Bms309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途
阅读说明：本技术 Bms309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途 (Application of BMS309403 in preparation of medicine for treating sepsis acute kidney injury ) 是由 王波 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了BMS309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。本发明发现,BMS309403可以通过抑制FABP4进而改善脓毒血症急性肾损伤,因而具备开发成治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的前景。(The invention discloses an application of BMS309403 in preparing a medicament for treating sepsis acute kidney injury. The invention discovers that BMS309403 can improve sepsis acute kidney injury by inhibiting FABP4, and therefore has a prospect of being developed into a medicine for treating sepsis acute kidney injury.)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及BMS309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。
背景技术
急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是由多种病因所致的以肾功能迅速下降为特征的常见临床综合征。流行病学研究表明，AKI在临床重症监护患者中死亡率高达70％，其中46％～48％的AKI由脓毒血症所致。脓毒血症急性肾损伤(Septic acute kidneyinjury，septic AKI)是一个复杂的病理过程。研究发现脓毒血症AKI的发病机制与肾血流动力学异常、炎症损伤、凋亡和氧化应激等密切相关，其机制目前尚不完全清楚。脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid-binding protein 4，FABP4)是分子量约15kDa的脂质伴侣蛋白，主要在巨噬细胞和脂肪细胞中表达，已经被证明与多种疾病相关，如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等。越来越多的研究发现，FABP4与肾脏疾病的发生关系密切，但目前FABP4是否参与脓毒血症AKI尚无报道。
BMS309403是一种有效的、选择性的、细胞可渗透性的FABP4抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供BMS309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
BMS309403用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。
一种用于治疗脓毒血症急性肾损伤的药物制剂，以BMS309403为活性成分，以药学上可以接受的辅料为载体，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述辅料为固体、液体或半固体辅料。
进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊、注射剂。
有益效果：
本发明发现，BMS309403可以通过抑制FABP4进而改善脓毒血症AKI，因而具备开发成治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的前景。
附图说明
图1为RT-qPCR检测各组小鼠肾组织FABP4 mRNA水平；其中，Sham示假手术组，CLP示CLP手术组，CLP+BMS示BMS309403干预组；****P<0.0001，vs.Sham组；####P<0.0001，vs.CLP组；数据以均数±标准差表示；
图2为WB检测各组小鼠肾组织FABP4蛋白表达水平；其中，****P<0.0001，vs.Sham组；####P<0.0001，vs.CLP组；数据以均数±标准差表示；
图3为各组小鼠血清Scr及BUN水平；其中，****P<0.0001，vs.Sham组；####P<0.0001，vs.CLP组；数据以均数±标准差表示；
