阅读说明：本技术 一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法 (Method for producing flavonoid substances from external products such as soybeans for bacillus natto fermented vegetables ) 是由 孙庆申 杨宸 李秀凉 靳文凤 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物发酵技术领域,具体地涉及一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法；包括挑选菜用大豆等外品,洗净灭菌蒸熟后使用纳豆菌发酵后熟得纳豆产品,将冻干发酵好的纳豆经石油醚超声除脂后用一定浓度的乙醇溶液热回流提取纳豆中的黄酮类物质,将粗提液过大孔树脂纯化后,旋干收集液后蒸馏水溶解,冷冻干燥得黄酮粉末。本发明可作为降脂产品进行应用,本发明利用从纳豆中提取纯化的黄酮类物质灌胃高脂小鼠,发现黄酮类物质可以降低高脂小鼠血清中血脂浓度,提高血脂代谢清除能力,同时还具有调节免疫的保健功能。本发明具有工艺简单、流程短、成本低的特点,适合大中小不同规模豆制品加工企业。(The invention relates to the technical field of microbial fermentation, in particular to a method for producing flavonoid substances by fermenting vegetable soybeans and other external products with bacillus natto; selecting vegetable soybeans and other external products, cleaning, sterilizing, steaming, fermenting by using bacillus natto, then obtaining a natto product, ultrasonically degreasing freeze-dried and fermented natto by using petroleum ether, then extracting flavonoid substances in the natto by using an ethanol solution with a certain concentration through hot reflux, purifying a crude extract by using macroporous resin, then carrying out spin drying on a collected solution, dissolving in distilled water, and carrying out freeze drying to obtain flavone powder. The invention can be applied as a lipid-lowering product, and the flavonoid extracted and purified from natto is used for gastric perfusion of a high-fat mouse, so that the flavonoid can reduce the blood lipid concentration in the serum of the high-fat mouse, improve the blood lipid metabolism clearance capability and simultaneously have the health-care function of regulating immunity. The invention has the characteristics of simple process, short flow and low cost, and is suitable for bean product processing enterprises of large, medium and small scales.)

一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地涉及一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法。

背景技术

纳豆营养丰富，具有预防疾病和保健等功能，其中还含有纳豆激酶、异黄酮、超氧化歧化酶、生育酚等多种生理活性物质，可以增强体质、提升机体免疫力，如今纳豆已成为预防和改善心脑血管疾病的首选药食同源食品。目前的研究表明，异黄酮具有对血管的防护作用、类似女性雌激素作用以及抗激素作用、抑菌活性和预防骨质疏松症等；黄酮还可以有效地降血糖和血脂，可以作为辅助降血糖降血脂功能食品的植物提取物来源。

菜用大豆是一种含有丰富的植物蛋白、多种有益的矿物质、维生素及膳食纤维等成分的豆类植物。目前，我国对于菜用大豆的加工多为初步加工，精深加工产品研究和开发还比较落后，技术含量较低，产品附加值低。因此，有必要设计一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法，以菜用大豆为原料发酵纳豆，从中提取纯化黄酮类物质，以解决菜用大豆等外品剩余和菜豆深加工产品研究、开发落后问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法，以菜用大豆为原料发酵纳豆，从中提取纯化黄酮类物质。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法，包括：

(1)原料处理：菜用大豆等外品经挑选、冲洗后称重，121℃高压蒸汽灭菌20min蒸熟；

(2)接种：将纳豆枯草芽孢杆菌菌粉与菜用大豆等外品重量按2％比例配置成菌液，进行接种；

(3)发酵：将倒入菌液的菜用大豆等外品在35～41℃条件下，恒温发酵12～48小时；

(4)后熟：发酵完成后使其在4℃条件下，静置放置6～24小时，得纳豆产品；

(5)提取：冻干打粉后除脂，热回流提取后即得黄酮类物质粗提液；

(6)分离纯化：大孔树脂纯化；

(7)干燥：得冻干粉。

进一步的，所述步骤(1)蒸熟后保持温度在45-55℃。

进一步的，所述步骤(2)的接种量为2％。

进一步的，所述步骤(2)在豆子灭菌蒸熟完成后温度在48-52℃时倒入菌液。

进一步的，所述步骤(3)的发酵温度为37℃，发酵时间为24小时。

进一步的，所述步骤(4)后熟时间为12小时。

进一步的，所述步骤(5)具体过程为：将纳豆产品冻干打粉后称重，加入5倍体积石油醚超声1h，弃去石油醚去除脂肪，除脂完成后加入20倍体积60％乙醇溶液，80℃下热回流提取3h，得黄酮类物质粗提液。

