Baz2b基因作为靶点在缓解衰老中的应用
阅读说明：本技术 Baz2b基因作为靶点在缓解衰老中的应用 (Application of Baz2b gene as target in relieving senescence ) 是由 蔡时青 袁洁 常思源 刘至洋 于 2019-01-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及Baz2b基因作为靶点在缓解衰老中的应用。本发明揭示了Baz2b基因对正常衰老和衰老相关疾病的发生和发展有着重要的调控作用,其下调能够显著地缓解衰老以及改善衰老过程中的记忆退化、行为能力退化等。因此,Baz2b可作为衰老及衰老相关疾病的研究靶点,开发抑制或延缓衰老的药物,以及作为衰老及衰老相关疾病的诊断、预后评估标志物。(The invention relates to application of Baz2b gene as a target point in senescence alleviation. The invention discloses that the Baz2b gene has important regulation and control effects on normal aging and the occurrence and development of aging-related diseases, and the down regulation of the gene can obviously relieve aging and improve memory deterioration, behavior deterioration and the like in the aging process. Therefore, Baz2b can be used as a research target of aging and aging-related diseases, and can be used for developing drugs for inhibiting or delaying aging, and can be used as a diagnostic and prognostic evaluation marker of aging and aging-related diseases.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及Baz2b基因作为靶点在缓解衰老中的应用。
背景技术
当今社会人口老龄化日益严重，世界健康组织的报告显示到2050年发展中国家将会有三分之一的人口超过60岁。衰老过程中生物体的各种生理功能逐渐降低，如认知能力、运动能力的衰退，睡眠和节律的紊乱等(Bishop et al.,2010；Satoh et al.,2017)；这将严重影响老年人的生活质量，也给社会带来严重负担。此外，衰老是阿尔兹海默症等神经退行性疾病发生的最主要风险因素(Lopez-Otin et al.,2013)。因此，研究正常衰老过程中行为退化的机制以及寻找缓解衰老及其相关功能退化的方法将显得非常迫切。
全基因组基因表达研究结果揭示，在大脑衰老过程中许多基因的表达水平有明显改变。其中表达水平上调的基因主要是参与压力应激、抗氧化和DNA修复等功能的基因；表达水平上调的基因主要参与调控突触可塑性、囊泡运输和线粒体功能等(Lu et al.,2004)。在衰老过程中这种基因表达水平变化模式在各物种中是非常保守的(Bishop etal.,2010；Yeoman et al.,2012)，而且它们可能是衰老过程中生物体行为和认知功能退化的潜在原因；但是衰老过程这种基因表达水平变化的调控机制研究的很不清楚。
环境因素很大程度影响正常和病理性大脑衰老过程。表观遗传调控因子是环境因素和细胞信号通路之间的联系分子，有许多研究发现表观遗传分子可以调控线虫、果蝇等模式动物的寿命长短(Dang et al.,2014；Greer et al.,2010；Imai and Guarente,2014；Jin et al.,2011；Sen et al.,2016)。在衰老过程中包括DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传修饰出现明显的变化(Akbarian et al.,2013；Delgado-Morales and Esteller,2017)。大脑衰老过程中基因表达水平变化有可能是由于表观遗传修饰改变所导致的，但是其具体调节机制以及这些基因的表达变化如何导致行为退化大机制并不清楚。
综上，本领域迫切需要确定与衰老机制密切相关的基因，以期基于此为靶点，找到调节、缓解衰老的有用的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供Baz2b基因作为靶点在缓解衰老中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的用途，用于制备改善衰老或防治衰老相关疾病的组合物。
在一个优选例中，所述的下调剂选自：
特异性敲除Baz2b编码基因的基因编辑试剂；
特异性干扰Baz2b编码基因表达的干扰分子；
特异性抑制Baz2b蛋白或其编码基因的小分子化合物；或
特异性与Baz2b蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中，所述的下调剂是特异性敲除Baz2b编码基因的基因编辑试剂，该基因编辑试剂识别Baz2b编码基因并敲除该基因，或能表达或形成所述基因编辑试剂的构建物；较佳地，该基因编辑试剂包括选自下组的sgRNA：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2。
在另一优选例中，所述的干扰分子是以Baz2b编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的小干扰RNA、反义核酸、微小RNA、dsRNA，或能表达或形成所述小干扰RNA、反义核酸、微小RNA、dsRNA的构建物；较佳地，该干扰分子是shRNA，包括SEQ ID NO:3的序列。
