4-(4-氯苯基)-1h-吡唑-5-胺及其衍生物在制备hiv-1表达抑制剂的应用
阅读说明：本技术 4-(4-氯苯基)-1h-吡唑-5-胺及其衍生物在制备hiv-1表达抑制剂的应用 (Application of 4- (4-chlorphenyl) -1H-pyrazole-5-amine and derivatives thereof in preparation of HIV-1 expression inhibitor ) 是由 张辉 马显才 张旭 于 2020-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了生物活性分子4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺及其衍生物对HIV-1表达抑制剂中的应用。本发明发现4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺在很宽的药物浓度范围内均对细胞无明显毒性,对HIV-1的EC50低至23.26μM,证明了4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺可以作为一种十分安全、有效、广谱、特异地抗HIV-1HIV-1潜伏感染再激活抑制剂,为开发更多抗病毒药物提供了新型靶点和药物研发方向。(The invention discloses application of bioactive molecules 4- (4-chlorphenyl) -1H-pyrazole-5-amine and derivatives thereof to an HIV-1 expression inhibitor. The invention discovers that 4- (4-chlorphenyl) -1H-pyrazole-5-amine has no obvious toxicity to cells in a wide drug concentration range, has the EC50 of HIV-1 as low as 23.26 mu M, and proves that the 4- (4-chlorphenyl) -1H-pyrazole-5-amine can be used as a reactivation inhibitor which is very safe, effective, broad-spectrum and specific for resisting HIV-1HIV-1 latent infection, thereby providing a novel target and a drug development direction for developing more antiviral drugs.)
技术领域
本发明化合物的新应用，特别涉及生物活性分子4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺及其衍生物对HIV-1表达抑制剂中的应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)是艾滋病的致病病原体。当前针对HIV-1感染，主要采用联合抗病毒疗法对病毒进行压制。由于这种压制作用发挥时间比较短，因此病人需要终身服药。一旦停止药物作用，病毒血症便会在极短的时间内迅速反弹。当前的抗病毒药物大多直接作用于病毒。然而也存在着众多的副作用。并且这些药物都无法调动宿主细胞的胞内免疫系统对病毒进行主动压制，也无法做到将所有整合的病毒进行永久的沉默。科学家们相继提出了多种功能性治愈治疗策略，包括了“shock and kill”和“block and lock”等。然而这些策略目前依然处于体外验证阶段，大量的临床数据表明，尚无有效的潜伏感染激活剂和潜伏感染永久沉默剂可以在临床实践当中得到很好的验证。
HIV-1的LTR是病毒启动子所处的位置。对HIV-1潜伏感染的机制研究发现，LTR上存在大量的抑制性表观遗传学修饰可以显著的压制HIV-1的表达和限制HIV-1的再激活。这些修饰多为宿主细胞主动攻击导致的病毒沉默。因此，充分的调动宿主胞内免疫，直接作用于HIV-1的LTR将有望充分的打开或永久的关闭HIV-1的表达。同时结合强力有效的免疫监控，开发新型的药物作用于HIV-1启动子，将有望将病毒充分的激活并被杀灭。对于难以激活的病毒，可以用化合物处理将病毒永久沉默。无论是激活病毒还是永久沉默病毒，都要求我们开发新型的药物。
4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺(4-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-5-amine)结构式为：
目前针对LAP的抑制剂报道甚少，LAP抑制剂对HIV-1的压制作用更加极少被发现。当前未有研究报道4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺具有抗HIV-1感染及治疗等相关应用。
发明内容
本发明的目的在于提供4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺作为低毒安全HIV-1潜伏感染抑制剂的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺及其衍生物在制备HIV-1潜伏感染再激活抑制剂的应用。
进一步地，上述HIV-1潜伏感染再激活为介导因子介导激活。
更进一步地，上述介导因子介导激活为Tat因子介导的病毒激活。
进一步地，上述HIV-1潜伏感染再激活抑制剂包括有效剂量的4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺及其衍生物。
进一步地，上述HIV-1潜伏感染再激活抑制剂还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，上述HIV-1潜伏感染再激活抑制剂为口服制剂或注射制剂。
更进一步地，上述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述注射制剂为注射液或粉针剂。
进一步地，上述HIV-1潜伏感染再激活抑制剂其由10％～90％的4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺及其衍生物和10％～90％的药学上可接受的辅料组成。
本发明的有益效果是：
本发明发现4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺在很宽的药物浓度范围内，均对细胞无明显毒性，其对于HIV-1的EC50低至23.26μM，证明了4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺作为一种十分安全、有效、广谱、特异地抗HIV-1HIV-1潜伏感染再激活抑制剂，为开发更多抗病毒药物提供了新型靶点和药物研发方向。
附图说明
图1为生物活性分子化合物库中生物活性分子化合物对潜伏感染的HIV-1启动子驱动的GFP表达抑制图；
图2为4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺在HIV-1潜伏感染细胞系当中，对HIV-1病毒蛋白Tat介导的病毒表达抑制作用效果图；
图3为4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺在HIV-1潜伏感染细胞当中的毒性作用；