图4为RT-qPCR检测各组小鼠肾组织NGAL及KIM1 mRNA水平；；其中，****P<0.0001，vs.Sham组；####P<0.0001，vs.CLP组；数据以均数±标准差表示；
图5为HE染色观察各组小鼠肾组织病理改变及肾小管损伤评分比较(200×、400×)；其中，****P<0.0001，vs.Sham组；####P<0.0001，vs.CLP组；数据以均数±标准差表示。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
1、实验主要试剂
2、实验主要仪器
二、实验方法
1、主要试剂的配制方法
1)BMS309403灌胃溶液：通过分析天平准确称量所需的BMS309403，加入20％PEG400溶解后4℃冰箱保存备用。灌胃前半小时用0.9％生理盐水将BMS309403灌胃液母液稀释，参考既往研究，按40mg/kg/日来配制，现配现用。
2)10％中性福尔马林溶液(PH 7.0)：磷酸二氢钠4g及磷酸氢二钠6.5g加入100mL甲醛及900mL水；
3)伊红-酒精溶液：蒸馏水及冰醋酸中加入0.5～1g伊红，滤纸过滤，烘干后加入100mL无水乙醇；
4)苏木精溶液(3000mL)：在100mL无水乙醇中加入6g苏木精，2000mL蒸馏水中加入150g硫酸铝钾，待溶解后再加甘油、碘酸钠及冰醋酸混合溶解，混合后放在有光和通风处3周，变成深红色，即可使用；
5)0.2％冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2mL加入蒸馏水100mL；
6)1％磷钼酸水溶液：磷钼酸1g加入蒸馏水100mL；
7)1％光绿水溶液：光绿1g加入蒸馏水100mL；
8)60％异丙醇的配制：40mL蒸馏水中加入100％异丙醇，4℃冰箱保存备用；
9)4％(MV)多聚甲醛：100mL 1×PBS溶液中加入4g多聚甲醛，同时加入数滴NaOH，在通风厨中60℃加热使其溶解，冷却至室温，用HCl调节溶液的pH值至7.4，分装置于-20℃冰箱备用；
10)TBS-T液：Tween-20与TBS缓冲液按1:2000比例配制，将Tween-201mL加入TBS缓冲液1L中，混匀后室温备用；
11)封闭液：100mLTBS-T溶液中加入5g脱脂奶粉，待溶解后置于4℃冰箱保存备用；
12)PBS储存液(10X)：超纯水中，加入氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钠2.08g混合后定容至100mL；
13)PBS工作液(1X)：10XPBS存储液与超纯水以1:9的比例稀释至1XPBS工作液，调整pH至7.2，放置于玻璃瓶中，高温高压灭菌后备用；
14)2％(M/V)BSA：先量取10mLPBS(1×)，再量取0.2gBSA粉末，放入PBS中，予以磁力搅拌子涡旋溶解，4℃冰箱保存备用；
15)0.2M磷酸缓冲液的配制：量取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)29g及磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)2.6g，加入双蒸馏水，定容至500mL，pH调至7.4；
16)30％丙烯-双丙烯酰胺贮存液：三蒸水中加入30g丙烯酰胺，待溶解完成后再加入0.8g双丙烯酰胺，定容，然后过滤，4℃冰箱保存备用；
17)多聚赖氨酸(0.05mg/mL)：加入三蒸水，让多聚赖氨酸配成所需浓度；
18)SDS上样缓冲液：取1mL1moL/LTris·HCL(pH6.8)，再加入100mL去离子水，混匀后再加入4mL10％SDS、1mL1mol/L二硫叔焦醇及0.02g溴酚蓝，混匀后予以0.45μM滤纸过滤，4℃冰箱保存备用；
19)SDS储存液：90mL去离子水中加入10g SDS，充分溶解后再加去离子水定容至100mL，室温保存备用；
20)电泳缓冲液：蒸馏水中加入甘氨酸14.4g、Tris base 3.03g及SDS1 g定容至1L；
21)转膜缓冲液：蒸馏水中加入甘氨酸14.4g、Tris base 3.03g及甲醇200mL定容至1L；
22)TBST缓冲液：蒸馏水中加入NaCl 29.2g及Tris base 2.42g定容至1L，加入Tween-201mL；
23)10％过硫酸铵(APS)：10mL去离子水中加入1g过硫酸铵，完全溶解后，-20℃冰箱保存备用；
24)蛋白裂解液：RIPA裂解液中加入1000×蛋白酶抑制剂；
25)一抗稀释液：称取0.5gBSA粉末，加入到10mLTBST溶液中，充分溶解混匀，保存于-20℃冰箱备用；
26)含2％H2O2的PBS缓冲液(PH 7.4)：H2O 22.0mL溶解于PBS缓冲液98mL；
27)DNA裂解缓冲液：双蒸水82mL中加入10％SDS 5mL、0.5M EDTA 10mL、1MTris-HCl 1mL及5M NaCl 2mL；
28)DNase I储存液的配制：将总RNA提取试剂盒中的DNase I干粉(1500U)溶解在无RNA酶的双蒸水(550μL)中，混匀后分装，置于-20℃冰箱贮存待用；