在另一优选例中，所述的衰老相关疾病包括：记忆衰退，认知能力下降，行为能力退化，年龄依赖性体重增加，线粒体功能下降，神经退行性疾病(特别是衰老相关神经退行性疾病)；较佳地，所述的神经退行性疾病包括：阿尔茨海默症(AD)。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：提高线粒体功能相关基因的表达水平；提高神经元的ATP水平；提高细胞的基础氧呼吸；提高细胞FCCP诱导的最大氧呼吸值。
在本发明的另一方面，提供一种筛选改善衰老或防治衰老相关疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理存在Baz2b蛋白或其编码基因的体系；和(2)检测所述体系中Baz2b蛋白或其编码基因的表达或活性(包括但不限于Baz2b蛋白的表达和活性，Baz2b编码基因的转录、翻译情况)；其中，若所述候选物质可降低Baz2b蛋白或其编码基因的表达或活性，则表明该候选物质是改善衰老或防治衰老相关疾病的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在Baz2b蛋白或其编码基因的体系中；步骤(2)包括：检测测试组的体系中Baz2b蛋白或其编码基因的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达Baz2b蛋白或其编码基因的体系；如果测试组中Baz2b蛋白或其编码基因的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是改善衰老的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达Baz2b的细胞或细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的统计学上低于优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对Baz2b蛋白或其编码基因设计的小分子化合物，针对Baz2b蛋白或其编码基因所参与的信号通路或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善衰老或防治衰老相关疾病有用的物质。
在本发明的另一方面，提供一种用于改善衰老或防治衰老相关疾病的药物组合物，所述的药物组合物中包括：Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
在一个优选例中，所述的下调剂是特异性敲除Baz2b编码基因的基因编辑试剂，该基因编辑试剂识别Baz2b编码基因并敲除该基因，或能表达或形成所述基因编辑试剂的构建物；更佳地，该基因编辑试剂包括选自下组的sgRNA：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；或所述的下调剂是干扰分子shRNA，其包括SEQ ID NO:3的序列。
在本发明的另一方面，提供一种用于改善衰老或防治衰老相关疾病的药盒，所述的药盒中包括所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种特异性识别Baz2b蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备对衰老或衰老相关疾病进行诊断或预后评估的试剂或试剂盒。
在一个优选例中，所述的特异性识别Baz2b蛋白或其编码基因的试剂选自：特异性扩增Baz2b蛋白的编码基因的引物；特异性识别Baz2b蛋白的编码基因的探针；或特异性结合Baz2b蛋白的抗体或配体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、衰老过程中Baz2b表达水平变化以及与AD疾病进程的关系。
A，Baz2b表达量在衰老过程中逐渐增加。左边图数据来源于人类大脑基因表达的数据库GSE1572，右边图来源于数据库GSE44772。
B，与同年龄段的正常老年人相比，AD病人前额叶皮层中Baz2b表达量明显增加，数据来源于数据库GSE5281。
C和D，Baz2b表达量与晚发型AD疾病进程如Braakst stage和前皮层萎缩的程度呈显著的正相关关系。显著性以***P<0.001(unpaired Student’s t-test)表示。
图2、Baz2b敲除可以减缓小鼠随着年龄依赖性体重增加现象。
A，Baz2b敲除杂合、纯合和野生型小鼠在年轻和年老阶段的典型图片。
B，统计分析Baz2b敲除杂合、纯合和野生型小鼠在年轻(2.5个月左右)和年老(19个月左右)阶段的体重。显著性以*P<0.05(one-way ANOVA Dunnett’s test)表示。
图3、Baz2b敲除可以提高年老小鼠的空间学习记忆能力。
A，Barnes maze实验检测年老小鼠(18至24个月)的空间学习记忆能力示意图，红色为目标洞。
B，统计分析连续四天的训练中各基因型小鼠找到目标洞所需的时间。
C，统计分析各基因型小鼠在5天的探索实验中首次找到目标洞所需的时间。
D，统计分析各基因型小鼠在5天的探索实验中对目标洞的探索次数。显著性以*P<0.05(one-way ANOVA Dunnett’s test)表示。
图4、Baz2b调控小鼠神经元的线粒体功能。
A，染色质免疫共沉淀定量PCR方法检测Baz2b能够结合到线粒体功能相关基因的启动子区。实验使用过表达Baz2b-Flag的HEK293T细胞。
B，在体外培养的小鼠小脑神经元中降低Baz2b表达可以提高线粒体功能相关基因的表达水平。
C，降低Baz2b表达可以提高小鼠小脑神经元的ATP水平。
D，降低Baz2b表达可以提高小鼠小脑神经元的基础氧呼吸和FCCP诱导的最大氧呼吸值。
E，在体外培养的小鼠皮层神经元中过表达Baz2b会降低神经元的ATP水平。
F，在体外培养的小鼠皮层神经元中过表达Baz2b会降低神经元的基础氧呼吸和FCCP诱导的最大氧呼吸值。显著性以*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(Student’s T tests)表示。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了溴区结构域相邻锌指域蛋白2b基因(Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 2B，Baz2b)对正常衰老和衰老相关疾病的发生和发展有着重要的调控作用，并且Baz2b基因的下调能够显著地缓解衰老以及改善衰老过程中的记忆退化、行为能力退化。因此，Baz2b可作为衰老及衰老相关疾病的研究靶点，开发抑制或延缓衰老的药物，以及作为衰老及衰老相关疾病的诊断、预后评估标志物。
