检测GNB3基因rs5443位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
阅读说明：本技术 检测GNB3基因rs5443位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒 (Artificial mimic nucleic acid molecular beacon and kit for detecting rs5443 site polymorphism of GNB3 gene ) 是由 葛猛 潘世让 杜柏均 余倩 王宏伟 于 2019-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种GNB3基因rs5443位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用GNB3基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增GNB3基因片段,同时在GNB3基因特异性的引物界定的扩增区域内设计GNB3基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3-FAM和SEQ4-VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断GNB3基因rs5443位点多态性的方法不仅准确率高,而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点,非常适合于在临床中大规模开展。(The invention discloses a method and a kit for detecting rs5443 site polymorphism of a GNB3 gene by typing. The invention adopts GNB3 gene specific primers SEQ1 and SEQ2 to amplify a GNB3 gene fragment, and simultaneously designs GNB3 gene specific artificial simulated nucleic acid molecular beacons SEQ3-FAM and SEQ4-VIC in an amplification region defined by the GNB3 gene specific primer. The method for judging the rs5443 site polymorphism of the GNB3 gene based on the gene specificity PCR combined with the artificial simulated nucleic acid molecular beacon, provided by the invention, has the advantages of high accuracy, high detection speed, simplicity in operation, objective result interpretation, less closed-tube reaction pollution and the like, and is very suitable for large-scale clinical development.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GNB3基因rs5443位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
背景技术
重度抑郁症（MD），简称抑郁症，是一种精神疾病，其特征表现为在至少两周时间内的大多数情况下情绪低沉。它经常伴随着自尊心较低，对正常生活失去兴趣，没有活力，不明原因的痛苦等现象。患者可能偶尔也会有异于常人的虚假念想。有些人在抑郁期内表现不明显，而有些人则有一定的症状。重度抑郁症可能会对个人的生活、工作、教育以及睡眠、饮食习惯和身体健康产生负面影响。2%~8%的重度抑郁症患者死于自杀，约50%自杀的人患有抑郁症或其它情绪障碍。
重度抑郁症发病率在全球人口中占3%，受影响的人群从日本的7%到法国的21%不等。与发展中国家相比，该病在发达国家的存在率更高。最常见的发病年龄为20~30岁，且女性受影响的程度是男性的两倍。
目前人们普遍认为抑郁症的产生是遗传、环境和心理因素综合作用的结果。患病的风险因素包括患病家族史，主要的生活发生变化，滥用药物及慢性健康问题。约40%的患病风险与遗传因素有关，遗传—环境相互作用对疾病的发展起着重要作用。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）是通过cAMP途径的细胞反应的关键调节剂。G蛋白异常的表达和功能与多种精神疾病的病理生理学密切相关，包括重症抑郁症。G蛋白含有多个亚基，每个亚基由几个异构型编码。位于染色体12p13.31上的GNB3基因编码G蛋白β3亚基，其功能多态性位点rs5443（C/T）与增加信号转导及离子转运活性，重度抑郁症的风险和抗抑郁治疗反应有关。CC基因型的个体仅在暴露于高度的负面事件时对MD敏感，而CT型和TT型个体在暴露于低度负面事件时对MD敏感。因此，对rs5443位点进行分型检测可对MD的预防及治疗提供指导。
目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。
分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。
针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。
除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。