葡萄糖发生作用，一体化复合纳米粒子上的葡萄糖氧化酶首先将葡萄糖氧化成双氧水，再在辣根过氧化酶的作用下，与TMB分子发生显色反应，由无色变为蓝绿色，其颜色的深浅即吸光度的大小就能正相关的反应出样品的中葡萄糖的浓度。

该纳米粒子的葡萄糖检测应用能够简化传统比色葡萄糖检测中需要外加显色底物的步骤，解决了现有葡萄糖检测技术中检测过程复杂，检测成本高以及背景干扰的问题。

本发明还提供了所述TMB-GOD-HRP一体化复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

a)TMB溶液配制：有机溶剂溶解3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，浓度为1mg/mL～10mg/mL；

b)GOD/HRP混合溶液配制：磷酸盐缓冲液溶解葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶；

c)混合反应：在4℃下，将TMB溶液通过蠕动泵注入GOD/HRP混合溶液中，注射完毕后继续反应2h～12h；

d)离心冻干：将混合反应后的溶液进行离心、洗涤、取沉淀物冻干得一体化复合纳米粒子，即TMB-GOD-HRP NPs。

疏水性的TMB分子从有机相转移到水相时，其能够在疏水作用下自发的组装成形貌均一的纳米粒子，并且与水相中的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶通过氢键和范德华力与其形成一体化的纳米粒子。

优选的，所述有机溶剂为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，N-甲基吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

优选的，所述葡萄糖氧化酶来源于黑曲霉或者青霉菌。

优选的，所述蠕动泵的速度为0.05～0.2mL/min。

优选的，所述离心的速度为1000～5000r/min。

优选的，所述一体化复合纳米粒子中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的负载量为700～800mg/g。

本发明还提供了一种一体化复合纳米粒子在葡萄糖检测中的应用。所述葡萄糖检测的方法，包括以下步骤：

a)配制TMB-GOD-HRP溶液：将一体化复合纳米粒子加入磷酸盐缓冲液中，超声得到稳定的白色乳状液体；

b)浓度检测：将TMB-GOD-HRP溶液加入葡萄糖溶液中，加入表面活性剂，孵育1-4h，观察颜色变化，使用酶标仪检测其吸光度的变化，并根据标准曲线方程判定样品中的葡萄糖浓度。

利用自组装功能来制备具有高负载信号分子TMB的TMB-GOD-HRP纳米材料，葡萄糖加入，使得外部条件发生变化，刺激信号分子被快速释放，产生颜色或者荧光的信号。荧光信号和刺激的程度成线性相关，故能有效测定葡萄糖浓度。

本发明还提供一种含有一体化复合纳米粒子的葡萄糖检测试纸或溶液，使得检测方式更加便捷，无须现场调配试剂，简化操作手续。

本发明具有如下优点和有益的效果：

1)本发明合成的TMB-GOD-HRP有效的将TMB显色底物和两种酶结合在一起，大大简化了传统比色检测中外加显色底物的步骤，能实现葡萄糖的即时检测。

2)TMB-GOD-HRP纳米粒子中TMB的负载量高达700～800mg/g，能大幅提高检测体系对葡萄糖的响应信号，从而增加检测的准确性和稳定性以及灵敏度。

3)本发明利用酶的高特异性反应，从而提高了检测体系的高选择性。

4)本发明检测葡萄糖的线性范围为50μM-10mM(R₂＝0.99)，检测限可达15μM。

5)本发明利用TMB-GOD-HRP纳米粒子实现了对葡萄糖的检测，具有反应条件温和，成本低廉，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速可视化、高灵敏和特异性检测等优点。

附图说明

图1一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP纳米粒子合成示意图；

图2TMB-GOD-HRP纳米粒子检测葡萄糖原理示意图；

图3检测不同浓度葡萄糖的紫外可见分光光谱图及显色示意图；

图4葡萄糖样品浓度与吸光度的拟合直线图。

具体实施方式

结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP的制备方法，包括以下步骤：

1)称取30mg的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺加入到6mL的DMF溶液中；

2)称取30mg来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶和30mg辣根过氧化物酶，加入到30mL的磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌得到褐色澄清的溶液；

3)在4℃下，将步骤1)中的溶液使用蠕动泵匀速，0.05mL/min，注入步骤2)的溶液中，反应液变得混浊，注射完毕后继续反应2h；

4)将步骤3)反应液离心(5000r/min)，洗涤，取沉淀物冻干即得一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP。所述一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP中TMB的负载量达780mg/g。

TMB的负载量大，有效提高检测体系对葡萄糖的响应信号，能够大幅度提升检测葡萄糖的准确性和稳定性以及灵敏度。一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP NPs合成示意图如图1所示。

实施例2

一种一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP的制备方法，包括以下步骤：

1)称取60mg的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺加入到6mL的DMF溶液中；

2)称取60mg来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶和30mg辣根过氧化物酶，加入到30mL的磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌得到褐色澄清的溶液；

3)在4℃下，将步骤1)中的溶液使用蠕动泵匀速，0.1mL/min，注入步骤2)的溶液中，反应液变得混浊，注射完毕后继续反应2h；

4)将步骤3)反应液离心(2000r/min)，洗涤，取沉淀物冻干即得一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP。所述一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP中TMB的负载量达800mg/g。

实施例3

一种一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP的制备方法，包括以下步骤：

1)称取30mg的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺加入到6mL的DMF溶液中；

2)称取30mg来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶和150mg辣根过氧化物酶，加入到30mL的磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌得到褐色澄清的溶液；

3)在4℃下，将步骤1)中的溶液使用蠕动泵匀速，0.2mL/min，注入步骤2)的溶液中，反应液变得混浊，注射完毕后继续反应2h；

4)将步骤3)反应液离心(2000r/min)，洗涤，取沉淀物冻干即得一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP。所述一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP中TMB的负载量达700mg/g。

实施例4

TMB-GOD-HRP纳米粒子检测葡萄糖原理示意图如图2所示，以实施例1制备的一体化复合纳米粒子TMB-GOD-HRP开展葡萄糖浓度测定试验：

1)使用分析天平称取5mg的TMB-GOD-HRP，加入到5mL的磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝7.4)，超声0.5min，得到稳定的白色乳状液体；

2)配制一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液(醋酸-醋酸钠缓冲液，pH＝4，0.05-10mM)；

3)配制浓度为4mM的十二烷基三甲基氯化铵水溶液。

4)分别移取200μL步骤1)中的液体，移取1000μL步骤2)中的溶液，移取100μL步骤3)中的溶液至4mL离心管中。将离心管放置恒温震荡孵育箱中培育3h，溶液颜色由无色变为蓝色，吸取200μL液体至96微孔板中，放入酶标仪(TECAN，SPARK)检测其吸光度值变化，并根据标准曲线方程判定样品中的葡萄糖浓度。

检测不同浓度葡萄糖的紫外可见分光光谱图见图3，葡萄糖样品浓度与吸光度的拟合直线图见图4，可见处于652nm处的吸光度值随着葡萄糖浓度的增加而升高，并展现了良好的线性关系，其线性范围宽为50μM-10mM(R²＝0.99)，检测限低至15μM，具有实现简单、快速可视化、高灵敏和特异性检测等优点。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。