Baz2b蛋白及其编码基因
本领域中目前关于Baz2b蛋白的具体功能并不清楚。Baz2b蛋白包含DNA结合结构域、PHD锌指结构域和可以结合乙酰化组蛋白的BROMO结构域，这些结构域功能暗示Baz2b可能发挥表观遗传调控作用。有研究报道其同源蛋白BAZ2A是染色质重塑复合物的组分，这个复合物可以结合到DNA、发挥抑制转录的作用。
在本发明中，术语“Baz2b蛋白”指具有SEQ ID NO:4(人)或SEQ ID NO:5(鼠)所示序列的蛋白(它们的基因序列分别见GenBank NM_013450(人)，GenBank NM_001001182(鼠))。该术语还包括具有与Baz2b蛋白相同功能的序列的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Baz2b蛋白的活性片段和活性衍生物。
编码Baz2b蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。Baz2b蛋白在哺乳动物中高度保守，其鼠源蛋白与人源蛋白的序列相同性高。
通过分析人类大脑基因表达的数据库，本发明人发现，Baz2b基因在大脑前皮层的表达水平随着衰老逐渐增加。进一步地，分析同年龄段的AD(Alzheimer’s Disease)病人和正常老年人前额叶皮层中基因表达数据库，发现Baz2b基因表达量在AD病人中进一步增加；而且Baz2b的表达水平与晚发型AD的疾病进程如Braakst stage和前皮层萎缩的程度呈显著的正相关关系。在衰老过程中野生型小鼠的体重随年龄逐渐增加，Baz2b敲除的小鼠在年老阶段的体重要明显低于野生型小鼠，但是在年轻阶段Baz2b敲除和野生型小鼠的体重相差不大；此外敲除Baz2b能够明显提高老年小鼠的空间学习记忆能力。机制研究发现Baz2b能够结合到线粒体功能相关基因的启动子区域并调控这些基因的表达，进而调节神经元的线粒体功能。这些结果揭示，Baz2b在正常和病理性大脑衰老过程中起到重要作用，Baz2b可以作为靶点开发相应的药物和手段应用于促进生物体的健康衰老。
Baz2b下调剂及其应用
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的用途，用于制备改善衰老或防治衰老相关疾病的药物组合物。所述的衰老相关疾病包括但不限于：记忆衰退，认知能力下降，行为能力退化，年龄依赖性体重增加，线粒体功能下降，神经退行性疾病(特别是衰老相关神经退行性疾病)，糖尿病和癌症等。
如本文所用，所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。
所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低Baz2b蛋白的活性、降低Baz2b蛋白或其编码基因的稳定性、下调Baz2b蛋白的表达、减少Baz2b蛋白有效作用时间、或抑制Baz2b基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Baz2b有用的物质，从而可用于改善衰老或防治衰老相关疾病。例如，所述的下调剂是：特异性干扰Baz2b基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与Baz2b基因编码的蛋白结合的抗体或配体，等等。
作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂可以是针对Baz2b的小分子化合物。本领域技术人员可以采用本领域的常规筛选方法，来进行这类小分子化合物的筛选。
作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂可以是Baz2b特异性的干扰RNA分子(shRNA)，本发明人可以理解到，根据本发明中提供的Baz2b基因序列，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的一种优选方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除Baz2b基因。常见的敲除Baz2b基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9mRNA。特别优选地，所述基因编辑试剂是选自下组的sgRNA：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，其靶向性非常好，经实施例验证，其对于衰老的缓解作用非常显著。
衰老相关疾病的诊断及预后评估中的应用
本发明中，揭示了对正常衰老和AD疾病的发生和发展有着重要的调控作用，例如，实施例中证明，Baz2b的表达量与晚发型AD疾病进程如Braakst stage和前皮层萎缩的程度呈显著的正相关关系。
基于本发明人的上述新发现，可以将Baz2b作为衰老相关疾病的诊断及预后评估的标志物：(i)进行衰老相关疾病的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的衰老相关疾病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出由Baz2b基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性地治疗。
可以通过判断待评估样本中Baz2b的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的衰老相关疾病预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个Baz2b的阈值，当Baz2b的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制Baz2b的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人细胞或组织中的Baz2b的表达情况与患者细胞或组织中的Baz2b的表达情况进行比较后，获得Baz2b表达异常的阈值。