图4为4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺在HIV-1潜伏感染细胞当中对HIV-1的压制作用；
图5为4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对HIV-1表达的抑制有效浓度曲线图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体的实验对本发明所展示的内容进行进一步详细的阐述。本实验实施过程和附图仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。实施过程中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规实验方法。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验1、高通量筛选确证4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对HIV-1潜伏感染再激活的抑制作用
具体实验方法为：
1).将生长状态良好的J-Lat 10.6细胞均匀铺于96孔板当中，所使用的培养条件为：RPMI1640，10％FBS、1％双抗、5％CO2、37℃条件下培养24小时；
2).细胞培养24小时后，用0.02mg/μl的Tat刺激细胞用于激活潜伏感染的HIV-1，培养12小时；
3).细胞接续培养12小时后，在每个对应的孔当中加入生物活性分子库化合物，其中阴性对照用等量的DMSO，再培养24小时；
4).细胞继续培养24小时后，将细胞吸取转移至1.5ml管当中，并用500G，室温离心5分钟；
5).除去培养基上清，加入1ml的PBS将细胞重悬，再次离心5分钟，去除PBS上清，并用500μL的PBS将细胞重悬；
6).用流式细胞仪对每一个化合物处理样品进行分析，其中FSC和SSC用于圈出有效的活细胞，FITC用于圈出被激活的HIV-1感染的细胞；
7).以阴性对照DMSO组的GFP表达比例为Mock组，计算其他各组激活百分比相对于Mock组的激活倍数，并做柱状图分析。
实验结果：
实验结果如图1所示。多种生物活性分子均对HIV-1具有抑制作用，其中4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对拮抗HIV-1潜伏感染的再激活具有十分显著的作用，抑制效果高达90％以上。
实验2、4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺特异性地抑制HIV-1启动子的活性
具体实验方法为：
1).将TZM-bl的HIV-1表达细胞系均匀铺于24孔板当中，培养条件为：在DMEM、10％FBS、1％双抗、37℃、5％CO2条件下培养24小时；
2).细胞培养24小时后，用脂质体转染Tat表达质粒或空载体至各孔对应的TZM-bl细胞当中；
3).转染12小时后，将培养基上清去除并加入等量体积的新鲜DMEM，随后在一个转染了Tat的孔和一个转染了空载的孔中，分别加入20μM的4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺，剩下的两个组对应的孔分别加入等体积的DMSO，再次培养24小时；
4).细胞再次培养24小时后，将培养基上清移除，并用PBS在孔内清洗一遍，彻底去除PBS洗液；
5).在每个孔当中分别加入100μL的细胞裂解液，在220rpm条件下下，振荡裂解30分钟；
6).将裂解上清液转移至1.5ml管当中，12000rpm离心3分钟，将上清液转移至新的1.5ml管当中；
7).取20μL的细胞裂解上清液至96孔白底板中，用荧光素酶报告系统测定各孔中的Luciferase的含量，各组含量以吸光度值表示。
实验结果：
实验结果如图2所示。转染病毒Tat蛋白可以显著的抬高HIV-1驱动的Luciferase的表达，而用4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺处理细胞后，Tat介导的HIV-1的反式激活被显著压制，表明4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对整合的HIV-1启动子有明显的压制作用。
实验3、4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺的HIV-1感染细胞耐受性
具体实验方法为：
1).将HIV-1假病毒潜伏感染细胞系J-Lat均匀铺于24孔板中，培养条件为：在RPMI1640、10％胎牛血清、1％双抗、5％CO2、37℃条件下培养24小时；
2).细胞培养24小时后，在各孔中加入Tat，使得终浓度为0.02mg/μl，培养12小时；
3).细胞继续培养12小时后，在各孔中分别加入以下浓度梯度的4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺：160μM、80μM、40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM和0μM；
4).药物处理24小时后，将细胞重悬并转移至1.5ml管当中，500G离心5分钟后，用PBS漂洗一遍，随后用100μl的PBS将细胞重悬，并加入1μl的PE偶联的死/活细胞染料；
5).细胞染色30分钟，每10分钟涡旋混匀一次，用500G离心5分钟，彻底去除上清，加入1ml的PBS漂洗一次；
6).细胞沉淀用300μl的PBS重悬，用流式细胞仪分析死活细胞比例，其中PE阳性的细胞为活细胞。
实验结果：
实验结果如图3所示。在任意浓度梯度下，细胞活力均无明显变化，尽管在更高浓度时，活细胞比例有略微的下降，表明J-Lat细胞能够很好的耐受4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺的处理。
实验4、4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺的半有效抑制浓度
具体实验方法为：
1).如实验3所示过程1)至过程3)，将细胞铺于24孔板后用Tat和不同浓度梯度的药物处理，处理24小时；
2).药物处理24小时后，将细胞重悬并转移至1.5ml管当中，500G离心5分钟，并彻底去除培养基上清；
3).用1ml PBS将细胞重悬，再次500G离心5分钟，随后用500μl的PBS将细胞重悬；
4).细胞悬液用流式细胞仪进行分析，以FSC和SSC圈出有效的活细胞，GFP阳性的活细胞用FITC指示，用统计方法对各组GFP阳性细胞比例进行曲线拟合，并计算出4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对J-Lat细胞的半有效抑制浓度。
实验结果：
实验结果如图4和图5所示。4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺对HIV-1潜伏感染细胞再激活的抑制半有效浓度EC50为23.26μM，表明仅需要很少量的4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺便可以抑制HIV-1的再激活。也表明4-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-胺是一种具有安全、有效、特异的生物活性分子，可以用于改良新型抗病毒药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。