检测VKORC1基因rs9923231位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
阅读说明：本技术 检测VKORC1基因rs9923231位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒 (Artificial mimic nucleic acid molecular beacon and kit for detecting rs9923231 site polymorphism of VKORC1 gene ) 是由 葛猛 潘世让 余倩 杜柏均 王宏伟 于 2019-02-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用VKORC1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增VKORC1基因片段,同时在VKORC1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计VKORC1基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3-FAM和SEQ4-VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法不仅准确率高,而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点,非常适合于在临床中大规模开展。(The invention discloses a typing detection method and a kit for rs9923231 site polymorphism of VKORC1 gene. The invention adopts primers SEQ1 and SEQ2 specific to VKORC1 gene to amplify a VKORC1 gene fragment, and designs VKORC1 gene specific artificial simulated nucleic acid molecular beacons SEQ3-FAM and SEQ4-VIC in an amplification region defined by the primers specific to the VKORC1 gene. The method for judging rs9923231 site polymorphism of VKORC1 gene based on gene specificity PCR combined with artificial simulated nucleic acid molecular beacon provided by the invention not only has high accuracy, but also has the advantages of high detection speed, simple operation, objective result interpretation, less closed tube reaction pollution and the like, and is very suitable for large-scale clinical development.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
背景技术
深静脉血栓形成（DVT）是在深静脉中形成的血凝块，常见于股静脉或腘静脉等大静脉中。常见表现为相关部位的疼痛、肿胀、发热。血凝块可以转移到肺部，形成肺栓塞。DVT形成的因素包括手术、创伤、癌症、肥胖、吸烟、激素分娩控制、抗磷脂综合征和遗传病等。随着年龄的增长，其发病率逐渐增加。
目前，抗凝血（血液稀释剂）治疗DVT是普遍采用的方法。典型的药物包括低分子量的肝素、华法林、香豆素或直接口服抗凝剂。其中，华法林是广泛使用的第一代抗凝血剂，常用于治疗血栓，预防中风。然而患者对华法林的治疗反应却受到不同因素的影响，如年龄、性别、维生素K摄入量和药物剂量。此外，某些基因缺陷的个体会出现治疗反应不良，在临床实践中会导致内出血和中风。全基因组关联研究证实，某些基因与华法林药物代谢相关，它们与环境等其它因素相互作用，共同影响华法林治疗的给药剂量。
维生素K环氧还原酶复合物1（VKORC1）是内质网的一种小跨膜蛋白，在维生素K途径中起主要作用，是华法林的靶蛋白。VKORC1基因非编码突变的存在导致蛋白的差异表达，决定了患者的药物剂量。已发现VKORC1的rs9923231(G/A)是华法林剂量相关的重要标签。A为低剂量高度敏感型，G为高剂量不敏感型。对该位点进行检测是针对不同患者治疗的重要依据。
目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成 非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。
分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。
针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。
除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。