因此，本发明提供了Baz2b蛋白或其编码基因的用途，用于制备衰老及衰老相关疾病的诊断或预后评估的试剂或试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测Baz2b基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测Baz2b蛋白或其编码基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增Baz2b的引物；或特异性识别Baz2b的探针来确定Baz2b基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合Baz2b编码的蛋白的抗体或配体来确定Baz2b蛋白的表达情况。
针对Baz2b基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与Baz2b基因上特定位点发生特异性结合，而不与Baz2b基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
利用特异性结合Baz2b蛋白的抗体来检测分析物中Baz2b蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
本发明还提供了用于在分析物中检测Baz2b基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增Baz2b基因的引物；特异性识别Baz2b基因的探针；或特异性结合Baz2b基因编码的蛋白的抗体或配体。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
药物筛选
在得知了Baz2b的过表达与衰老及衰老相关性疾病的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制Baz2b蛋白或其编码基因的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于改善衰老或防治衰老相关疾病真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选改善衰老或防治衰老相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达Baz2b的体系；和检测所述体系中Baz2b的表达或活性；若所述候选物质可抑制Baz2b的表达或活性，则表明该候选物质是改善衰老或防治衰老相关疾病的潜在物质。所述的表达Baz2b的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达Baz2b的细胞；或可以是重组表达Baz2b的细胞。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Baz2b的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Baz2b的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于改善衰老或防治衰老相关疾病真正有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的改善衰老或防治衰老相关疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制Baz2b的表达和活性，进而改善衰老或防治衰老相关疾病有用的物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于改善衰老或防治衰老相关疾病的组合物，所述的组合物含有有效量的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的下调剂是特异性敲除Baz2b编码基因的基因编辑试剂，该基因编辑试剂识别Baz2b编码基因并敲除该基因，或能表达或形成所述基因编辑试剂的构建物。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将Baz2b的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Baz2b的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的Baz2b下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的Baz2b蛋白或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、CRISPR/Cas9方法构建Baz2b敲除小鼠
小鼠Baz2b基因有14个转录本，其中4个转录本编码蛋白，分别为2个长转录本和2个很短的转录本。2个长转录本编码蛋白完全相同，在起始密码子ATG所在的外显子区域设计sgRNA：
sgRNA1：ATCATCTTCTGCTCCTTCCGTGG(SEQ ID NO:1)；
sgRNA2：AGATGATGTTGGTGTAGTGGAGG(SEQ ID NO:2)；
将上述sgRNA(2条分别构建入该质粒)构建到HP180Cass9质粒，体外转录sgRNA(2条分别转录，1:1混合)和cas9mRNA，注射到小鼠受精卵获得F0代小鼠，利用PCR对F0代小鼠基因型，进而通过杂交获得基因型敲除纯合的小鼠。
2、染色质免疫沉淀
稳定表达Baz2b::3FLAG的HEK 293T细胞用于染色质免疫沉淀实验。收集一个100mm培养皿长满的HEK 293T细胞，加入1％甲醛固定，用包含10mM Tris-HCl，pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA，0.1％Na-Deoxycholate，0.5％N-lauroylsarcosine，0.2％SDS以及Protease inhibitor cocktail(Roche)的裂解液在冰上裂解细胞，然后使用bioruptor超声破碎仪打断基因组DNA。超声后离心上清样品用anti Flag(sigma F3165)抗体和对应种属的IgG以及蛋白A/G琼脂糖珠进行免疫沉淀。用蛋白酶K消化和去交联之后的DNA使用乙醇沉淀法抽提纯化之后用于qPCR检测。
3、小鼠原代神经元培养