29)DNase I工作液的配制：在新的无RNA酶离心管中放入DNase I储存液(由样品数量决定所需配制的量)加RDD缓冲液；
30)电泳凝胶配置：
15％分离胶
5％浓缩胶
2、CLP诱导脓毒血症AKI模型建立及分组
造模方法：术前禁食12小时，采取戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射进行麻醉，碘伏常规消毒腹部，正中偏下切开腹部，切口长度约1厘米，逐层打开腹腔寻找盲肠末端，小心分离盲肠远端及大肠系膜，术中需注意避免触碰肠系膜血管，用无菌4号丝线在距离盲肠根部1厘米处结扎，并在已结扎的盲肠远端中央处用无菌20-gauge针头贯通刺穿2次，轻轻挤压出少许盲肠内容物，随后将盲肠送回腹腔，关闭腹腔，逐层缝合。假手术组分离盲肠末端后，不行结扎穿孔，直接关闭腹腔，逐层缝合，所有动物均在术后在颈背部皮下注射无菌的温热生理盐水1mL，行液体复苏。整个实验过程在室温下进行，术后4小时给予水和饲料，分笼饲养，每笼4只，记号分组。
雄性C57BL/6J小鼠24只，8-10周龄，体重约25-27g，随机分为4组，每组6只，拟行假手术、CLP术操作如前所述：
(1)假手术组(Sham)：生理盐水100μL灌胃，每天1次，连续3天后予假手术；
(2)CLP模型组(CLP)：生理盐水100μL灌胃，每天1次，连续3天后予CLP；
(3)BMS309403干预组(CLP+BMS)：给予BMS309403(剂量为40mg/kg)灌胃，每天1次，连续3天后予CLP；
(4)BMS309403对照组(BMS)：给予BMS309403(剂量同上)灌胃，每天1次，连续3天后予假手术。
术后16小时处死各组小鼠，留取标本。
3、标本采集
1)血标本的采集及检测
戊巴比妥钠(50mg/kg)充分麻醉，抓取小鼠颈部头皮，压迫颈部两侧，待小鼠双眼突出且可见眶后静脉丛充血，用镊子快速摘取眼球，眼眶内流出血液，即收集入EP管中，随后固定小鼠头部，右手抓住鼠尾靠近小鼠身体的地方向后上方牵拉，立即造成颈椎脱臼所致死亡，立即摘取肾组织。留取血液标本后，静置30分钟，离心20分钟(3,000rpm)。分装上层血清，采用BS-240全自动生化仪检测血清肌酐，尿素氮等生化指标。剩余标本于-80℃冰箱保存。检测试剂均保存于4℃冰箱。
2)肾组织的收集
用组织剪分别取下小鼠两个肾脏，将肾蒂及包膜组织去除干净，予锋利刀片将肾脏纵行切开。其中取一半肾组织予以10％中性福尔马林溶液固定24～48小时，用于行HE、TUNEL染色(后续实验)等；一半肾组织放于2.5％的戊二醛固定液中，用于透射电镜观察(后续实验)，余下肾组织放入加满OCT冰冻切片包埋剂的组织包埋盒中，随之置于液氮表面，当该切片剂由液态变成白色固态后，予以锡箔纸将组织包裹并标记，置于-80℃冰箱中，待后期行免疫组化染色等。剩余的两个半肾组织的皮质部，分别置于1.5mL规格的干燥EP管中，-80℃冰箱保存，用于分子生物学检测等。
4、免疫印迹法(Western blot，WB)检测目的蛋白的表达水平
4.1组织蛋白的提取
(1)配制好的蛋白裂解液置于冰上；
(2)研磨棒、研钵洗净并干燥后，加入液氮预冷；
(3)从-80℃冰箱中取出各组冰冻肾脏组织，快速置于液氮中，在研钵中倒入少许液氮后，研磨棒充分研磨肾组织；
(4)将0.1μL蛋白酶抑制剂及100μL细胞裂解液混匀，加入上步沉淀中；
(5)匀浆器中充分匀浆，30分钟后将裂解液转移至离心管中；
(6)低温(4℃)下，调离心机转速至13,000rpm(离心15分钟)，将上清蛋白悬液置于新的EP管中，配制3个浓度梯度的样品，置于-80℃冰箱备用。
4.2组织、细胞目的蛋白浓度测定
(1)根据试剂盒使用说明，准备蛋白标准品，先配置成适量的BCA工作液(A液：B液＝50:1)，冰上预冷；
(2)每个样品分别取10μL，双蒸水稀释10～20倍，混匀置于冰上，按说明书配置蛋白标准品：所需浓度为0.5mg/mL的标准品，剩余的置于-20℃冰箱储存；
(3)取上述稀释过的蛋白样品及标准蛋白20μL，分别加入96孔板内；
(4)200μLBCA液加入干净96孔板中，顺序加入25μL蛋白标准品或稀释后的待测样品，37℃，震荡反应30分钟；
(5)酶标仪检测，根据标准样品及OD值绘制标准曲线，由待测样品OD值算出待测蛋白浓度；
(6)在蛋白样品中按比例加入5×loading buffer的样品缓冲液，用1×loadingbuffer配平，使其达到工作浓度(1×)，水浴10分钟(100℃)，予以50μL/管分装，置于-80℃冰箱待用。
4.3聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳
(1)双蒸水冲洗干净制胶用的短玻片和长玻片，将短、长玻片对齐，并用制胶夹卡紧；
(2)配制分离胶和浓缩胶，将现配的15％分离胶快速灌入玻璃槽中，避免气泡，室温下静置20～30分钟；
(3)待下层胶凝固后，弃上层，将现配的5％浓缩胶灌入玻璃板中，根据需要迅速插入有孔梳子(10孔或15孔)，室温静置20～30分钟；