进一步的，所述步骤(6)的大孔树脂纯化为：采用95％乙醇溶液浸泡预处理12h的大孔树脂纯化，优选为D101大孔树脂，上样量250mL，上样流速1.5mL/min，洗脱液为70％乙醇溶液，洗脱流速1.5mL/min。

进一步的，所述步骤(7)的干燥为真空冷冻干燥，得冻干粉。

本发明的技术效果：

与现有技术相比，本发明的一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法，采用菜用大豆等外品发酵生产黄酮类物质，发酵底物“新”且充足；发酵条件简单、快速；本发明为生产黄酮类物质提供一种新的思路，以及为公司等外品的处理问题提供解决方案。利用从发酵好的纳豆产品中提取的黄酮类物质可以降低高脂动物血清中的血脂、增强血脂的代谢清除能力，且对肥胖小鼠具有减重作用，同时黄酮类物质还具有调节免疫的保健功能。本发明具有工艺简单、流程短、成本低的特点，适合大中小不同规模豆制品加工企业，应用广泛。

附图说明

图1为本发明发酵时间对纳豆中黄酮类物质含量的影响图；

图2为本发明发酵温度对纳豆中黄酮类物质含量的影响图；

图3为本发明接菌量对纳豆中黄酮类物质含量的影响图；

图4为本发明后熟时间对纳豆中黄酮类物质含量的影响图；

图5为本发明各组小鼠甘油三酯变化图；

图6为本发明各组小鼠总胆固醇变化图；

图7为本发明各组小鼠高密度脂蛋白变化图；

图8为本发明各组小鼠肝脂酶变化图；

图9为本发明各组小鼠肿瘤坏死因子-α变化图；

图10为本发明各组小鼠白介-6变化图；

图11为本发明各组小鼠白介10变化图；

图12为本发明各组小鼠体重变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产黄酮类物质的方法，包括：

(1)原料处理：将菜用大豆等外品经挑选、冲洗后称重，放入灭菌锅中121℃高压蒸汽灭菌20min蒸熟；

(2)接种：将纳豆枯草芽孢杆菌菌粉与菜用大豆等外品重量按2％比例配置成菌液，在豆子灭菌蒸熟完成后温度在50℃时倒入菌液；

(3)发酵：将倒入菌液的菜用大豆置于37℃恒温培养箱中发酵24h，发酵完成后将菜用大豆等外品置于4℃冰箱中后熟12h，得纳豆产品；

(4)后熟：发酵完成后，将其置于4℃冰箱中后熟18h，得纳豆产品；

(5)提取：将纳豆产品冻干打粉后称重，加入5倍体积石油醚超声1h，弃去石油醚去除脂肪，除脂完成后加入20倍体积60％乙醇溶液，80℃下热回流提取3h，得黄酮类物质粗提液；

(6)分离纯化：将使用95％乙醇浸泡预处理12h的大孔树脂倒入层析柱中，蒸馏水洗至无味后，按250mL上样量、1.5mL/min流速倒入黄酮粗提液，平衡30min后使用70％乙醇溶液按1.5mL/min流速洗至无色，收集洗脱液；

(7)干燥：将洗脱液旋转蒸发至干后，蒸馏水溶解，然后放入-20℃的冰箱预冻，再用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得纯化后黄酮类物质粉末。

实施例2：黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定黄酮含量

1、标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL(相当于芦丁0、75、150、300、450、600μg)，移入10mL刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5mL，各加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量(μg)为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制得标准曲线为：y＝5.02x+0.0007，R²＝0.9996。