分离年龄为E13.5的C57小鼠皮层神经元，首先在1x HBSS(Thermo14175095)缓冲液中将小鼠皮层组织解剖出来，用2mg/ml Papain(Worthington LS003119)37℃消化10min。去除消化液加入含10％胎牛血清1％P/S的DMEM培养基终止消化反应，用枪轻轻吹散组织为单个细胞；之后用40μm网筛过滤细胞悬液，1000rpm离心5min。用PM培养基(Neurobasal，2％B27supplement，1％Glutamax，1％Penicillin-streptomycin，5％FBS)重悬，进行细胞计数之后，取所需细胞量进行细胞电转、导入相应的表达质粒。细胞核转染之后按合适密度接种到铺有PDL和Laminin的培养板中培养，24h之后更换一半的培养基为无血清培养基(Neurobasal，2％B27Supplement，1％Glutamax，1％Penicillin-streptomycin)。
4、ATP水平检测
每次需要约6x 105个原代培养的小鼠神经元进行ATP水平检测。首先用1x PBS清洗一次贴壁培养的细胞，加入300μl裂解液(10mM Tris，1mM EDTA，0.5％Triton-X100)于冰上裂解5min。吹打均匀转移到1.5ml EP管，置于4℃继续裂解10min，2000g，4℃离心10min。从上清中取出75μl用BCA法检测蛋白浓度，取40μl稀释10倍用CellTiter-Glo(PromegaG7570)试剂盒检测ATP水平。通过将ATP含量相对蛋白含量的比值用于分析不同处理组细胞的ATP水平。
5、小鼠行为实验
通过Barnes maze实验检测老年小鼠的空间学习记忆能力，实验用小鼠年龄为24个月左右，不同基因型的小鼠来着同窝培养。首先连续四天训练小鼠找到目标洞，每天训练4次，每次间隔15分钟；第五天检测小鼠寻找目标洞的能力来反应其空间学习记忆能力，统计分析小鼠首次找到目标洞所需的时间和目标洞探索次数。行为实验为双盲实验，符合实验动物伦理。
II.实施例
实施例1、Baz2b基因的表达情况
Baz2b基因表达范围非常广泛，在骨髓、肺和大脑等组织中都有表达。通过分析人类大脑基因表达的数据库GSE1572和GSE44772，本发明人发现在大脑前皮层中Baz2b基因的表达水平随着年龄逐渐增加(图1A)。
进一步分析AD病人和正常老年人前额叶皮层中基因表达数据库，发现Baz2b基因表达量在AD病人中相对于同年龄段的正常老年人有明显增加(图1B)。
通过分析Baz2b基因在AD疾病发展过程中的表达变化情况，结果显示Baz2b的表达量与晚发型AD疾病进程如Braakst stage和前皮层萎缩的程度呈显著的正相关关系(图1C，D)。
这些结果提示，Baz2b对正常衰老和AD疾病的发生和发展有着重要的调控作用。同时，这些结果也说明，可以以Baz2b为靶点，针对衰老或衰老相关疾病进行诊断和预后评估。
实施例2、Baz2b敲除可提高衰老动物的学习能力
为了探究Baz2b基因在衰老中的调控作用，本发明人利用CRISPR/Cas9方法构建Baz2b敲除小鼠。
为了进行行为分析，通过Baz2b敲除的杂合小鼠进行繁育获得同窝的Baz2b敲除的杂合、纯合和野生型小鼠。
分析Baz2b敲除的杂合、纯合和野生型小鼠随着年龄的增加，在衰老过程中的表现。结果发现，野生型小鼠会出现年龄依赖性体重增加，在年轻阶段Baz2b敲除杂合、纯合和野生型小鼠的体重相差不大(图2A，B)，但是在年老阶段Baz2b敲除小鼠的体重要明显低于野生型小鼠(图2A，B)。
通过Barnes maze实验检测老年小鼠的空间学习记忆能力，在连续4天的训练中Baz2b敲除小鼠与野生型小鼠相比用更少的时间找到目标洞(图3A，B)。在第5天的探索实验中Baz2b敲除小鼠可以更快速的找到目标洞(图3C)，以及对目标懂得探索次数更多(图3D)。
这些结果表明，Baz2b基因敲除可以提高老年小鼠的空间学习记忆能力。
实施例3、Baz2b发挥改善衰老过程中行为退化功能的机制研究
接下来探究Baz2b发挥改善衰老过程中行为退化功能的潜在机制。
由于Baz2b蛋白含有DNA结合结构域，本发明人通过染色质免疫共沉淀定量PCR方法检测其结合到哪些基因上。结果显示，Baz2b蛋白可以结合到线粒体功能相关基因的启动子区域(图4A)。
在小鼠的小脑原代神经元中用shRNA(5'-GGCTCTTTCTCCAAGTTAA-3'(SEQ ID NO:3))处理，结果发现，降低Baz2b的表达可以提高线粒体功能相关基因的表达水平(图4B)，进而提高神经元的ATP水平(图4C)、以及细胞的基础氧呼吸和FCCP诱导的最大氧呼吸值(图4D)。
由于Baz2b的表达量在大脑衰老过程中逐渐增加，通过电转方法在小鼠的皮层原代神经元中过表达Baz2b来模拟衰老过程并探究其作用。检测结果显示，Baz2b过表达能够显著降低小鼠皮层神经元的ATP水平已及细胞的氧呼吸水平(图4E，F)。
这些结果提示，Baz2b蛋白是通过结合线粒体功能相关基因并调控它们的表达、进而调节细胞的线粒体功能来调控衰老过程中的行为退化。
实施例4、药物筛选
设置：
测试组：小脑原代神经元细胞(其中内源表达Baz2b)，并给予候选物质；
对照组：小脑原代神经元细胞(其中内源表达Baz2b)，不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中Baz2b的表达情况，并进行比较。如果测试组中Baz2b的表达在统计学上低于(如低30％以上)对照组，则提示该候选物质是缓解衰老或防治衰老相关性疾病有用的试剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 单导向RNA(sgRNA)
<400> 1
atcatcttct gctccttccg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 单导向RNA(sgRNA)
<400> 2
agatgatgtt ggtgtagtgg agg 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 短发夹RNA(shRNA)
<400> 3
ggctctttct ccaagttaa 19
<210> 4
<211> 2168
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
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Lys Ser Ile Ala Trp Glu Lys Ser Ile Met Lys Val Tyr Cys Gln Ile