(4)将胶连同玻板安装于电泳槽内，并在内部加满电泳缓冲液，两只手同时向上拔掉浓缩胶内梳子；
(5)根据需要量用移液枪上样，10～20μL/孔；初始电压：80伏，电泳约30分钟；
(6)待蛋白样品泳动至分离胶，即可见不同颜色的条带，电压调整为120伏(1～2小时)，至溴酚蓝刚达胶底部时终止电泳；
(7)待蛋白样品跑至胶底，关闭电源并取下凝胶，根据需要裁剪凝胶以备转膜。
4.4转膜
(1)PVDF膜用甲醇侵泡10秒，后同滤纸一起侵入预冷的缓冲液中；
(2)电泳结束后，双蒸水冲掉电泳缓冲液，放入转膜缓冲液中，平衡10分钟×2次；
(3)根据目的蛋白分子量切胶，依次放置：转膜夹黑色面，海绵，滤纸，凝胶PVDF膜，滤纸，海绵-转膜夹白色面；
(4)按正负极对应插入转膜电泳槽，再加入转膜缓冲液至槽上标记处；
(5)接通电源，根据蛋白量的大小，来决定转膜所需的电压和时间。
4.5封闭
转膜完成后，取出PVDF膜，TBS-T溶液洗涤约5分钟，加入封闭液，室温封闭1小时。
4.6一抗孵育
封闭完成后，离心管回收封闭液，放于4℃冰箱保存，用TBS缓冲液清洗PVDF膜5分钟×3次，用镊子夹取1mL TBST PVDF膜，然后在抗体孵育盒加入一抗(按一抗说明书配制一抗)，置4℃冰箱过夜。
4.7二抗孵育
将一抗连同条带室温下复温约半个小时，回收一抗，TBST缓冲液洗膜5分钟(3次)，配制相应的二抗并加入，室温孵育1小时。
4.8显影曝光
避光下配置所需高敏显影混合液，现配现用，采用自动曝光模式曝光并保存曝光图片。
4.9计算分析
测定蛋白条带的灰度值，使用Image J分析软件，导入Excel 2007软件进行数据处理及统计分析。
5、肾组织的形态学观察
5.1肾组织蜡块准备
(1)10％中性福尔马林固定的小鼠肾组织，4℃过夜，PBS浸洗30分钟×3次；
(2)脱水：取固定后样品，放置于50％、70％、85％、95％乙醇溶液中各60～120分钟，然后放于100％乙醇溶液30～60分钟×2次；
(3)透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱腊各20～30分钟；
(4)渗透：温度62℃，50％石蜡与50％二甲苯中放置90分钟，依次于石蜡Ⅰ(温度50～52℃)、石蜡Ⅱ(温度60～62℃)、石蜡III(温度60～62℃)各约60分钟；
(5)包埋：放置于石蜡包埋机中，予以包埋备用；
(6)切片：将石蜡包埋块切片，随后置于烘片机上烘烤1小时，以防止脱片。
5.2肾组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色
(1)将石蜡切片依次放入二甲苯脱腊，每次5分钟×3次，依次予以100％乙醇，95％乙醇I，95％乙醇II，80％乙醇，每次浸洗1分钟，自来水冲洗3～5分钟；
(2)PBS浸洗5分钟×3次，滴加苏木素100μL，染色10分钟；
(3)75％盐酸乙醇分化数秒；
(4)自来水流动水冲洗约10分钟至细胞核呈蓝色；
(5)双蒸水冲洗组织切片15分钟，滴加0.5％伊红染色剂，约1分钟；
(6)蒸馏水冲洗1-2秒，梯度酒精脱水(80％乙醇5秒，95％乙醇2分钟，无水乙醇2分钟)；
(7)自来水冲洗约10分钟至细胞核呈蓝色；
(8)二甲苯透明，封片。
光学显微镜下观察，放大400倍，每张切片随机选择10个视野下观察组织切片，以评估小鼠肾小管损伤程度。每组至少3个样本中随机选择两个切片，每张切片随机选择10个皮质区，使用Image J软件计算损伤肾小管所占比例来评估肾小管损伤程度，小管组织损伤评分分为0～4级，具体如下：
0分：正常或微量肾小管细胞肿胀或空泡变性；
1分：肾小管上皮细胞出现较明显的空泡变性，细胞肿胀，坏死脱落等病变，损伤比例小于25％；
2分：小管损伤病变比例占25％～50％；
3分：小管损伤病变比例占50％～75％；
4分：小管损伤病变比例大于或等于75％。
6、统计学分析
采用SPSS 22.0统计分析软件对数据统计分析。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较使用one-way ANOVA检验(Tukey’s multiplecormparisons test)，P<0.05认为差异有统计学意义。
所有统计结果均使用GraphPadPrism 6.0软件作图。
三、实验结果
RT-qPCR及WB结果所示：BMS309403显著抑制CLP诱导脓毒血症AKI中FABP4表达水平的升高(图1、图2)；如图3、图4所示，BMS309403显著抑制CLP诱导脓毒血症AKI中血清Scr、BUN及肾组织NGAL、KIM1 mRNA水平的升高；如图5所示，HE染色结果显示BMS309403显著改善CLP术后肾脏病理损伤。以上结果提示，BMS309403抑制FABP4可改善脓毒血症AKI。
综上，BMS309403可以通过抑制FABP4进而改善脓毒血症AKI，因而具备开发成治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。