2、黄酮含量的测定：浓缩黄酮粗提液，按标准曲线制备方法测定其吸光度值，代入到线性回归方程中计算粗提液中黄酮含量。

实施例3：纳豆菌发酵菜用大豆生产黄酮类物质的单因素试验

将纳豆菌接种在蒸熟好的菜用大豆中进行发酵，分别考察了发酵时间、接种量、发酵温度、后熟时间四个因素对其产生的黄酮类物质含量的影响。经各单因素试验筛选后，为下一步正交优化试验提供前期试验基础。

一、发酵时间对纳豆中黄酮类物质含量的影响

在灭菌蒸熟后的菜用大豆中接种2％的纳豆菌菌液，放入预设温度为37℃的恒温培养箱中，分别培养12h、24h、36h和48h，发酵完成后放入4℃冰箱中后熟12h，每组进行三组平行试验，然后将所得成品进行冷冻干燥后打粉。加入10倍体积石油醚超声去除脂肪两次，加入30倍体积60％乙醇80℃热回流3h，收集提取液，即得黄酮粗提液，浓缩后测定其黄酮含量。由图1可知，纳豆中黄酮类物质的含量随发酵时间的延长出现由低到高再到低的变化。在12～24h这个阶段，纳豆中黄酮类物质含量呈升高趋势，此时随发酵时间延长，纳豆芽孢杆菌发酵生产的黄酮类物质增多，发酵时间24h时，纳豆中黄酮类物质含量达到最高；发酵时间超过24h，菜用大豆中的营养物质可能不足以维持纳豆菌的代谢，同时次级代谢产物过多对初级代谢产物产生抑制，导致纳豆中黄酮类物质含量随发酵时间的延长逐渐下降。

二、发酵温度对纳豆中黄酮类物质的影响

在灭菌蒸熟后的菜用大豆中接种2％的纳豆菌菌液，放入预设温度为35℃、37℃、39℃、41℃的恒温培养箱中培养24h，发酵完成后放入4℃冰箱中后熟12h，每组进行三组平行试验，然后将所得成品进行冷冻干燥后打粉。加入10倍体积石油醚超声去除脂肪两次，加入30倍体积60％乙醇80℃热回流3h，收集提取液，即得黄酮粗提液，浓缩后测定其黄酮含量。由图2可知，随着发酵温度的升高，纳豆中黄酮类物质含量先增大后减小。发酵温度为37℃时纳豆中黄酮类物质含量最高，当发酵温度大于或小于37℃时，纳豆的形态略有干瘪，且纳豆中黄酮类物质含量降低。微生物的生长及代谢过程需要适宜的温度，纳豆菌生产黄酮类物质的反应在最适温度时，则纳豆中黄酮类物质含量达到最高，一旦超过最适温度黄酮类物质的含量就会下降。同时温度过高会导致纳豆色泽暗淡，形态瘪软。

三、接种量对纳豆激酶酶活性的影响

在灭菌蒸熟后的菜用大豆中分别按1、2％、3％、4％的接种量进行接菌，放入预设温度为37℃的恒温培养箱中培养24h，发酵完成后放入4℃冰箱中后熟12h，每组进行三组平行试验，然后将所得成品进行冷冻干燥后打粉。加入10倍体积石油醚超声去除脂肪两次，加入30倍体积60％乙醇80℃热回流3h，收集提取液，即得黄酮粗提液，浓缩后测定其黄酮含量。由图3可知，接种量的多少对发酵过程中产生黄酮类物质有一定影响。黄酮类物质含量随接种量的增大均呈现了先增大后减小的趋势。随着接种量的增大，纳豆表面的粘膜先增多后减少。接种量为1％时，纳豆粘稠度不够，纳豆中黄酮类物质含量低，可能是由于接种量过小，菌种生长繁殖速率较低，发酵不完全造成；接种量为2％时，细胞生长速率适中，次级代谢过程顺利进行，纳豆中黄酮类物质含量达到最大；接种量大于2％时，纳豆中黄酮类物质含量随接种量增大而降低，此时细菌繁殖速度过快导致菜用大豆中营养成分迅速耗竭，产生初级代谢旺盛，次级代谢被抑制，从而导致纳豆中黄酮类物质含量的减少及氨臭味的增加。