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Cys Arg Lys Gly Asp Asn Glu Glu Leu Leu Leu Leu Cys Asp Gly Cys
1940 1945 1950
Asp Lys Gly Cys His Thr Tyr Cys His Arg Pro Lys Ile Thr Thr Ile
1955 1960 1965
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1970 1975 1980
Gln Thr Leu Lys Ile Lys Lys Leu His Val Lys Gly Lys Lys Thr Asn
1985 1990 1995 2000
Glu Ser Lys Lys Gly Lys Lys Val Thr Leu Thr Gly Asp Thr Glu Asp
2005 2010 2015
Glu Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ser Ser Leu Lys Arg Gly Asn Lys Asp
2020 2025 2030
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2165
<210> 5
<211> 2123
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Met Glu Ser Gly Glu Leu Leu Pro Ser Ser Pro Ala Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Ser Ser Ser Ala Pro Ser Val Ala Ser Ala Val Ser Lys Ser
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Asp Arg Pro Arg Ala Arg Glu Glu Ser Arg Met Lys Arg Arg Lys Gly
770 775 780
Arg Pro Pro Asn Val Gly Ser Ala Glu Phe Leu Asp Asn Thr Asp Ala
785 790 795 800
Lys Leu Leu Arg Lys Leu Gln Ala Gln Glu Ile Ala Arg Gln Ala Ala
805 810 815
Gln Ile Lys Leu Leu Arg Lys Leu Gln Lys Gln Glu Gln Ala Arg Val
820 825 830
Ala Lys Glu Ala Lys Lys Gln Gln Ala Ile Met Ala Ala Glu Glu Lys
835 840 845
Arg Lys Gln Lys Glu Gln Met Lys Ile Ile Lys Gln Gln Glu Lys Ile
850 855 860
Lys Arg Ile Gln Gln Ile Arg Met Glu Lys Glu Leu Arg Ala Gln Gln
865 870 875 880
Ile Leu Glu Ala Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Ala Ala Asn Ala Lys
885 890 895
Leu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Thr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Arg Gln
900 905 910
Gln Ala Val Leu Leu Lys His Gln Glu Arg Glu Arg Arg Arg Gln His
915 920 925
Val Met Leu Met Lys Ala Met Glu Ala Arg Lys Lys Ala Glu Glu Lys
930 935 940
Glu Arg Leu Lys Gln Glu Lys Arg Asp Glu Lys Arg Leu Asn Lys Glu
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Arg Lys Leu Glu Gln Arg Arg Leu Glu Leu Glu Met Ala Lys Glu Leu
965 970 975
Lys Lys Pro Lys Glu Asp Met Cys Leu Ala Asp Gln Lys Pro Leu Pro
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Glu Trp Pro Arg Ile Pro Gly Leu Val Leu Ser Gly Thr Thr Phe Ser
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Asp Cys Leu Met Val Val Gln Phe Leu Arg Asn Phe Gly Lys Val Leu
1010 1015 1020
Gly Phe Asp Val Asn Ile Asp Val Pro Asn Leu Ser Val Leu Gln Glu
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Gly Leu Leu Asn Ile Gly Asp Ser Met Gly Glu Val Gln Asp Leu Leu
1045 1050 1055
Val Arg Leu Leu Ser Ala Ala Val Cys Asp Pro Gly Leu Ile Thr Gly
1060 1065 1070
Tyr Lys Ala Lys Thr Ala Leu Gly Glu His Leu Leu Asn Val Gly Val
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Asn Arg Asp Asn Val Ser Glu Val Leu Gln Ile Phe Met Glu Ala His