四、后熟时间对纳豆激酶酶活性的影响

在灭菌蒸熟后的菜用大豆中接种2％的纳豆菌菌液，放入预设温度为37℃的恒温培养箱中培养24h，发酵完成后放入4℃冰箱中分别后熟6h、12h、18h、24h，每组进行三组平行试验，然后将所得成品进行冷冻干燥后打粉。加入10倍体积石油醚超声去除脂肪两次，加入30倍体积60％乙醇80℃热回流3h，收集提取液，即得黄酮粗提液，浓缩后测定其黄酮含量。由图4可知，黄酮类物质含量随后熟时间的增长呈现了先增大后减小的趋势。后熟时间为12h时纳豆中黄酮类物质含量最高，当后熟时间小于12h时，纳豆的独特氨味较少、粘度较低，且纳豆中黄酮类物质含量低；当后熟时间大于12h时，纳豆的氨臭味过大，纳豆中黄酮类物质含量逐渐降低。

实施例4：纳豆菌发酵菜用大豆生产黄酮类物质的正交优化试验

根据单因素试验结果，选取了发酵时间，接种量，后熟时间三个主要因素进行正交试验，设计三因素三水平正交分析表，对纳豆菌发酵菜用大豆产黄酮类物质的工艺进一步优化：结果见表1。

表1 正交试验结果

对正交试验结果进行处理与分析，以上3个因素对菜用大豆发酵纳豆中黄酮类物质含量的影响的顺序为A>B>C，即发酵时间>菌粉比例>后熟时间。A1B2C2是纳豆中黄酮类物质含量最高的发酵方案，即菜用大豆发酵时间为24h，添加纳豆菌粉比例2％，后熟时间12h，再此发酵方案下纳豆中的黄酮类物质的含量为4.30mg/g。

实施例5：纯化后黄酮体外抗氧化性的研究

1、羟基自由基清除能力的测定

取0.2M/LpH7.4的PBS缓冲溶液1mL，300ug/mL的番红花红1mL，样品0.5mL(5mg/mL)，3％的H2O2℃水浴中反应30min，在520nm处测吸光值，空白组以0.5mL的蒸馏水代替样品，对照组以1.5mL的蒸馏水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和待测样品。

清除率＝[(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100％

其中：A样品、A空白、A对照、分别为样品、空白和对照的吸光值。

2、DPPH体系中抗氧化活性的测定

取浓度为去1、2、3、4、5mg/mL的黄酮水溶液2mL,加入0.1mM/L的DPPH溶液2mL，混匀室温下避光反应20min，10000r/min离心10min为样品组，空白组以2mL 95％的乙醇代替DPPH溶液。对照组为2mL的DPPH和2mL的去离子水。调零组为2mL的去离子水和2mL 95％的乙醇。在517nm处测吸光值。

清除率＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％

总还原能力的测定

取0.5mL的样品溶液(5mg/mL)，加入2.5mL 0.2M/L pH 6.6的PBS缓冲溶液，2.5mL1％的铁氰化钾溶液，50℃水浴20min，加入2.5mL 10％的TCA溶液，混匀后4000r/min离心10min，取上清2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL1％FeCl3溶液，静置10min后体系溶液由黄色变为绿色，以等量的去离子水代替样品溶液调零，在700nm处测吸光值。

表2 黄酮体外抗氧化活性的测定结果

从表2中可看出，再此浓度下，黄酮溶液和抗坏血酸清除DPPH自由基能力基本相同；黄酮溶液清除羟基自由基能力明显强于抗坏血酸溶液；总还原能力抗坏血酸溶液强于黄酮溶液。

实施例6：冻干黄酮粉降血脂功效的验证

将试验小鼠置于动物饲养室，首先适应性饲养一周，期间12h光照，12h黑暗，自由饮食饮水，将48只小鼠随机分为6组，每组8只，然后连续喂养普通饲料或高脂饲料8周来建立高脂小鼠模型，建模成功后第九周开始按照以下方案进行分组：

A：正常对照组(喂以普通饲料)

B：阳性对照组(喂以高脂饲料加奥利司他)

C：阴性对照组(喂以高脂饲料)

D：黄酮高剂量组(喂以高脂饲料加100mg/(kg·d)的黄酮水溶液)

E：黄酮中剂量组(喂以高脂饲料加50mg/(kg·d)的黄酮水溶液)

F：黄酮低剂量组(喂以高脂饲料加20mg/(kg·d)的黄酮水溶液)

各组每只小鼠饲喂剂量为0.2mL。

阳性对照组奥利司他喂药量的计算公式为：dm＝dh/hw*k*mw

dm、dh分别代表小鼠每天的给药量、人每天的给药量；mw代表小鼠的体重，hw代表人的体重，人的体重一般取70kg，小鼠给药时的体重取40g；k代表人与小鼠的换算系数为9。以每只小鼠的给药容量0.8mL计算得到奥利司他的药物浓度应为1.5mg/mL。

连续灌胃处理4周后进行血脂测定：小鼠禁食12小时，自由饮水，采用摘眼球取血法，用不含热原和内毒素的1.5mL离心管收集血液，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离，将上层血清吸取放入微离心管中，做好标记置于-20℃冰箱中保存备用。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻后按照试剂盒使用说明书操作检测样品。血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、肝脂酶(HL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10的含量测定和小鼠体重的变化(见图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11和12)。

1、图12为第0周、第8周、第12周小鼠体重变化情况，在第八周正常对照组(A)体重明显低于其他五组，差异性显著(P<0.05)，证明高脂动物模型建立成功。建模成功后连续灌胃黄酮4周，各组小鼠体重变化差异明显。由图可知，第12周末时，阴性对照组(C)体重明显高于其他五组，差异性显著(P<0.05)；黄酮高剂量组(D)、黄酮中剂量组(E)、黄酮低剂量组(F)体重较第8周末相比有所下降，体重与正常对照组(A)和阳性对照组(B)无显著差异(P＞0.05)。综上，黄酮对高脂饮食诱导的肥胖小鼠具有减重作用。

2、黄酮高中低剂量三组小鼠血清中TG和TC含量都明显低于阴性对照组(C)，；黄酮高中低三组血清中TG和TC含量略低于正常对照组(A)和阳性对照组(B)。综上所述，长期的高脂饮食升高了小鼠体内甘油三酯和总胆固醇的含量，小鼠体内血脂偏高，而在灌胃黄酮水溶液后，小鼠血清中甘油三酯和总胆固醇含量有所降低，说明黄酮水溶液具有降低血液中血脂的益生保健作用。

3、阴性对照组(C)中小鼠血清中HDL和HL含量显著低于其余五组；黄酮高中低剂量三组小鼠血清中HDL和HL含量高于正常对照组(A)、阳性对照组(B)、阴性对照组(C)。说明长期的高脂饮食降低了小鼠体内高密度脂蛋白和肝脂酶的含量，小鼠体内血脂的清除能力下降，而在灌胃黄酮水溶液后，小鼠血清中高密度脂蛋白和肝脂酶含量升高，说明黄酮水溶液具有增强体内血脂清除能力的保健作用。

4、阴性对照组(C)小鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-α含量显著高于其他五组，黄酮高剂量组(D)、黄酮中剂量组(E)和黄酮低剂量组(F)含量低于正常对照组(A)和阳性对照组(B)。阴性对照组(C)鼠血清中抗炎因子IL-10含量显著低于正常对照组(A)，黄酮高剂量组(D)、黄酮中剂量组(E)和黄酮低剂量组(F)含量明显高于正常对照组(A)、阳性对照组(B)和阴性对照组(C)。综上所述，长时间的高脂饮食会升高体内IL-6和肿瘤坏死因子-α的含量，降低体内IL-10的含量，说明长期的高脂饮食会导致小鼠体内免疫紊乱，灌胃黄酮水溶液后各含量趋于正常，说明黄酮具有调节免疫的保健功能。

由本发明实施例可知利用从发酵好的纳豆产品中提取的黄酮类物质可以降低高脂动物血清中的血脂、增强血脂的代谢清除能力，且对肥胖小鼠具有减重作用，同时黄酮类物质还具有调节免疫的保健功能。

上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。