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Ala His Thr Pro Ala Gln Lys Ala Ser Ile Leu Ala Phe Leu Val Asn
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Glu Leu Ala Cys Ser Lys Ser Val Val Ser Glu Ile Asp Lys Asn Ile
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Glu Tyr Met Ser Asn Leu Arg Arg Asp Lys Trp Met Val Glu Gly Lys
1155 1160 1165
Leu Arg Lys Leu Arg Ile Ile His Ala Lys Lys Thr Gly Lys Arg Asp
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Ala Ser Gly Gly Ile Asp Leu Gly Glu Glu Gln His Pro Leu Gly Thr
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Pro Thr Pro Gly Arg Lys Arg Arg Arg Lys Gly Gly Asp Ser Asp Tyr
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Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Gln Ala Asp Glu Asp Glu
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Glu Asp Glu Glu Asp Lys Asp Asp Lys Lys Gly Lys Lys Thr Asp Ile
1235 1240 1245
Cys Glu Asp Glu Asp Glu Gly Asp Gln Thr Ala Ser Val Glu Glu Leu
1250 1255 1260
Glu Lys Gln Ile Glu Lys Leu Ser Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Arg Arg
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Lys Leu Phe Asp Ala Ser His Ser Leu Arg Ser Met Met Phe Gly Gln
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Asp Arg Tyr Arg Arg Arg Tyr Trp Ile Leu Pro Gln Cys Gly Gly Ile
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Phe Val Glu Gly Met Glu Ser Gly Glu Gly Leu Glu Glu Ile Ala Lys
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Glu Lys Glu Lys Leu Lys Lys Ala Glu Ser Leu Gln Ile Lys Glu Glu
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Val Phe Glu Thr Ser Ala Glu Thr Leu Asn Cys Ser Ile Arg Asp His
1345 1350 1355 1360
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Pro Leu Gly Ser Val Pro Ser Ala Thr Thr Ala Gln Ser Pro Val Gly
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Lys Thr Asp Ala Ser Leu Phe Ser Ser Gly Ser Gly Ser Cys Gly Lys
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Phe Tyr Ser Pro Leu Pro Asn Asp Gln Leu Leu Lys Thr Leu Thr Glu
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Lys Asn Arg Gln Trp Phe Ser Leu Leu Pro Lys Thr Pro Cys Asp Asp
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Thr Ser Leu Thr His Ala Asp Leu Ser Thr Thr Leu Val Thr Pro Gln
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Gly Pro Ser Ser Val Gln Ser Pro Pro Gly Leu Asn Pro Phe Ala Leu
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Glu Met Gln Phe Gly Trp Trp Arg Ile Ile Asp Pro Glu Asp Leu Lys
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Thr Leu Leu Lys Val Leu His Leu Arg Gly Ile Arg Glu Lys Ala Leu
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Gln Lys Gln Ile Gln Lys His Leu Asp Tyr Ile Thr Gln Ala Cys Val
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2115 2120